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  • Résumé
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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit la propagation du virus Zika (ZIKV) dans les cellules rénales de singes verts d’Afrique et la quantification du virus Zika à l’aide de méthodes d’immunodétection colorimétrique cellulaires dans des formats à 24 puits et 96 puits (haut débit).

Résumé

Le virus Zika (ZIKV) est un virus transmis par les moustiques appartenant au genre Flavivirus. L’infection par le virus Zika a été associée à des anomalies cérébrales congénitales et potentiellement au syndrome de Guillain-Barré chez l’adulte. La recherche sur le virus Zika pour comprendre les mécanismes de la maladie est importante pour faciliter la mise au point d’un vaccin et d’un traitement. La méthode de quantification des virus est cruciale et fondamentale dans le domaine de la virologie. Le test de formation de foyer (FFA) est un test de quantification virale qui détecte l’antigène viral avec des anticorps et identifie les foyers d’infection des cellules à l’aide de la technique d’immunomarquage de la peroxydase. La présente étude décrit le protocole de propagation et de quantification du virus à l’aide de formats à 24 puits et à 96 puits (haut débit). Comparé à d’autres études similaires, ce protocole a décrit plus en détail l’optimisation de la taille des foyers, ce qui peut servir de guide pour étendre l’utilisation de ce test à d’autres virus. Tout d’abord, la propagation du ZIKV est effectuée dans les cellules Vero pendant 3 jours. Le surnageant de culture contenant le virus Zika est récolté et quantifié à l’aide de l’AGL. Brièvement, la culture virale est inoculée sur les cellules Vero et incubée pendant 2 à 3 jours. La formation des foyers est ensuite déterminée après des processus de coloration optimisés, y compris la fixation cellulaire, la perméabilisation, le blocage, la liaison aux anticorps et l’incubation avec un substrat de peroxydase. Les foyers de virus colorés sont visualisés à l’aide d’un stéréomicroscope (comptage manuel au format 24 puits) ou d’un analyseur logiciel (comptage automatisé au format 96 puits). Le FFA fournit des résultats reproductibles et relativement rapides (3-4 jours) et peut être utilisé pour différents virus, y compris les virus non plaques. Par la suite, ce protocole est utile pour l’étude de l’infection par le virus Zika et pourrait être utilisé pour détecter d’autres virus cliniquement importants.

Introduction

L’infection par le virus Zika (ZIKV) est une maladie virale émergente transmise par les moustiques. Le premier isolement du virus Zika a eu lieu en Ouganda en 1947 1,2 ; Elle est restée négligée de 1947 à 2007, car les symptômes cliniques sont le plus souvent asymptomatiques et caractérisés par une maladie fébrile spontanément résolutive. En 2007, l’épidémie de Zika a commencé dans les îles Yap 3,4, suivie d’épidémies plus importantes dans les régions du Pacifique (Polynésie française, île de Pâques, îles Cook et Nouvelle-Calédonie) de 2013 à 2014 5,6,7,8, où la complication neurologique sévère du syndrome de Guillain-Barré (SGB) a été signalée chez l’adulte pour la première fois 9. En 2015 et 2016, la première épidémie généralisée de virus Zika a balayé les Amériques après l’émergence du génotype asiatique du virus Zika au Brésil dès 201310. Au cours de cette épidémie, 440 000 à 1,3 million de cas de microcéphalie et d’autres troubles neurologiques ont été signalés chez les nouveau-nés11. À l’heure actuelle, il n’existe pas de remède ou de traitement spécifique pour l’infection par le virus Zika ; Il existe donc un besoin médical urgent de vaccins contre le virus Zika capables de prévenir les infections, en particulier pendant la grossesse.

