病毒传播和基于细胞的比色定量

摘要

本方案描述了寨卡病毒（ZIKV）在Vero非洲绿猴肾细胞中的繁殖，以及使用基于细胞的比色免疫检测方法以24孔和96孔（高通量）形式对ZIKV进行定量。

摘要

寨卡病毒（ZIKV）是一种蚊媒病毒，属于 黄病毒属。ZIKV感染与先天性脑部异常有关，并可能与成人的吉兰-巴雷综合征有关。研究寨卡病毒以了解疾病机制对于促进疫苗和治疗开发非常重要。在病毒学领域，量化病毒的方法至关重要。焦点形成测定 （FFA） 是一种病毒定量测定，它使用抗体检测病毒抗原并使用过氧化物酶免疫染色技术鉴定细胞的感染病灶。目前的研究描述了使用 24 孔和 96 孔（高通量）格式的病毒传播和定量方案。与其他类似研究相比，该协议进一步描述了病灶大小优化，可以作为扩大该测定对其他病毒使用范围的指南。首先，ZIKV在Vero细胞中繁殖3天。使用FFA收获并定量含有ZIKV的培养上清液。简而言之，将病毒培养物接种到Vero细胞上并孵育2-3天。然后，在优化的染色过程（包括细胞固定、透化、封闭、抗体结合和与过氧化物酶底物孵育）后确定病灶形成。使用体视显微镜（24孔格式的手动计数）或软件分析仪（96孔格式的自动计数）观察染色的病毒病灶。FFA 提供可重复的、相对较快的结果（3-4 天），适用于不同的病毒，包括非斑块形成病毒。随后，该方案可用于ZIKV感染的研究，并可用于检测其他临床上重要的病毒。

引言

寨卡病毒（ZIKV）感染是一种新出现的蚊媒病毒性疾病。1947 年在乌干达首次分离出 ZIKV ^1,2;从 1947 年到 2007 年，它仍然被忽视，因为临床症状最常见的是无症状的，其特征是自限性发热性疾病。2007 年，寨卡病毒流行始于雅浦群岛 ^3,4，随后于 2013 年至 2014 年在太平洋地区（法属波利尼西亚、复活节岛、库克群岛和新喀里多尼亚）发生更大规模的流行病 ^5,6,7,8，其中首次在成人中报告了严重的神经系统并发症吉兰-巴雷综合征 （GBS）⁹.在2015年和2016年期间，早在2013年巴西出现亚洲寨卡病毒基因型后，寨卡病毒首次大范围流行席卷美洲¹⁰。在这次疫情期间，新生儿中报告了44万至130万例小头畸形和其他神经系统疾病^病例11。目前尚无针对寨卡病毒感染的特异性治愈或治疗方法;因此，迫切需要能够预防感染的寨卡病毒疫苗，特别是在怀孕期间。

病毒定量是确定样品中存在的病毒数量的过程。它在研究中发挥着重要作用，学术实验室涉及许多领域，例如医学和生命科学。这一过程在商业领域也很重要，例如病毒疫苗、重组蛋白、病毒抗原或抗病毒药物的生产。许多方法或检测方法可用于病毒定量¹²。方法或检测方法的选择通常取决于病毒特征、所需的准确度以及实验或研究的性质。通常，定量病毒的方法可分为两类:检测病毒核酸（DNA或RNA）存在的分子测定和体外测量病毒感染性的测定¹²。定量聚合酶链反应（qPCR，用于DNA）或定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR，用于RNA）¹³和数字液滴PCR¹⁴是用于定量给定样品中病毒核酸的常用分子技术^的例子15。然而，这些高度灵敏的分子技术无法区分活病毒和非活病毒¹⁵。因此，使用上述分子技术无法完成需要生物学特征信息的研究，例如病毒对细胞的感染性;需要能够测量和确定活病毒存在的检测方法。测量病毒传染性的检测方法包括斑块形成试验 （PFA）、50% 组织培养感染剂量 （TCID50）、荧光焦点试验和透射电子显微镜 （TEM）¹²。

