התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

Jia-Yi Tan; Jo-Ern Wong; Nurhafiza Zainal; Sazaly AbuBakar; Kim-Kee Tan

doi:10.3791/64578

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התפשטות נגיף הזיקה (ZIKV) בתאי כליות של קוף ירוק אפריקאי ורו ואת הכימות של ZIKV באמצעות שיטות זיהוי חיסוני קולורימטרי מבוססות תאים בפורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה).

Abstract

נגיף זיקה (ZIKV) הוא נגיף המועבר על ידי יתושים השייך לסוג Flavivirus. זיהום ZIKV נקשר למומים מולדים במוח ואולי לתסמונת Guillain-Barré אצל מבוגרים. מחקר על ZIKV כדי להבין את מנגנוני המחלה חשוב כדי להקל על פיתוח החיסון והטיפול. שיטת כימות הנגיפים היא חיונית ובסיסית בתחום הווירולוגיה. בדיקת יצירת המיקוד (FFA) היא בדיקת כימות וירוסים המזהה את האנטיגן הנגיפי עם נוגדנים ומזהה את מוקדי הזיהום של תאים באמצעות טכניקת הצביעה החיסונית peroxidase. המחקר הנוכחי מתאר את פרוטוקול ההתפשטות והכימות של וירוסים באמצעות פורמטים של 24 בארות ו-96 בארות (תפוקה גבוהה). בהשוואה למחקרים דומים אחרים, פרוטוקול זה תיאר עוד יותר אופטימיזציה של גודל מוקדים, אשר יכול לשמש כמדריך להרחבת השימוש בבדיקה זו עבור וירוסים אחרים. ראשית, התפשטות ZIKV מבוצעת בתאי Vero במשך 3 ימים. סופרנאטנט התרבית המכיל ZIKV נקצר ומכומת באמצעות FFA. בקצרה, תרבית הנגיף מחוסנת על תאי ורו ומודגרת במשך 2-3 ימים. היווצרות מוקדים נקבעת לאחר תהליכי צביעה אופטימליים, כולל קיבוע תאים, חלחול, חסימה, קשירת נוגדנים ודגירת מצע פרוקסידז. מוקדי הנגיף המוכתמים מוצגים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו (ספירה ידנית בפורמט 24 בארות) או מנתח תוכנה (ספירה אוטומטית בפורמט 96 בארות). ה- FFA מספק תוצאות ניתנות לשחזור, מהירות יחסית (3-4 ימים) ומתאים לשימוש עבור וירוסים שונים, כולל וירוסים שאינם יוצרי פלאק. לאחר מכן, פרוטוקול זה שימושי לחקר זיהום ZIKV וניתן להשתמש בו כדי לזהות וירוסים חשובים אחרים מבחינה קלינית.

Introduction

זיהום בנגיף זיקה (ZIKV) הוא מחלה נגיפית מתפתחת המועברת על ידי יתושים. הבידוד הראשון של ZIKV היה באוגנדה בשנת 1947 ^1,2; היא נותרה מוזנחת מ-1947 עד 2007, שכן הסימפטומים הקליניים הם לרוב א-סימפטומטיים ומאופיינים במחלת חום המגבילה את עצמה. בשנת 2007, מגיפת זיקה החלה באיי יאפ ^3,4, ואחריה מגיפות גדולות יותר באזורי האוקיינוס השקט (פולינזיה הצרפתית, אי הפסחא, איי קוק וקלדוניה החדשה) משנת 2013 עד 2014 ^5,6,7,8, שם הסיבוך הנוירולוגי החמור תסמונת Guillain-Barré (GBS) דווח לראשונה במבוגרים ⁹. במהלך 2015 ו -2016, מגיפת ZIKV הנרחבת הראשונה שטפה את אמריקה לאחר הופעת הגנוטיפ האסייתי של ZIKV בברזיל כבר בשנת 2013¹⁰. במהלך התפרצות זו, 440,000 עד 1.3 מיליון מקרים של מיקרוצפליה, והפרעות נוירולוגיות אחרות, דווחו בתינוקות שזה עתה נולדו¹¹. כיום אין תרופה או טיפול ספציפיים לזיהום ZIKV; לפיכך, קיים צורך רפואי דחוף בחיסוני ZIKV המסוגלים למנוע זיהומים, במיוחד במהלך ההריון.

