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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vermehrung des Zika-Virus (ZIKV) in Nierenzellen von Vero-Afrikanischen Grünen Meerkatzen und die Quantifizierung von ZIKV unter Verwendung zellbasierter kolorimetrischer Immundetektionsmethoden in 24-Well- und 96-Well-Formaten (Hochdurchsatz).

Zusammenfassung

Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein von Stechmücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus. Eine ZIKV-Infektion wurde mit angeborenen Hirnanomalien und möglicherweise dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen in Verbindung gebracht. Die Erforschung des ZIKV zum Verständnis der Krankheitsmechanismen ist wichtig, um die Entwicklung von Impfstoffen und Therapien zu erleichtern. Die Methode zur Quantifizierung von Viren ist im Bereich der Virologie von entscheidender Bedeutung. Der Fokusformungstest (FFA) ist ein Virusquantifizierungstest, der das virale Antigen mit Antikörpern nachweist und die Infektionsherde von Zellen mit Hilfe der Peroxidase-Immunfärbetechnik identifiziert. Die aktuelle Studie beschreibt das Protokoll zur Ausbreitung und Quantifizierung des Virus sowohl im 24-Well- als auch im 96-Well-Format (hoher Durchsatz). Im Vergleich zu anderen ähnlichen Studien hat dieses Protokoll die Optimierung der Foci-Größe weiter beschrieben, was als Leitfaden dienen kann, um die Verwendung dieses Assays auf andere Viren auszuweiten. Zunächst wird die ZIKV-Vermehrung in Vero-Zellen für 3 Tage durchgeführt. Der ZIKV-haltige Kulturüberstand wird geerntet und mit Hilfe der FFA quantifiziert. Kurz gesagt, die Viruskultur wird auf Vero-Zellen inokuliert und für 2-3 Tage inkubiert. Die Foci-Bildung wird dann nach optimierten Färbeprozessen bestimmt, einschließlich Zellfixierung, Permeabilisierung, Blockierung, Antikörperbindung und Inkubation mit Peroxidase-Substrat. Die gefärbten Virusherde werden mit einem Stereomikroskop (manuelle Zählung im 24-Well-Format) oder Software-Analysator (automatische Zählung im 96-Well-Format) visualisiert. Die FFA liefert reproduzierbare, relativ schnelle Ergebnisse (3-4 Tage) und eignet sich für den Einsatz bei verschiedenen Viren, einschließlich nicht-plaquebildender Viren. In der Folge ist dieses Protokoll nützlich für die Untersuchung von ZIKV-Infektionen und könnte zum Nachweis anderer klinisch wichtiger Viren verwendet werden.

Einleitung

Die Infektion mit dem Zika-Virus (ZIKV) ist eine neu auftretende, durch Stechmücken übertragene Viruserkrankung. Die erste Isolierung des ZIKV fand 1947 in Uganda statt 1,2; Sie blieb von 1947 bis 2007 vernachlässigt, da die klinischen Symptome meist asymptomatisch und durch eine selbstlimitierende fieberhafte Erkrankung gekennzeichnet sind. Im Jahr 2007 begann die Zika-Epidemie auf den Yap-Inseln 3,4, gefolgt von größeren Epidemien in den pazifischen Regionen (Französisch-Polynesien, Osterinseln, Cookinseln und Neukaledonien) von 2013 bis 2014 5,6,7,8, wo erstmals die schwere neurologische Komplikation Guillain-Barré-Syndrom (GBS) bei Erwachsenen berichtet wurde9. In den Jahren 2015 und 2016 breitete sich die erste weit verbreitete ZIKV-Epidemie über den amerikanischen Kontinent aus, nachdem bereits 2013 der asiatische Genotyp des ZIKV in Brasilien aufgetreten war. Während dieses Ausbruchs wurden 440.000 bis 1,3 Millionen Fälle von Mikrozephalie und anderen neurologischen Erkrankungen bei Neugeborenen gemeldet11. Derzeit gibt es keine spezifische Heilung oder Behandlung für die ZIKV-Infektion. Daher besteht ein dringender medizinischer Bedarf an ZIKV-Impfstoffen, die in der Lage sind, Infektionen insbesondere während der Schwangerschaft zu verhindern.