PFA 由 Renato Dulbecco 于 1952 年开发，是最常用的病毒滴定方法之一，包括 ZIKV¹⁶。它用于直接测定传染性裂解病毒粒子的病毒浓度。该方法基于裂解病毒在病毒感染后在接种的细胞单层中产生细胞病变效应（CPEs;细胞死亡区或斑块，被未感染细胞包围的感染区域）的能力。然而，该测定存在一些影响其效用的缺点。该检测非常耗时（大约需要 7-10 天，具体取决于病毒），依赖于 CPE，并且容易出错。在本研究中，我们报告了一种免疫比色技术，即焦点形成测定 （FFA），用于检测和定量 24 孔板和 96 孔板形式的 ZIKV。

研究方案

1. 病毒传播

1. 细胞制备
   1. 在含有 12 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 的 75 cm² 细胞培养瓶中培养 Vero 细胞，补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 2 mM L-谷氨酰胺（参见 材料表）。在37°C的细胞培养箱中用5%CO₂孵育细胞。
   2. 在显微镜下监测细胞;一旦细胞达到70%-90%的汇合度，它们就可以使用了（图1A）。
      注意:Vero细胞大约每24小时翻一番¹⁷。1:10 的稀释度需要 3 到 4 天才能在 75 cm² 烧瓶中达到 80%-90% 的汇合度。每天或每隔一天监测细胞。
2. 细胞单层感染
   1. 使用 10 mL 血清移液管从细胞培养瓶中取出生长培养基。使用 5 mL 血清移液管用 3 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （dPBS） 冲洗烧瓶 2 次。
      注意: 必须准备一个装有 10% 次氯酸钠的烧杯，以对烧瓶/板中丢弃的任何感染性液体废物进行消毒。
   2. 将 2 mL 无血清 DMEM（补充有 2 mM L-谷氨酰胺不含 FBS 的 DMEM）和 20 μL ZIKV 接种物加入细胞培养瓶中。在室温下轻轻摇晃孵育烧瓶1小时，以使病毒吸附。
      注意:初始ZIKV原液的滴定将有助于确定ZIKV接种物添加量（步骤2）。
      注意:寨卡病毒被归类为生物安全2级（BSL-2）病原体。所有含有ZIKV材料的程序都必须在经过认证的生物安全柜中进行，并遵循所有实验室标准操作程序（SOP）和适当的个人防护设备。
3. 添加覆盖介质
   1. 孵育 1 小时后，使用 5 mL 血清移液管取出并弃弃稀释的病毒接种物。用 3 mL dPBS 2x 冲洗细胞培养瓶。
   2. 将 12 mL 维持培养基（补充有 2% FBS、2 mM L-谷氨酰胺和 100 U/mL 青霉素-链霉素的 DMEM）加入细胞培养瓶中以维持感染细胞。
   3. 将感染的Vero细胞在37°C的细胞培养箱中用5%CO₂孵育3天。
      注意:每天在显微镜下监测受感染的Vero细胞的CPE。
4. 收获含有ZIKV的细胞培养上清液
   1. 在感染后第 3 天，可以观察到细胞变圆和脱离 （CPE）（图 1B-D）。使用 10 mL 血清移液管将含有 ZIKV 的细胞培养上清液收获到 50 mL 离心管中。
   2. 使用0.22μm聚醚砜注射器过滤器（参见 材料表）过滤细胞培养上清液。将 500 μL 过滤的细胞培养上清液等分装到 2.0 mL 螺旋盖管中，并在 -80 °C 下储存直至进一步使用。
      注意:收获的ZIKV可以储存在-80°C下进行长期储存。
      注意: 如果使用注射器针头，必须采取额外的预防措施，因为针头会刺穿皮肤。需要建立实验室SOP。