La quantification virale est un processus permettant de déterminer le nombre de virus présents dans un échantillon. Il joue un rôle important dans la recherche, et les laboratoires académiques impliquent de nombreux domaines, tels que la médecine et les sciences de la vie. Ce processus est également important dans les secteurs commerciaux, tels que la production de vaccins viraux, de protéines recombinantes, d’antigènes viraux ou d’agents antiviraux. De nombreuses méthodes ou tests peuvent être utilisés pour la quantification du virus12. Le choix des méthodes ou des essais dépend normalement des caractéristiques du virus, du niveau de précision souhaité et de la nature de l’expérience ou de la recherche. En général, les méthodes de quantification des virus peuvent être divisées en deux catégories : les tests moléculaires qui détectent la présence d’acide nucléique viral (ADN ou ARN) et les tests qui mesurent l’infectivité virale in vitro12. La réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR, pour l’ADN) ou la réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse quantitative (qRT-PCR, pour l’ARN)13 et la PCR par gouttelettes numériques14 sont des exemples de techniques moléculaires couramment utilisées pour quantifier l’acide nucléique viral dans un échantillon donné15. Cependant, ces techniques moléculaires très sensibles ne permettent pas de faire la différence entre les virus viables et non viables15. Par conséquent, les recherches qui nécessitent des informations sur les caractéristiques biologiques, telles que l’infectivité du virus sur les cellules, ne peuvent pas être menées à bien à l’aide des techniques moléculaires susmentionnées ; Des tests permettant de mesurer et de déterminer la présence de virus viables sont nécessaires. Les tests qui mesurent l’infectivité du virus comprennent le test de formation de plaque (PFA), la dose infectieuse de culture tissulaire à 50 % (TCID50), le test de focalisation fluorescente et la microscopie électronique à transmission (MET)12.

Le PFA, mis au point par Renato Dulbecco en 1952, est l’une des méthodes les plus couramment utilisées pour le titrage du virus, y compris pour le virus Zika16. Il est utilisé pour déterminer directement les concentrations virales des virions lytiques infectieux. La méthode est basée sur la capacité d’un virus lytique à produire des effets cytopathiques (CPEs, zones de mort cellulaire ou plaques, zone d’infection entourée de cellules non infectées) dans une monocouche cellulaire inoculée après une infection virale. Cependant, le test présente plusieurs inconvénients qui affectent son utilité. Le test prend du temps (environ 7 à 10 jours, selon les virus), dépend du CPE et est sujet aux erreurs. Dans la présente étude, nous rapportons une technique immunocolorimétrique, le test de formation de foyer (FFA), pour la détection et la quantification du virus Zika dans des formats de plaques à 24 puits et de plaques à 96 puits.

Protocole

1. Propagation du virus

  1. Préparation des cellules
    1. Cultiver des cellules Vero dans un flacon de culture de2 cellules de 75 cm contenant 12 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 2 mM de L-glutamine (voir le tableau des matériaux). Incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
    2. Surveiller les cellules au microscope ; une fois que les cellules atteignent 70 % à 90 % de confluence, elles sont prêtes à être utilisées (Figure 1A).
      REMARQUE : Les cellules Vero doublent environ toutes les 24 h17. Des dilutions de 1 :10 devraient prendre 3 à 4 jours pour atteindre une confluence de 80 % à 90 % dans une fiole de 75 cm2 . Surveillez les cellules tous les jours ou tous les deux jours.
  2. Infection de la monocouche cellulaire
    1. Retirer le milieu de culture du flacon de culture cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml. Rincez le flacon avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (dPBS) de Dulbecco 2 fois à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL.
      REMARQUE : Un bécher contenant de l’hypochlorite de sodium à 10 % doit être préparé pour désinfecter tout déchet liquide infectieux jeté dans les flacons ou les assiettes.
    2. Ajouter 2 mL de DMEM sans sérum (DMEM complété par 2 mM de L-glutamine sans FBS) et 20 μL d’inoculum de ZIKV dans le flacon de culture cellulaire. Incuber le flacon en le balançant doucement pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption du virus.
      NOTA : Le titrage du stock initial de virus Zika sera utile pour déterminer le volume d’ajout d’inoculum de virus Zika (étape 2).
      MISE EN GARDE : Le virus Zika est classé comme agent pathogène de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Toutes les procédures impliquant des matières contenant le virus Zika doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité certifiée et suivre toutes les procédures opérationnelles normalisées (SOP) du laboratoire avec l’équipement de protection individuelle approprié.
  3. Ajout du support de recouvrement
    1. Après 1 h d’incubation, retirer et jeter l’inoculum viral dilué à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml. Rincer le flacon de culture cellulaire avec 3 mL de dPBS 2x.
    2. Ajouter 12 mL de milieu d’entretien (DMEM complété par 2 % de FBS, 2 mM de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine) dans le flacon de culture cellulaire pour maintenir les cellules infectées.
    3. Incuber les cellules Vero infectées pendant 3 jours dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Surveillez quotidiennement le CPE des cellules Vero infectées au microscope.
  4. Récolte d’un surnageant de culture cellulaire contenant le virus Zika
    1. Au jour 3 après l’infection, un arrondi et un décollement cellulaires (CPE) peuvent être observés (Figure 1B-D). Prélever le surnageant de culture cellulaire contenant le virus Zika dans un tube à centrifuger de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
    2. Utilisez un filtre à seringue en polyéthersulfone de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux) pour filtrer le surnageant de culture cellulaire. Aliquote 500 μL du surnageant de culture cellulaire filtré dans des tubes à bouchon à vis de 2,0 mL et conserver à -80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
      REMARQUE : Le virus Zika récolté peut être conservé à une température de -80 °C pour un stockage à long terme.
      ATTENTION : Des précautions supplémentaires doivent être prises si une aiguille de seringue est utilisée, car l’aiguille peut perforer la peau. Des SOP de laboratoire doivent être établies.