Die Virusquantifizierung ist ein Verfahren, um die Anzahl der in einer Probe vorhandenen Viren zu bestimmen. Sie spielt eine wichtige Rolle in der Forschung, und akademische Laboratorien umfassen viele Bereiche, wie z. B. Medizin und Biowissenschaften. Dieser Prozess ist auch in kommerziellen Bereichen wichtig, wie z. B. bei der Herstellung von viralen Impfstoffen, rekombinanten Proteinen, viralen Antigenen oder antiviralen Wirkstoffen. Viele Methoden oder Assays können für die Virusquantifizierung verwendet werden12. Die Wahl der Methoden oder Assays hängt in der Regel von den Eigenschaften des Virus, dem gewünschten Genauigkeitsgrad und der Art des Experiments oder der Forschung ab. Im Allgemeinen können Methoden zur Quantifizierung von Viren in zwei Kategorien unterteilt werden: molekulare Assays, die das Vorhandensein von viraler Nukleinsäure (DNA oder RNA) nachweisen, und Assays, die die Virusinfektiosität in vitro messen 12. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR, für DNA) oder die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR, für RNA)13 und die digitale Tröpfchen-PCR14 sind Beispiele für gängige molekulare Techniken, die zur Quantifizierung der viralen Nukleinsäure in einer bestimmten Probe verwendet werden15. Diese hochempfindlichen molekularen Techniken können jedoch nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Viren unterscheiden15. Daher können Forschungsarbeiten, die Informationen über biologische Merkmale wie die Infektiosität von Viren auf Zellen erfordern, nicht mit den oben genannten molekularen Techniken abgeschlossen werden. Es werden Assays benötigt, die das Vorhandensein lebensfähiger Viren messen und bestimmen können. Zu den Assays, die die Virusinfektiosität messen, gehören der Plaque-bildende Assay (PFA), die infektiöse Dosis von 50 % der Gewebekultur (TCID50), der Fluoreszenz-Fokus-Assay und die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)12.

Die PFA, die 1952 von Renato Dulbecco entwickelt wurde, ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Virustitration, auch für ZIKV16. Es wird verwendet, um die Viruskonzentrationen für infektiöse lytische Virionen direkt zu bestimmen. Die Methode basiert auf der Fähigkeit eines lytischen Virus, zytopathische Effekte (CPEs; Zelltodzonen oder Plaques, ein Infektionsbereich, der von nicht infizierten Zellen umgeben ist) in einer inokulierten Zellmonoschicht nach einer Virusinfektion hervorzurufen. Der Assay hat jedoch mehrere Nachteile, die sich auf seinen Nutzen auswirken. Der Assay ist zeitaufwändig (dauert ca. 7-10 Tage, je nach Viren), CPE-abhängig und fehleranfällig. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine immunkolorimetrische Technik, den Focus Forming Assay (FFA), zum Nachweis und zur Quantifizierung von ZIKV in 24-Well-Platten- und 96-Well-Plattenformaten.