2. 病毒定量

1. 细胞制备
   1. 将Vero细胞接种在指定的板中（24孔板:0.5mL/孔，7.5×10⁴ 个细胞/孔;96孔板:0.1mL/孔，1.5×10⁴ 个细胞/孔），并将板在37°C的细胞培养箱中用5%CO₂孵育过夜。
      注意:有五个不同的时间点要测试（24 孔板:感染后 48 小时、60 小时、72 小时、84 小时和 96 小时;96 孔板:感染后 24 小时、36 小时、48 小时、60 小时和 72 小时）;因此，为每个时间点准备一个盘子。
   2. 孵育24小时后，一旦细胞达到70%-90%的汇合度（图1E），板就可以进行感染了。在感染细胞单层之前继续制备稀释的病毒原液（步骤2.2）。
2. 病毒稀释
   1. 对于 24 孔板和 96 孔板，为每个板准备六个无菌 1.5 mL 微量离心管，以进行 10 倍稀释（^10-1 至 ^10-5），包括阴性对照。对于 24 孔板的实验设置，将 450 μL 无血清 DMEM 加入所有六个微量离心管中。对于 96 孔板的实验设置，将 135 μL 无血清 DMEM 加入 6 个试管中。
      注意: 在进行十倍连续稀释之前，清楚地标记每个试管以指示其内容物的稀释程度。
   2. 为了进行连续稀释，对于 24 孔板实验设置，将从步骤 1 收获的 50 μL ZIKV 原液加入含有 450 μL 无血清 DMEM 的 ^10-1 管中。对于 96 孔板实验设置，将 15 μL ZIKV 原液加入含有 135 μL 无血清 DMEM 的 ^10-1 管中。
   3. 涡旋每个试管以混合病毒和培养基。这是第一次十倍稀释。
      注意:需要在每个稀释管中正确混合病毒和培养基，以确保准确的连续稀释。
   4. 对于 24 孔板实验设置，使用新鲜的移液器吸头重悬 ^10-1 试管，并将 50 μL 稀释的 ZIKV 转移到 ^10-2 试管中作为第二次 10 倍稀释。对于 96 孔板实验设置，使用新鲜的移液器吸头重悬 ^10-1 管，并将 15 μL 稀释的 ZIKV 转移到 ^10-2 管中作为第二次十倍稀释。
   5. 重复步骤2.2.4四次，直到第五管（排除阴性对照）。
      注意:每个移液步骤后使用新鲜的移液器吸头，以避免交叉污染。
3. 细胞单层感染
   1. 从每个孔中取出并弃去条件培养基（24 孔板:0.5 mL/孔;96 孔板:0.1 mL/孔）。
   2. 用 dPBS 2x 冲洗每个孔（24 孔板:300 μL/孔;96 孔板:60 μL/孔）。
   3. 从最高到最低稀释度工作，将每个连续稀释的病毒接种物加入孔中（24孔板:200μL/孔;96孔板:40μL/孔）。
      注意:每次稀释的感染将在重复的孔中进行。保持两个未感染的孔作为阴性对照。清楚地标记板和孔，以避免混淆。在每个移液步骤后更换移液器吸头，以防止交叉污染。
   4. 在室温下轻轻摇晃孵育板1小时，以允许病毒吸附。
4. 添加覆盖细胞培养基
   1. 孵育1小时后，从最低浓度到最高浓度除去并弃去病毒悬浮液。
   2. 用dPBS 2x（24孔板:300μL/孔;96孔板:60μL/孔）洗涤感染细胞。
   3. 用DMEM（补充2%FBS、2mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素-链霉素）和1.5%低粘度羧甲基纤维素（CMC;见 材料表）（24孔板:1 mL/孔;96孔板:0.2 mL/孔）覆盖孔。
   4. 将板在37°C的细胞培养箱中用5%CO₂孵育。
      注意:在此孵育期间请勿打扰板。
   5. 从细胞培养箱中取出板在不同时间点进行染色（24孔板:感染后48小时，60小时，72小时，84小时和96小时;96孔板:感染后24小时，36小时，48小时，60小时和72小时）。