2. Quantification des virus

  1. Préparation des cellules
    1. Semer les cellules Vero dans des plaques désignées (plaque à 24 puits : 0,5 mL/puits, 7,5 x 104 cellules/puits ; plaque à 96 puits : 0,1 mL/puits, 1,5 x 104 cellules/puits) et incuber la plaque pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Il y a cinq points temporels différents à tester (plaque à 24 puits : 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection ; plaque à 96 puits : 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection) ; Par conséquent, préparez une assiette pour chaque point de temps.
    2. Après l’incubation de 24 h et une fois que les cellules ont atteint une confluence de 70 % à 90 % (Figure 1E), la plaque est prête pour l’infection. Procéder à la préparation du stock de virus dilué (étape 2.2) avant l’infection de la monocouche cellulaire.
  2. Dilution du virus
    1. Pour les plaques à 24 et 96 puits, préparez six tubes de microcentrifugation stériles de 1,5 mL pour chaque plaque afin d’effectuer une dilution dix fois supérieure (10-1 à 10-5), y compris un témoin négatif. Pour la configuration expérimentale d’une plaque à 24 puits, ajoutez 450 μL de DMEM sans sérum dans les six tubes de microcentrifugation. Pour la configuration expérimentale d’une plaque à 96 puits, ajoutez 135 μL de DMEM sans sérum dans six tubes.
      REMARQUE : Étiquetez clairement chaque tube pour indiquer la dilution de son contenu avant d’effectuer la dilution en série décuplée.
    2. Pour effectuer la dilution en série, pour la configuration de l’expérience sur plaque à 24 puits, ajouter 50 μL de stock de ZIKV qui a été récolté à l’étape 1 dans le tube 10-1 qui contient 450 μL de DMEM sans sérum. Pour la configuration expérimentale sur plaque à 96 puits, ajoutez 15 μL de stock de ZIKV dans le tube 10-1 qui contient 135 μL de DMEM sans sérum.
    3. Vortex chaque tube pour mélanger le virus et le milieu. Il s’agit de la première dilution décuplée.
      REMARQUE : Un mélange approprié du virus et du milieu de culture dans chaque tube de dilution est nécessaire pour assurer une dilution en série précise.
    4. Pour la configuration de l’expérience sur plaque à 24 puits, utiliser une pointe de pipette neuve pour remettre le tube 10-1 en suspension et transférer 50 μL de ZIKV dilué dans le tube 10-2 comme deuxième dilution décuplée. Pour la configuration de l’expérience sur plaque à 96 puits, utiliser une pointe de pipette neuve pour remettre le tube 10-1 en suspension et transférer 15 μL de ZIKV dilué dans le tube 10-2 comme deuxième dilution décuplée.
    5. Répétez l’étape 2.2.4 quatre fois jusqu’au cinquième tube (exclure le contrôle négatif).
      REMARQUE : Utilisez un nouvel embout de pipette après chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée.
  3. Infection de la monocouche cellulaire
    1. Retirer et jeter le milieu conditionné de chaque puits (plaque à 24 puits : 0,5 ml/puits ; plaque à 96 puits : 0,1 ml/puits).
    2. Rincez chaque puits avec dPBS 2x (plaque à 24 puits : 300 μL/puits ; plaque à 96 puits : 60 μL/puits).
    3. En procédant de la dilution la plus élevée à la dilution la plus faible, ajouter chaque inoculum de virus dilué en série dans le puits (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits).
      REMARQUE : L’infection de chaque dilution sera effectuée dans des puits dupliqués. Maintenir deux puits non infectés comme témoin négatif. Étiquetez clairement la plaque et les puits pour éviter toute confusion. Changez les pointes de pipette après chaque étape de pipetage pour éviter la contamination croisée.
    4. Incuber la plaque en la balançant doucement pendant 1 h à température ambiante pour permettre l’adsorption du virus.
  4. Ajout du milieu de culture cellulaire de recouvrement
    1. Après 1 h d’incubation, retirez et jetez la suspension virale de la concentration la plus faible à la plus élevée.
    2. Laver les cellules infectées avec dPBS 2x (plaque à 24 puits : 300 μL/puits ; plaque à 96 puits : 60 μL/puits).
    3. Recouvrir le puits de DMEM (complété par 2 % de FBS, 2 mM de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine) et 1,5 % de carboxyméthylcellulose à faible viscosité (CMC ; voir le tableau des matériaux) (plaque à 24 puits : 1 mL/puits ; plaque à 96 puits : 0,2 mL/puits).
    4. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
      REMARQUE : Ne dérangez pas la plaque pendant cette période d’incubation.
    5. Sortez la plaque de l’incubateur de culture cellulaire pour la coloration à différents moments (plaque à 24 puits : 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection ; plaque à 96 puits : 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection).