כימות וירוסים הוא תהליך לקביעת מספר הנגיפים הקיימים בדגימה. היא ממלאת תפקיד חשוב במחקר, ומעבדות אקדמיות מערבות תחומים רבים, כגון רפואה ומדעי החיים. תהליך זה חשוב גם במגזרים מסחריים, כגון ייצור חיסונים נגיפיים, חלבונים רקומביננטיים, אנטיגנים נגיפיים או חומרים אנטי-ויראליים. שיטות או בדיקות רבות יכולות לשמש לכימות וירוסים¹². בחירת השיטות או הבדיקות תלויה בדרך כלל במאפייני הנגיף, ברמת הדיוק הרצויה ובאופי הניסוי או המחקר. באופן כללי, ניתן לחלק את שיטות הכימות של וירוסים לשתי קטגוריות: בדיקות מולקולריות המזהות נוכחות של חומצת גרעין ויראלית (DNA או RNA) ובדיקות המודדות את ההדבקה בנגיף במבחנה¹². תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR, עבור DNA) או תגובת שרשרת כמותית של פולימראז שעתוק לאחור (qRT-PCR, עבור RNA)¹³ ו- PCR¹⁴ טיפתי דיגיטלי הן דוגמאות לטכניקות מולקולריות נפוצות המשמשות לכימות חומצת הגרעין הנגיפית במדגם נתון¹⁵. עם זאת, טכניקות מולקולריות רגישות מאוד אלה אינן יכולות להבדיל בין וירוסים בני קיימא ושאינם בני קיימא¹⁵. לכן, מחקר הדורש מידע על תכונות ביולוגיות, כגון הדבקה של וירוסים בתאים, אינו יכול להסתיים באמצעות הטכניקות המולקולריות שהוזכרו לעיל; יש צורך בבדיקות שיכולות למדוד ולקבוע את נוכחותם של וירוסים בני קיימא. בדיקות המודדות את ההדבקה בנגיף כוללות את בדיקת יצירת הפלאק (PFA), מינון זיהומי של 50% תרבית רקמה (TCID50), בדיקת מיקוד פלואורסצנטי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)¹².

PFA, שפותחה על ידי רנאטו דולבקו בשנת 1952, היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לטיטרציה של וירוסים, כולל עבור ZIKV¹⁶. הוא משמש כדי לקבוע ישירות את ריכוזי הנגיפים עבור virions lytic זיהומיות. השיטה מבוססת על יכולתו של וירוס ליטי לייצר השפעות ציטופתיות (CPEs; אזורים של מוות תאי או פלאקים, אזור של זיהום מוקף תאים לא נגועים) בחד-שכבה של תאים מחוסנים לאחר הדבקה ויראלית. עם זאת, ישנם מספר חסרונות לבדיקה המשפיעים על התועלת שלה. הבדיקה גוזלת זמן (אורכת כ-7-10 ימים, תלוי בווירוסים), תלויה ב-CPE ומועדת לשגיאות. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על טכניקה אימונוקולורימטרית, בדיקת יצירת מיקוד (FFA), לזיהוי וכימות ZIKV בפורמטים של לוחות 24 בארות ולוחות 96 בארות.