Protokoll

1. Virusvermehrung

  1. Vorbereitung der Zellen
    1. Züchten Sie Vero-Zellen in einem 75cm großen 2-Zellkulturkolben, der 12 ml modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco enthält, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 2 mM L-Glutamin (siehe Materialtabelle). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2.
    2. Überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop; Sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreicht haben, sind sie einsatzbereit (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Die Vero-Zellen verdoppeln sich etwa alle 24 Stunden17. Verdünnungen von 1:10 sollten 3 bis 4 Tage dauern, um eine Konfluenz von 80 % bis 90 % in einem 75 cm2-Kolben zu erreichen. Überwachen Sie die Zellen täglich oder jeden zweiten Tag.
  2. Infektion der Zellmonoschicht
    1. Entnehmen Sie das Wachstumsmedium mit einer serologischen 10-ml-Pipette aus dem Zellkulturkolben. Spülen Sie den Kolben mit 3 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (dPBS) von Dulbecco 2x mit einer serologischen Pipette von 5 ml.
      HINWEIS: Ein Becherglas mit 10 % Natriumhypochlorit muss vorbereitet werden, um weggeworfene infektiöse flüssige Abfälle aus Kolben/Platten zu desinfizieren.
    2. 2 ml serumfreies DMEM (DMEM ergänzt mit 2 mM L-Glutamin ohne FBS) und 20 μl ZIKV-Inokulum in den Zellkulturkolben geben. Der Kolben wird 1 h lang bei Raumtemperatur mit leichtem Schaukeln inkubiert, um die Virusadsorption zu ermöglichen.
      HINWEIS: Die Titration des ZIKV-Ausgangsbestands ist hilfreich, um das Volumen der ZIKV-Inokulum-Zugabe zu bestimmen (Schritt 2).
      ACHTUNG: ZIKV ist als Erreger der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) eingestuft. Alle Verfahren mit ZIKV-haltigen Materialien müssen in einer zertifizierten Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden und alle Standardarbeitsanweisungen (SOPs) des Labors mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung befolgen.
  3. Zugabe des Overlay-Mediums
    1. Nach der 1-stündigen Inkubation wird das verdünnte Virusinokulum mit einer serologischen 5-ml-Pipette entnommen und verworfen. Spülen Sie den Zellkulturkolben 2x mit 3 ml dPBS aus.
    2. Geben Sie 12 ml Erhaltungsmedien (DMEM ergänzt mit 2 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin) in den Zellkulturkolben, um die infizierten Zellen zu erhalten.
    3. Inkubieren Sie die infizierten Vero-Zellen für 3 Tage in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2.
      HINWEIS: Überwachen Sie täglich unter dem Mikroskop auf das CPE infizierter Vero-Zellen.
  4. Gewinnung von ZIKV-haltigem Zellkulturüberstand
    1. Am Tag 3 nach der Infektion kann eine Zellrundung und -ablösung (CPE) beobachtet werden (Abbildung 1B-D). Entnehmen Sie den Zellkulturüberstand, der das ZIKV enthält, mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    2. Verwenden Sie einen 0,22 μm Polyethersulfon-Spritzenvorsatz (siehe Materialtabelle), um den Zellkulturüberstand zu filtrieren. 500 μl des filtrierten Zellkulturüberstandes in 2,0-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss aliquotieren und bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C lagern.
      HINWEIS: Geerntetes ZIKV kann bei -80 °C gelagert werden, um eine langfristige Lagerung zu ermöglichen.
      VORSICHT: Bei der Verwendung einer Spritzennadel müssen zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, da die Nadel die Haut durchstechen kann. Es müssen SOPs für das Labor festgelegt werden.