3. Coloration

  1. Fixation cellulaire
    1. Après les heures spécifiques d’incubation (plaque à 24 puits : 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection ; plaque à 96 puits : 24 h, 36 h, 48 h, 60 h et 72 h après l’infection), retirez et jetez le milieu de recouvrement et lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS. Pour la plaque à 96 puits, retirez et jetez le milieu de recouvrement et lavez les cellules 3 fois avec 60 μL/puits de 1x PBS avec une pipette multicanaux.
    2. Ajouter 4 % de paraformaldéhyde pour fixer les cellules (plaque à 24 puits : 300 μL/puits ; plaque à 96 puits : 60 μL/puits). Incuber l’assiette à température ambiante pendant 20 min.
      ATTENTION : Le paraformaldéhyde est un formaldéhyde polymérisé solide. Il s’agit d’une poudre cristalline inflammable, solide et blanche qui libère du formaldéhyde gazeux lorsqu’elle est mélangée à de l’eau ou chauffée. Toutes les procédures impliquant l’utilisation de paraformaldéhyde doivent être effectuées dans une hotte chimique certifiée ou dans des enceintes d’évacuation approuvées conformément aux SOP de laboratoire spécifiques aux produits chimiques contenant du formaldéhyde.
    3. Après 20 min, jetez le paraformaldéhyde et lavez les cellules 3x avec 1x PBS. Effectuez la perméabilisation, le blocage et l’incubation d’anticorps en suivant les étapes 3.2 à 3.5.
      REMARQUE : Lorsque vous jetez du paraformaldéhyde à 4%, suivez la procédure d’élimination des déchets de l’université ou de l’institut.
  2. Perméabilisation cellulaire
    1. Ajouter 1 % de poly(éthylèneoxy)éthanol d’octylphénoxy (voir le tableau des matériaux) pour perméabiliser les cellules (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Incuber l’assiette à température ambiante pendant 15 min.
    2. Après 15 min, jetez le poly(éthylèneoxy)éthanol octylphénoxy et lavez les cellules 3x avec 1x PBS.
  3. Bloquant
    1. Ajouter du lait écrémé à 3 % pour réduire la liaison non spécifique dans l’échantillon (plaque à 24 puits : 500 μL/puits ; plaque à 96 puits : 100 μL/puits). Incuber l’assiette à température ambiante pendant 2 h.
    2. Après 2 h, jetez le lait écrémé à 3 % et lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS.
      REMARQUE : Il s’agit d’un point d’arrêt. Après avoir ajouté du lait écrémé à 3 %, les plaques peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 jours avant l’insertion primaire de l’anticorps.
  4. Incubation primaire d’anticorps
    1. Ajouter l’anticorps monoclonal anti-flavivirus, 4G2 (clone D1-4G2-4-15 ; anticorps primaire, voir le tableau des matériaux) dilué dans du lait écrémé à 1 % (rapport 1 :1 000) (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Incuber l’assiette à 37 °C pendant 1 h.
    2. Après 1 h, retirez la solution contenant l’anticorps monoclonal et lavez les cellules 3 fois avec 1 PBS.
  5. Incubation secondaire d’anticorps
    1. Ajouter l’anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (voir la table des matériaux) dilué dans du lait écrémé à 1 % (rapport 1 :1 000) (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Incuber les plaques à 37 °C pendant 1 h.
    2. Après 1 h, retirez la solution contenant l’anticorps secondaire et lavez les cellules 3x avec 1x PBS.
  6. Incubation sur substrat
    1. Ajouter le substrat de peroxydase 3,3'diaminobenzidine (DAB) (voir tableau des matériaux) et incuber la plaque pendant 30 min dans l’obscurité (plaque à 24 puits : 200 μL/puits ; plaque à 96 puits : 40 μL/puits). Après 30 min, arrêtez la réaction en lavant les puits avec de l’eau.
    2. Séchez les plaques à l’air libre pendant la nuit et procédez au dénombrement des foyers une fois que les plaques sont complètement sèches.