Protocol

1. התפשטות וירוסים

הכנת תאים
1. לגדל תאי Vero בבקבוק תרבית תאים^{בגודל 75} ס"מ המכיל 12 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-2 מילימטר L-גלוטמין (ראה טבלת חומרים). לדגור על התאים באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C עם 5% CO₂.
2. לפקח על התאים תחת מיקרוסקופ; ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%-90%, הם מוכנים לשימוש (איור 1A).
  הערה: תאי Vero מכפילים את עצמם בערך כל 24 שעות¹⁷. דילול של 1:10 צריך לקחת 3 עד 4 ימים כדי להגיע 80%-90% מפגש ב 75 ס"מ² צלוחיות. עקוב אחר התאים מדי יום או כל יומיים.
זיהום של monolayer התא
1. הסר את מדיום הגידול מבקבוק תרבית התאים באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. שטפו את הבקבוק עם 3 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (dPBS) 2x באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל.
  הערה: עם 10% נתרן היפוכלוריט חייבת להיות מוכנה לחיטוי כל פסולת נוזלית זיהומית שהושלכה מצלוחיות/צלחות.
2. הוסף 2 מ"ל של DMEM ללא סרום (DMEM בתוספת 2 mM L-גלוטמין ללא FBS) ו 20 μL של ZIKV inoculum לתוך בקבוק תרבית התא. דוגרים על הבקבוק בנדנוד עדין במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ספיחת וירוסים.
  הערה: טיטרציה של מלאי ZIKV הראשוני תעזור לקבוע את נפח תוספת החיסון ZIKV (שלב 2).
  זהירות: ZIKV מסווג כפתוגן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). כל ההליכים עם חומרים המכילים ZIKV חייבים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית מוסמך ולעקוב אחר כל נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של המעבדה (SOPs) עם ציוד מגן אישי מתאים.
תוספת של אמצעי הכיסוי
1. לאחר הדגירה של 1 שעות, להסיר ולהשליך את החיסון וירוס מדולל באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ"ל. שטפו את בקבוק תרבית התאים עם 3 מ"ל של dPBS 2x.
2. הוסף 12 מ"ל של אמצעי תחזוקה (DMEM בתוספת 2% FBS, 2 mM L-גלוטמין, ו 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין) לתוך בקבוק תרבית התא כדי לשמור על התאים הנגועים.
3. לדגור על תאי Vero נגועים במשך 3 ימים באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C עם 5% CO₂.
  הערה: יש לעקוב מדי יום אחר CPE של תאי Vero נגועים תחת מיקרוסקופ.
קצירת סופרנאטנט תרבית תאים המכיל ZIKV
1. ביום השלישי שלאחר ההדבקה ניתן לראות עיגול תאים וניתוק (CPE) (איור 1B-D). קצרו את הסופרנאטנט של תרבית התאים המכיל את ה-ZIKV לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
2. השתמש במסנן מזרק פוליאתרסולפון בגודל 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים) כדי לסנן את תרבית התא. Aliquot 500 μL של supernatant תרבית תאים מסונן לתוך 2.0 מ"ל צינורות מכסה בורג ולאחסן ב -80 ° C עד לשימוש חדש.
  הערה: ניתן לאחסן ZIKV שנקטף בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.
  זהירות: יש לנקוט אמצעי זהירות נוספים אם משתמשים במחט מזרק, מכיוון שהמחט עלולה לנקב את העור. יש להקים SOPs מעבדה.

2. כימות וירוסים

הכנת תאים
1. זרעו תאי Vero בצלחות ייעודיות (צלחת 24 באר: 0.5 מ"ל / באר, 7.5 x 10⁴ תאים / באר; צלחת 96 באר: 0.1 מ"ל / באר, 1.5 x 10⁴ תאים / באר) ודגרים על הצלחת לילה באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C עם 5% CO₂.
  הערה: ישנן חמש נקודות זמן שונות שיש לבדוק (צלחת 24 באר: 48 שעות, 60 שעות, 72 שעות, 84 שעות ו-96 שעות לאחר ההדבקה; צלחת 96 בארות: 24 שעות, 36 שעות, 48 שעות, 60 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה); לכן, הכינו צלחת אחת לכל נקודת זמן.
2. לאחר הדגירה של 24 שעות, וברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%-90% (איור 1E), הצלחת מוכנה לזיהום. המשך להכין את מלאי וירוס מדולל (שלב 2.2) לפני ההדבקה של monolayer התא.
דילול וירוסים
1. עבור צלחות 24 ו 96 בארות, להכין שישה צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים 1.5 מ"ל עבור כל צלחת לבצע דילול פי עשרה (^10-1 עד ^10-5), כולל בקרה שלילית. עבור מערך הניסוי עבור צלחת 24 בארות, הוסף 450 μL של DMEM ללא סרום לכל ששת צינורות מיקרוצנטריפוגה. עבור הגדרת הניסוי עבור צלחת 96 בארות, להוסיף 135 μL של DMEM ללא סרום לתוך שישה צינורות.
  הערה: יש לתייג כל צינור בבירור כדי לציין את דילול תכולתו לפני ביצוע הדילול הטורי פי עשרה.
2. כדי לבצע דילול סדרתי, עבור מערך ניסוי של 24 בארות, הוסף 50 μL של מלאי ZIKV שנקצר משלב 1 לתוך צינור ^10-1 המכיל 450 μL של DMEM ללא סרום. למערך ניסוי של 96 בארות, הוסף 15 μL של מלאי ZIKV לצינור ^10-1 המכיל 135 μL של DMEM ללא סרום.
3. מערבלים כל צינור כדי לערבב את הנגיף ואת המדיום. זהו הדילול הראשון פי עשרה.
  הערה: ערבוב נכון של מדיום וירוס ותרבית בכל צינור דילול נדרש כדי להבטיח דילול סדרתי מדויק.
4. עבור מערך ניסוי צלחת 24 בארות, השתמש בקצה פיפטה טרי כדי להשהות מחדש את הצינור ^10-1 ולהעביר 50 μL של ZIKV מדולל לתוך צינור ^10-2 כמו דילול שני פי עשרה. עבור מערך ניסוי צלחת 96 בארות, השתמש בקצה פיפטה טרי כדי להשהות מחדש את הצינור ^10-1 ולהעביר 15 μL של ZIKV מדולל לתוך צינור ^10-2 כמו דילול שני פי עשרה.
5. חזור על שלב 2.2.4 ארבע פעמים עד הצינור החמישי (לא כולל שליטה שלילית).
  הערה: יש להשתמש בקצה פיפטה טרי לאחר כל שלב צנרת כדי למנוע זיהום צולב.
זיהום של monolayer התא
1. מוציאים ומשליכים את התווך המותנה מכל באר (צלחת 24 באר: 0.5 מ"ל / באר; צלחת 96 באר: 0.1 מ"ל / באר).
2. יש לשטוף כל באר עם dPBS 2x (צלחת 24 באר: 300 μL / באר; צלחת 96 באר: 60 μL / באר).
3. בעבודה מהדילול הגבוה ביותר לנמוך ביותר, מוסיפים כל חיסון וירוס מדולל סדרתי לבאר (צלחת 24 באר: 200 מיקרוליטר / באר; צלחת 96 באר: 40 מיקרוליטר / באר).
  הערה: הזיהום של כל דילול יבוצע בבארות כפולות. שמור על שתי בארות לא נגועות כבקרה שלילית. תייגו את הצלחת והבארות בבירור כדי למנוע בלבול. שנה את קצות פיפטה לאחר כל שלב pipetting כדי למנוע זיהום צולב.
4. דוגרים על הצלחת בנדנוד עדין במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאפשר ספיחת וירוסים.
תוספת של מדיום תרבית תאים שכבת-על
1. לאחר שעה אחת של דגירה, להסיר ולהשליך את ההשעיה וירוס מן הריכוז הנמוך ביותר לגבוה ביותר.
2. לשטוף את התאים הנגועים עם dPBS 2x (צלחת 24 באר: 300 μL / באר; צלחת 96 באר: 60 μL / באר).
3. כיסוי הבאר עם DMEM (בתוספת 2% FBS, 2 mM L-גלוטמין, ו 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין) ו 1.5% צמיגות נמוכה carboxymethyl cellulose (CMC; ראה טבלה של חומרים) (צלחת 24 באר: 1 מ"ל / באר; צלחת 96 באר: 0.2 מ"ל / באר).
4. לדגור על הצלחת באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C עם 5% CO₂.
  הערה: אין להפריע לצלחת במהלך תקופת הדגירה.
5. הוציאו את הצלחת מאינקובטור תרביות התאים לצורך צביעה בנקודות זמן שונות (צלחת 24 בארות: 48 שעות, 60 שעות, 72 שעות, 84 שעות ו-96 שעות לאחר ההדבקה; צלחת 96 בארות: 24 שעות, 36 שעות, 48 שעות, 60 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה).