2. Quantifizierung des Virus

  1. Vorbereitung der Zellen
    1. Besiedeln Sie Vero-Zellen in dafür vorgesehenen Platten (24-Well-Platte: 0,5 ml/Well, 7,5 x 104 Zellen/Well; 96-Well-Platte: 0,1 ml/Well, 1,5 x 104 Zellen/Well) und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
      HINWEIS: Es gibt fünf verschiedene Zeitpunkte, die getestet werden müssen (24-Well-Platte: 48 Stunden, 60 Stunden, 72 Stunden, 84 Stunden und 96 Stunden nach der Infektion; 96-Well-Platte: 24 Stunden, 36 Stunden, 48 Stunden, 60 Stunden und 72 Stunden nach der Infektion); Bereiten Sie daher für jeden Zeitpunkt einen Teller vor.
    2. Nach der 24-stündigen Inkubation und sobald die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 90 % erreicht haben (Abbildung 1E), ist die Platte bereit für die Infektion. Fahren Sie mit der Vorbereitung des verdünnten Virusbestands (Schritt 2.2) fort, bevor Sie die Zellmonoschicht infizieren.
  2. Verdünnung des Virus
    1. Bereiten Sie für 24- und 96-Well-Platten sechs sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Platte vor, um eine zehnfache Verdünnung (10-1 bis 10-5) durchzuführen, einschließlich einer Negativkontrolle. Für den Versuchsaufbau für eine 24-Well-Platte werden 450 μl serumfreies DMEM in alle sechs Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Für den Versuchsaufbau für eine 96-Well-Platte geben Sie 135 μl serumfreies DMEM in sechs Röhrchen.
      HINWEIS: Beschriften Sie jedes Röhrchen deutlich, um die Verdünnung seines Inhalts anzugeben, bevor Sie die zehnfache serielle Verdünnung durchführen.
    2. Um eine serielle Verdünnung durchzuführen, geben Sie für den 24-Well-Plattenversuchsaufbau 50 μl ZIKV-Stamm, der aus Schritt 1 geerntet wurde, in das 10-1-Röhrchen , das 450 μl serumfreies DMEM enthält. Für den 96-Well-Plattenversuchsaufbau geben Sie 15 μl ZIKV-Stamm in das 10-1-Röhrchen , das 135 μl serumfreies DMEM enthält.
    3. Wirbeln Sie jedes Röhrchen, um das Virus und das Medium zu vermischen. Dies ist die erste zehnfache Verdünnung.
      HINWEIS: Eine ordnungsgemäße Mischung von Virus und Kulturmedium in jedem Verdünnungsröhrchen ist erforderlich, um eine genaue serielle Verdünnung zu gewährleisten.
    4. Verwenden Sie für den 24-Well-Plattenversuchsaufbau eine frische Pipettenspitze, um das 10-1-Röhrchen zu resuspendieren, und überführen Sie 50 μl verdünntes ZIKV als zweite zehnfache Verdünnung in das 10-2-Röhrchen . Verwenden Sie für den 96-Well-Plattenversuchsaufbau eine frische Pipettenspitze, um das 10-1-Röhrchen zu resuspendieren und 15 μl verdünntes ZIKV als zweite zehnfache Verdünnung in das 10-2-Röhrchen zu überführen.
    5. Schritt 2.2.4 viermal bis zum fünften Röhrchen wiederholen (Negativkontrolle ausschließen).
      HINWEIS: Verwenden Sie nach jedem Pipettierschritt eine frische Pipettenspitze, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
  3. Infektion der Zellmonoschicht
    1. Entfernen und entsorgen Sie das konditionierte Medium aus jeder Vertiefung (24-Well-Platte: 0,5 ml/Well; 96-Well-Platte: 0,1 ml/Well).
    2. Spülen Sie jede Vertiefung 2x mit dPBS (24-Well-Platte: 300 μl/Well; 96-Well-Platte: 60 μl/Well).
    3. Arbeiten Sie von der höchsten zur niedrigsten Verdünnung und geben Sie jedes seriell verdünnte Virusinokulum in die Vertiefung (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μl/Well).
      HINWEIS: Die Infektion jeder Verdünnung wird in duplizierten Vertiefungen durchgeführt. Behalten Sie zwei nicht infizierte Vertiefungen als Negativkontrolle bei. Beschriften Sie die Platte und die Vertiefungen deutlich, um Verwechslungen zu vermeiden. Wechseln Sie die Pipettenspitzen nach jedem Pipettierschritt, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.
    4. Inkubieren Sie die Platte mit leichtem Schaukeln für 1 h bei Raumtemperatur, um eine Virusadsorption zu ermöglichen.
  4. Zugabe des Overlay-Zellkulturmediums
    1. Nach 1 Stunde Inkubation wird die Virussuspension von der niedrigsten zur höchsten Konzentration entfernt und verworfen.
    2. Waschen Sie die infizierten Zellen 2x mit dPBS (24-Well-Platte: 300 μl/Well; 96-Well-Platte: 60 μL/Well).
    3. Überlagern Sie die Vertiefung mit DMEM (ergänzt mit 2 % FBS, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin) und 1,5 % niedrigviskoser Carboxymethylcellulose (CMC; siehe Materialtabelle) (24-Well-Platte: 1 ml/Well; 96-Well-Platte: 0,2 ml/Well).
    4. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2.
      HINWEIS: Stören Sie die Platte während dieser Inkubationszeit nicht.
    5. Nehmen Sie die Platte aus dem Zellkultur-Inkubator, um sie zu verschiedenen Zeitpunkten zu färben (24-Well-Platte: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion; 96-Well-Platte: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h und 72 h nach der Infektion).