4. Détermination du titre du virus

  1. Processus manuel de comptage des foyers (format 24 puits)
    1. Les foyers peuvent être visualisés au microscope stéréoscopique. Sélectionnez la dilution qui produit 50 à 200 foyers.
    2. Comptez les foyers pour chaque répétition de la dilution sélectionnée. Calculer le nombre moyen de foyers pour chacune des dilutions sélectionnées.
    3. Calculer l’unité formant foyer par mL (FFU/mL) pour chaque échantillon avec la formule ci-dessous : FFU/mL = nombre moyen de foyers comptés/(dilution x volume de virus dilué ajouté).
  2. Processus automatisé de comptage des foyers (format 96 puits)
    1. Scannez la plaque à 96 puits à l’aide d’un analyseur logiciel commercial.
      1. Double-cliquez sur le logiciel (voir Table des matériaux) pour l’ouvrir.
      2. Cliquez sur Changer de suite et assurez-vous que la suite est basculée vers l’une des suites qui s’applique (Figure supplémentaire 1A). Cliquez sur OK.
      3. Lancez l’analyse en cliquant sur Numériser > Numérisation complète (Figure 1B supplémentaire).
      4. Cliquez sur Tableau de bord pour vous assurer que le format de capture est le format à 96 puits (Figure supplémentaire 2A).
      5. Sélectionnez le mode de centrage « Préalignement automatique vérifié par l’utilisateur » (Figure supplémentaire 2B).
      6. Cliquez sur Éjecter pour charger la plaque.
        REMARQUE : Ouvrez le couvercle de l’assiette et placez-le vers le haut avec la rangée A en haut (figure supplémentaire 3A).
      7. Entrez le nom de la plaque et cliquez sur OK. Cliquez sur Charger pour charger la plaque.
      8. Cliquez sur Démarrer pour lancer l’analyse. Après cela, calibrez les positions pour A1, A12 et H1 à l’aide des boutons « Haut, Bas, Gauche, Droite » et cliquez sur Confirmer (Figure supplémentaire 3B).
        REMARQUE : Le logiciel commencera à analyser chaque puits.
      9. Une fois la numérisation terminée, une image d’aperçu apparaîtra. Cliquez sur Fermer.
      10. Quittez l’analyse en cliquant sur Retour au standard.
    2. Comptez la plaque à 96 puits à l’aide du logiciel.
      1. Cliquez sur Count > Smart Count (Comptage intelligent).
      2. Sur le logiciel, il affichera « Étape 1 sur 5 : Sélectionner les plaques à compter ». Cliquez sur Plaque de chargement. Cochez l’ensemble du dossier et cliquez sur Sélectionner pour importer la plaque numérisée (Figure supplémentaire 4A).
      3. Sur le logiciel, il affichera « Étape 2 sur 5 : Définir les paramètres de comptage ». Cliquez sur Ajuster les paramètres, et les paramètres s’afficheront (processus diffus ; petit/normal/grand/plus grand/plus grand +1 ; séparation ponctuelle ; zone comptée ; équilibre de l’arrière-plan ; suppression des fibres ; gating).
        REMARQUE : Commencez avec un puits, et vérifiez d’avant en arrière pour trouver les meilleurs réglages pour tous les puits.
      4. Une fois cela fait, cliquez sur Suivant (Figure supplémentaire 4B).
      5. Sur le logiciel, il affichera « Étape 3 sur 5 : Sélectionner/désélectionner les puits ». Une fois la sélection du puits à compter terminée, cliquez sur Suivant pour continuer.
        NOTA : Les puits sélectionnés pour être comptés apparaîtront avec un « C » dans le coin supérieur droit de chaque puits (figure supplémentaire 5A).
      6. Sur le logiciel, il affichera « Étape 4 sur 5 : Paramètres de sortie ». Cliquez sur Afficher/Modifier les paramètres de sortie pour vérifier si les paramètres (tels que le format d’image) sont appropriés. Cliquez sur Enregistrer et quittez > suivant (Figure supplémentaire 5B).
      7. Sur le logiciel, il affichera « Étape 5 sur 5 : Démarrer AutoCount ». Cliquez sur Start AutoCount (Figure supplémentaire 6A).
      8. Une fois terminé, cliquez sur Quitter AutoCount.
  3. Effectuer le contrôle de la qualité (CQ) dans l’analyseur de logiciels commerciaux.
    1. Sur la page du standard, cliquez sur Contrôle de la qualité > Ajouter une ou plusieurs plaques. Cochez tout le dossier pour importer la plaque comptée, cliquez sur Sélectionner > Démarrer QC (Figure supplémentaire 6B).
    2. Double-cliquez sur chaque puits pour auditer les spots. Cliquez sur Compter pour supprimer les taches. Le logiciel commencera à compter.
      REMARQUE : Assurez-vous que « Spots : Supprimer » est coché. L’achèvement du comptage peut être indiqué par le nombre de foyers comptés, par exemple « 30 » (figure supplémentaire 7A).
    3. Une fois le comptage terminé (indiqué par le nombre de foyers comptés, par exemple « 30 »), cliquez sur « Oui » pour supprimer les taches (figure supplémentaire 7B). Cliquez trois fois avec le bouton gauche de la souris sur l’endroit à supprimer. Cliquez avec le bouton droit de la souris pour terminer, puis cliquez sur Oui.
    4. Cliquez sur Plaque de finition et accédez à l’aperçu du projet une fois le contrôle qualité terminé.
  4. Effectuez des travaux d’imagerie à l’aide de l’analyseur logiciel.
    1. Vérifiez l’image numérisée, comptée et la plaque de contrôle qualité (Figure 2).