3. 染色

1. 细胞固定
   1. 在特定的孵育时间后（24孔板:感染后48小时，60小时，72小时，84小时和96小时;96孔板:感染后24小时，36小时，48小时，60小时和72小时），取出并弃去覆盖培养基，并用1x PBS洗涤细胞3次。对于 96 孔板，取出并弃去覆盖培养基，并用多通道移液管用 60 μL/孔 1x PBS 洗涤细胞 3 次。
   2. 加入 4% 多聚甲醛固定细胞（24 孔板:300 μL/孔;96 孔板:60 μL/孔）。将板在室温下孵育20分钟。
      注意:多聚甲醛是一种固体聚合甲醛。它是一种易燃的固体白色结晶粉末，与水混合或加热时会释放甲醛气体。所有涉及使用多聚甲醛的程序都必须按照特定于含甲醛化学品的实验室标准操作程序，在经过认证的化学品通风橱或经批准的排气外壳中进行。
   3. 20分钟后，弃去多聚甲醛，用1x PBS洗涤细胞3次。按照步骤 3.2-3.5 进行透化、封闭和抗体孵育。
      注意:丢弃 4% 多聚甲醛时，请遵循大学或研究所的废物处理程序。
2. 细胞通透性
   1. 加入1%辛基苯氧基聚乙氧基聚乙氧基乙醇（参见 材料表）使细胞通透（24孔板:200μL/孔;96孔板:40μL/孔）。将板在室温下孵育15分钟。
   2. 15分钟后，弃去辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，并用1x PBS洗涤细胞3次。
3. 阻塞
   1. 加入 3% 脱脂牛奶以减少样品中的非特异性结合（24 孔板:500 μL/孔;96 孔板:100 μL/孔）。将板在室温下孵育2小时。
   2. 2小时后，弃去3%脱脂牛奶，用1x PBS洗涤细胞3次。
      注意:这是一个停止点。加入3%脱脂牛奶后，在一抗插入前，板可在4°C下储存至2天。
4. 一抗孵育
   1. 加入在1%脱脂牛奶（1:1,000比例）中稀释的抗黄病毒单克隆抗体4G2（克隆D1-4G2-4-15;一抗，参见 材料表）（24孔板:200μL/孔;96孔板:40μL/孔）。将板在37°C孵育1小时。
   2. 1小时后，除去含有单克隆抗体的溶液，并用1x PBS洗涤细胞3次。
5. 二抗孵育
   1. 加入在1%脱脂牛奶（比例为1:1,000）中稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（参见 材料表）（24孔板:200μL/孔;96孔板:40μL/孔）。将板在37°C孵育1小时。
   2. 1小时后，除去含有二抗的溶液，并用1x PBS洗涤细胞3次。
6. 底物孵育
   1. 加入3,3'二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物（参见 材料表），并将板在黑暗中孵育30分钟（24孔板:200μL/孔;96孔板:40μL/孔）。30分钟后，用水清洗井停止反应。
   2. 将板风干过夜，并在板完全干燥后进行焦点计数。

4.病毒滴度的测定

1. 手动焦点计数过程（24 孔规格）
   1. 病灶可以在体视显微镜下观察。选择产生50-200个病灶的稀释度。
   2. 计算所选稀释液的每个重复的病灶。计算每种选定稀释液的平均焦点数。
   3. 使用以下公式计算每个样品的每 mL 病灶形成单位 （FFU/mL）:FFU/mL = 计数的平均病灶数/（稀释度 x 添加的稀释病毒体积）。
2. 自动焦点计数过程（96 孔规格）
   1. 在商业软件分析仪上扫描 96 孔板。
      1. 双击软件（见 材料表）打开。
      2. 单击 "切换套件 "，并确保将该套件切换到任何适用的套件（补充图 1A）。单击 "确定"。
      3. 单击 "扫描">"全板扫描 "（补充图1B）开始扫描。
      4. 单击 Dashboard 以确保捕获格式为 96 孔格式（补充图 2A）。
      5. 选择定心模式为"自动预对准用户验证"（补充图 2B）。
      6. 单击"弹出"（ Eject ） 以加载板。
         注意: 打开板盖并将其向上放置，A 行位于顶部（补充图 3A）。
      7. 输入车牌名称，然后单击 确定。单击 "加载 "（Load） 以加载板。
      8. 单击 "开始 "开始扫描。之后，使用"上、下、左、右"按钮校准 A1、A12 和 H1 的位置，然后单击 确认 （补充图 3B）。
         注意:软件将开始扫描每个孔。
      9. 扫描完成后，将弹出一个概览图像。单击 "关闭"。
      10. 单击 "返回总机"退出扫描。
   2. 使用软件对 96 孔板进行计数。
      1. 单击" 计数">"智能计数"。
      2. 在软件上，它将显示"第 1 步（共 5 步）:选择要计数的板"。单击 负载板。勾选整个文件夹，然后单击 "选择 "以导入扫描的印版（补充图4A）。
      3. 在软件上，它将显示"第 2 步（共 5 步）:定义计数参数"。单击 调整参数，将显示参数（漫反射过程;小/正常/大/最大/最大+1;光斑分离;计数面积;背景平衡;纤维去除;门控）。
         注意:从一口井开始，来回检查以找到所有井的最佳设置。
      4. 完成后，单击 "下一步 "（补充图4B）。
      5. 在软件上，它将显示"第 3 步（共 5 步）:选择/取消选择孔"。完成要计数的井的选择后，单击 "下一步 "继续。
         注:选择要计数的井将在每口井的右上角显示一个"C"（补充图5A）。
      6. 在软件上，它将显示"第 4 步（共 5 步）:输出设置"。单击 "查看/修改输出设置 "以检查设置（例如图像格式）是否合适。单击 "保存"并退出"下一步> （补充图 5B）。
      7. 在软件上，它将显示"第 5 步（共 5 步）:启动自动计数"。单击 "开始自动计数 "（补充图 6A）。
      8. 完成后，单击 "退出自动计数"。
3. 在商业软件分析仪中执行质量控制 （QC）。
   1. 在配电盘页面上，单击" 质量控制">"添加板"。勾选整个文件夹以导入计数的板，单击 "选择">"开始 QC "（补充图 6B）。
   2. 双击每个孔以审核斑点。单击 "计数 "以删除任何斑点。软件将开始计数。
      注意:确保勾选"斑点:删除"。计数的完成可以通过计数的焦点数来表示，例如"30"（补充图7A）。
   3. 计数结束后（由计数的焦点数表示，例如"30"），单击"是"以去除斑点（补充图7B）。在要删除的位置单击三次左键。右键单击完成，然后单击 "是"。
   4. 点击 "精加工板"，QC完成后转到"项目概述" 。
4. 使用软件分析仪进行成像。
   1. 检查扫描、计数和 QC 板图像（图 2）。