3. Färbung

  1. Zell-Fixierung
    1. Nach den spezifischen Stunden der Inkubation (24-Well-Platte: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion; 96-Well-Platte: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h und 72 h nach der Infektion) entfernen und verwerfen Sie das Overlay-Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 1x PBS. Für die 96-Well-Platte entfernen und entsorgen Sie das Overlay-Medium und waschen Sie die Zellen 3x mit 60 μl/Well von 1x PBS mit einer Mehrkanalpipette.
    2. Fügen Sie 4 % Paraformaldehyd hinzu, um die Zellen zu fixieren (24-Well-Platte: 300 μl/Well; 96-Well-Platte: 60 μL/Well). Die Platte bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubieren.
      ACHTUNG: Paraformaldehyd ist ein festes polymerisiertes Formaldehyd. Es ist ein brennbares, festes, weißes kristallines Pulver, das Formaldehydgas freisetzt, wenn es mit Wasser gemischt oder erhitzt wird. Alle Verfahren, bei denen Paraformaldehyd verwendet wird, müssen in einem zertifizierten chemischen Abzug oder in zugelassenen abgesaugten Gehäusen gemäß den für formaldehydhaltige Chemikalien spezifischen Labor-SOPs durchgeführt werden.
    3. Nach 20 min das Paraformaldehyd entsorgen und die Zellen 3x mit 1x PBS waschen. Führen Sie Permeabilisierung, Blockierung und Antikörperinkubationen gemäß den Schritten 3.2 bis 3.5 durch.
      HINWEIS: Wenn Sie 4% Paraformaldehyd entsorgen, befolgen Sie das Abfallentsorgungsverfahren der Universität oder des Instituts.
  2. Permeabilisierung von Zellen
    1. Fügen Sie 1 % Octylphenoxy-Poly(ethylenoxy)ethanol hinzu (siehe Materialtabelle), um die Zellen zu permeabilisieren (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μL/Well). Die Platte bei Raumtemperatur 15 Minuten lang inkubieren.
    2. Nach 15 min wird das Octylphenoxypoly(ethylenoxy)ethanol verworfen und die Zellen 3x mit 1x PBS gewaschen.
  3. Blockierend
    1. Fügen Sie 3 % Magermilch hinzu, um die unspezifische Bindung in der Probe zu verringern (24-Well-Platte: 500 μl/Well; 96-Well-Platte: 100 μL/Well). Die Platte 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Nach 2 h die 3%ige Magermilch entsorgen und die Zellen 3x mit 1x PBS waschen.
      HINWEIS: Dies ist ein Haltepunkt. Nach Zugabe von 3 % Magermilch können die Platten bis zu 2 Tage vor der Insertion des Primärantikörpers bei 4 °C gelagert werden.
  4. Inkubation von Primärantikörpern
    1. Der monoklonale Anti-Flavivirus-Antikörper 4G2 (Klon D1-4G2-4-15; Primärantikörper, siehe Materialtabelle) wird in 1 %iger Magermilch (Verhältnis 1:1.000) verdünnt (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μl/Well) zugegeben. Die Platte 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Nach 1 h wird die Lösung, die den monoklonalen Antikörper enthält, entnommen und die Zellen 3x mit 1x PBS gewaschen.
  5. Inkubation von Sekundärantikörpern
    1. Sekundärer Anti-Maus-IgG-Antikörper gegen Ziegen, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) (siehe Materialtabelle), verdünnt in 1 % Magermilch (Verhältnis 1:1.000) (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μl/Well). Die Platten 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Nach 1 h wird die Lösung, die den sekundären Antikörper enthält, entnommen und die Zellen 3x mit 1x PBS gewaschen.
  6. Substrat-Inkubation
    1. Fügen Sie 3,3'Diaminobenzidin (DAB)-Peroxidase-Substrat hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln (24-Well-Platte: 200 μl/Well; 96-Well-Platte: 40 μL/Well). Nach 30 Minuten stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Vertiefungen mit Wasser waschen.
    2. Lassen Sie die Platten über Nacht an der Luft trocknen und fahren Sie mit der Schwerpunktzählung fort, nachdem die Platten vollständig getrocknet sind.