Résultats

Le virus Zika peut être quantifié à l’aide de l’AFL, comme le montre schématiquement la figure 3. Pour la plaque à 24 puits, les cellules Vero infectées ont été fixées à 48 h, 60 h, 72 h, 84 h et 96 h après l’infection. Les résultats ont montré que les cellules sont restées intactes (aucun détachement cellulaire n’a été observé) 96 h (4 jours) après l’infection (figure 4 et figure supplémentaire 8A-E). L’apparitio...

Discussion

Il existe plusieurs tests pour déterminer le titre du virus ; le PFA a un protocole de quantification du virus similaire à celui du FFA, dans lequel l’inoculum du virus est dilué pour permettre de distinguer les plaques ou les foyers individuels. Après coloration, chaque plaque ou foyer indique une seule particule infectieuse dans l’inoculum19. Le PFA est coloré avec du violet cristallin pour visualiser la formation de plaque causée par la lyse cellulaire ou la mort. Par conséquent, le...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Cette recherche a reçu le soutien du ministère de l’Enseignement supérieur de Malaisie dans le cadre du programme de subventions de recherche à long terme (LRGS MRUN Phase 1 : LRGS MRUN/F1/01/2018) et un financement du programme Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figure 3 de cette étude qui montre le flux de travail de coloration pour le test de formation des foyers est adaptée de « DAB Immunohistochemistry » par BioRender.com (2022). Récupéré de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filterSartoriusS6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tubeNest615601
10 mL sterile serological pipetteLabserv14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS)Gibco14190-136
2.0 mL Screw cap tube AxygenSCT-200-SS-C-S
24-well plateCorning3526
25 mL Sterile serological pipettesLabserv14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrateThermo Scientific34065
37 °C incubator with 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL sterile serological pipetteLabserv14955155
50 mL centrifuge tubeFalconLAB352070
75 cm2 tissue culture flask Corning430725U
96-well plateFalcon353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)N/AN/A22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class IIHoltenHB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot AnalyzerImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)MilliporeSigma12-349
HemacytometerLaboroptik LTDNeubauer improved
IGEPAL CA-630 detergentSigma-AldrichI8896Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscopeZEISSTELAVAL 31
Laboratory rockerFINEPCRCR300
L-GlutamineGibco25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)Sigma-AldrichC5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)Eppendorf3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)Eppendorf3125000052
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL)Eppendorf3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)Eppendorf3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)Eppendorf3123000055
Skim milkSunlac Low FatN/APrepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium HypochloriteCloroxN/ATo disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
StereomicroscopeNikonSMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G NeedleTerumoSS10L21G
Vero African green monkey kidney cells -ECACC 88020401Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

Références

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