结果

ZIKV可以使用FFA进行量化，如图3所示。对于 24 孔板，将感染的 Vero 细胞固定在感染后 48 小时、60 小时、72 小时、84 小时和 96 小时。结果显示，感染后96小时（4天）后，细胞保持完整（未观察到细胞脱离）（图4和补充图8A-E）。在感染后48小时（2天）首次观察到病毒病灶的出现（图4A-F）。然而，病灶尺寸?...

讨论

有几种测定方法可以确定病毒滴度;PFA 具有与 FFA 相似的病毒定量方案，其中病毒接种物被稀释以区分单个斑块或病灶。染色后，每个斑块或病灶指示接种物¹⁹中的单个感染性颗粒。PFA用结晶紫染色，以可视化由细胞裂解或死亡引起的斑块形成。因此，PFA更耗时，因为病毒引起CPE需要更长的时间，并且仅限于诱导细胞裂解或死亡的病毒。许多实验室已成功使用 FFA 测定黄病毒的传?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter	Sartorius	S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube	Nest	615601
10 mL sterile serological pipette	Labserv	14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS)	Gibco	14190-136
2.0 mL Screw cap tube	Axygen	SCT-200-SS-C-S
24-well plate	Corning	3526
25 mL Sterile serological pipettes	Labserv	14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate	Thermo Scientific	34065
37 °C incubator with 5% CO2	Sanyo	MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette	Labserv	14955155
50 mL centrifuge tube	Falcon	LAB352070
75 cm2 tissue culture flask	Corning	430725U
96-well plate	Falcon	353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)	MilliporeSigma	MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)	N/A	N/A	22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II	Holten	HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer	ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)	CTL-S6UNV12	Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen	SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	MilliporeSigma	12-349
Hemacytometer	Laboroptik LTD	Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent	Sigma-Aldrich	I8896	Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL
Inverted microscope	ZEISS	TELAVAL 31
Laboratory rocker	FINEPCR	CR300
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)	Sigma-Aldrich	C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)	Eppendorf	3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)	Eppendorf	3125000052
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL)	Eppendorf	3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)	Eppendorf	3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)	Eppendorf	3123000055
Skim milk	Sunlac Low Fat	N/A	Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite	Clorox	N/A	To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle	Terumo	SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells	-	ECACC 88020401	Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.