4. Bestimmung des Virustiters

  1. Manueller Foci-Zählprozess (24-Well-Format)
    1. Die Herde können unter dem Stereomikroskop sichtbar gemacht werden. Wählen Sie die Verdünnung, die 50-200 Foci ergibt.
    2. Zählen Sie die Herde für jede Wiederholung der ausgewählten Verdünnung. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Brennpunkte für jede der ausgewählten Verdünnungen.
    3. Berechnen Sie die focibildende Einheit pro ml (FFU/ml) für jede Probe mit der folgenden Formel: FFU/ml = durchschnittliche Anzahl der gezählten Herde/(Verdünnung x Volumen des zugegebenen verdünnten Virus).
  2. Automatisierter Foci-Zählprozess (96-Well-Format)
    1. Scannen Sie die 96-Well-Platte mit einem kommerziellen Software-Analysator.
      1. Doppelklicken Sie auf die Software (siehe Materialtabelle), um sie zu öffnen.
      2. Klicken Sie auf Switch Suites und stellen Sie sicher, dass die Suite auf eine anwendbare Suite umgestellt wird (Ergänzende Abbildung 1A). Klicken Sie auf OK.
      3. Beginnen Sie den Scan, indem Sie auf Scan > Vollständiger Plattenscan klicken (Ergänzende Abbildung 1B).
      4. Klicken Sie auf Dashboard , um sicherzustellen, dass es sich bei dem Erfassungsformat um das 96-Well-Format handelt (Ergänzende Abbildung 2A).
      5. Wählen Sie den Zentrierungsmodus als "Automatische Vorausrichtung, benutzerverifiziert" (ergänzende Abbildung 2B).
      6. Klicken Sie auf Auswerfen , um die Platte zu laden.
        HINWEIS: Öffnen Sie den Deckel der Platte und legen Sie sie mit Reihe A nach oben (Ergänzende Abbildung 3A).
      7. Geben Sie den Kennzeichennamen ein und klicken Sie auf OK. Klicken Sie auf Laden , um die Platte zu laden.
      8. Klicken Sie auf Start , um den Scan zu starten. Kalibrieren Sie anschließend die Positionen für A1, A12 und H1 mit den Schaltflächen "Oben, Unten, Links, Rechts" und klicken Sie auf Bestätigen (Ergänzende Abbildung 3B).
        HINWEIS: Die Software beginnt mit dem Scannen der einzelnen Vertiefungen.
      9. Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, wird ein Übersichtsbild angezeigt. Klicken Sie auf Schließen.
      10. Beenden Sie den Scan, indem Sie auf Zurück zur Übersicht klicken.
    2. Zählen Sie die 96-Well-Platte mit der Software.
      1. Klicken Sie auf Anzahl > Smart Count.
      2. In der Software wird "Schritt 1 von 5: Zu zählende Platten auswählen" angezeigt. Klicken Sie auf Platte(n) laden. Markieren Sie den gesamten Ordner und klicken Sie auf Auswählen , um die gescannte Platte zu importieren (ergänzende Abbildung 4A).
      3. In der Software wird "Schritt 2 von 5: Zählparameter definieren" angezeigt. Klicken Sie auf Parameter anpassen, und die Parameter werden angezeigt (diffuser Prozess; klein/normal/groß/größte/größter +1; Punkttrennung; gezählte Fläche; Hintergrundbalance; Faserentfernung; Gating).
        HINWEIS: Beginnen Sie mit einer Vertiefung und schauen Sie hin und her, um die besten Einstellungen für alle Vertiefungen zu finden.
      4. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Weiter (Ergänzende Abbildung 4B).
      5. In der Software wird "Schritt 3 von 5: Auswählen/Abwählen von Wells" angezeigt. Sobald die Auswahl der zu zählenden Vertiefung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Weiter , um fortzufahren.
        HINWEIS: Die Wells, die für die Zählung ausgewählt wurden, werden mit einem "C" in der oberen rechten Ecke jedes Wells angezeigt (Ergänzende Abbildung 5A).
      6. In der Software wird "Schritt 4 von 5: Ausgabeeinstellungen" angezeigt. Klicken Sie auf Ausgabeeinstellungen anzeigen/ändern , um zu überprüfen, ob die Einstellungen (z. B. Bildformat) geeignet sind. Klicken Sie auf Speichern und beenden > Weiter (ergänzende Abbildung 5B).
      7. In der Software wird "Schritt 5 von 5: AutoCount starten" angezeigt. Klicken Sie auf AutoCount starten (ergänzende Abbildung 6A).
      8. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf AutoCount beenden.
  3. Führen Sie eine Qualitätskontrolle (QC) im kommerziellen Software-Analysator durch.
    1. Klicken Sie auf der Übersichtsseite auf Qualitätskontrolle > Platte(n) hinzufügen. Kreuzen Sie den gesamten Ordner an, um die gezählte Platte zu importieren, klicken Sie auf Auswählen > QC starten (ergänzende Abbildung 6B).
    2. Doppelklicken Sie auf jede Vertiefung, um die Stellen zu überprüfen. Klicken Sie auf Zählen , um alle Flecken zu entfernen. Die Software beginnt mit der Zählung.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass "Flecken: Entfernen" aktiviert ist. Der Abschluss der Zählung kann durch die gezählte Anzahl der Brennpunkte angezeigt werden, z.B. "30" (Ergänzende Abbildung 7A).
    3. Sobald die Zählung beendet ist (angezeigt durch die Anzahl der gezählten Herde, z. B. "30"), klicken Sie auf "Ja", um Flecken zu entfernen (Ergänzende Abbildung 7B). Klicken Sie dreimal mit der linken Maustaste auf die Stelle, die entfernt werden soll. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um den Vorgang abzuschließen, und klicken Sie dann auf Ja.
    4. Klicken Sie auf Platte fertigstellen und gehen Sie zur Projektübersicht, sobald die Qualitätskontrolle abgeschlossen ist.
  4. Führen Sie die Bildgebung mit dem Software-Analysator durch.
    1. Überprüfen Sie das gescannte, gezählte und QC-Plattenbild (Abbildung 2).

Ergebnisse

ZIKV kann mit Hilfe der FFA quantifiziert werden, wie in Abbildung 3 schematisch dargestellt. Für die 24-Well-Platte wurden die infizierten Vero-Zellen 48 h, 60 h, 72 h, 84 h und 96 h nach der Infektion fixiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Zellen auch 96 h (4 Tage) nach der Infektion intakt blieben (es wurde keine Zellablösung beobachtet) (Abbildung 4 und ergänzende Abbildung 8A-E). Das Auftreten von Virusherden wurde erstmals 48 h (2 Ta...

Diskussion

Es gibt mehrere Assays, um den Virustiter zu bestimmen. Die PFA hat ein ähnliches Protokoll zur Virusquantifizierung wie die FFA, bei der das Virusinokulum verdünnt wird, um die Unterscheidung einzelner Plaques oder Herde zu ermöglichen. Nach der Färbung weist jede Plaque oder jeder Herd auf ein einzelnes infektiöses Partikel im Inokulum19 hin. Das PFA wird mit Kristallviolett gefärbt, um die Plaquebildung durch Zelllyse oder Zelltod sichtbar zu machen. Daher ist die PFA zeitaufwändiger, da...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde vom malaysischen Ministerium für Hochschulbildung im Rahmen des Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) und der Finanzierung des Higher Institution Centre of Excellence (HICoE)-Programms (MO002-2019) unterstützt. Abbildung 3 in dieser Studie, die zeigt, dass der Ablauf der Färbung für den focibildenden Assay aus "DAB Immunohistochemistry" von BioRender.com (2022) übernommen wurde. Abgerufen von https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filterSartoriusS6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tubeNest615601
10 mL sterile serological pipetteLabserv14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS)Gibco14190-136
2.0 mL Screw cap tube AxygenSCT-200-SS-C-S
24-well plateCorning3526
25 mL Sterile serological pipettesLabserv14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrateThermo Scientific34065
37 °C incubator with 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL sterile serological pipetteLabserv14955155
50 mL centrifuge tubeFalconLAB352070
75 cm2 tissue culture flask Corning430725U
96-well plateFalcon353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)N/AN/A22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class IIHoltenHB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot AnalyzerImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)MilliporeSigma12-349
HemacytometerLaboroptik LTDNeubauer improved
IGEPAL CA-630 detergentSigma-AldrichI8896Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscopeZEISSTELAVAL 31
Laboratory rockerFINEPCRCR300
L-GlutamineGibco25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)Sigma-AldrichC5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)Eppendorf3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)Eppendorf3125000052
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL)Eppendorf3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)Eppendorf3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)Eppendorf3123000055
Skim milkSunlac Low FatN/APrepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium HypochloriteCloroxN/ATo disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
StereomicroscopeNikonSMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G NeedleTerumoSS10L21G
Vero African green monkey kidney cells -ECACC 88020401Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

Referenzen

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