3. צביעה

קיבוע תאים
1. לאחר שעות הדגירה הספציפיות (צלחת 24 באר: 48 שעות, 60 שעות, 72 שעות, 84 שעות ו-96 שעות לאחר ההדבקה; צלחת 96 באר: 24 שעות, 36 שעות, 48 שעות, 60 שעות ו-72 שעות לאחר ההדבקה), יש להסיר ולהשליך את מדיום הכיסוי ולשטוף את התאים 3x עם 1x PBS. עבור צלחת 96 באר, להסיר ולהשליך את המדיום כיסוי ולשטוף את התאים 3x עם 60 μL / באר של 1x PBS עם פיפטה רב ערוצית.
2. הוסף 4% paraformaldehyde כדי לתקן את התאים (צלחת 24 באר: 300 μL / באר; צלחת 96 באר: 60 μL / באר). דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  זהירות: פרפורמלדהיד הוא פורמלדהיד פולימרי מוצק. זוהי אבקה גבישית לבנה דליקה, מוצקה, המשחררת גז פורמלדהיד כאשר מערבבים אותה עם מים או מחממים אותה. כל ההליכים הכרוכים בשימוש בפרפורמאלדהיד חייבים להתבצע במכסה אדים כימי מאושר או במארזים מותשים מאושרים בעקבות SOPs מעבדה ספציפיים לכימיקלים המכילים פורמלדהיד.
3. לאחר 20 דקות, השליכו את הפרפורמאלדהיד ושטפו את התאים 3x עם PBS אחד. בצע חדירות, חסימה ואינקובציות נוגדנים לפי שלבים 3.2-3.5.
  הערה: בעת השלכת 4% paraformaldehyde, בצע את הליך סילוק הפסולת של האוניברסיטה או המכון.
חדירות תאים
1. הוסף 1% אוקטילפנוקסי פולי (אתילנוקסי)אתנול (ראה טבלת חומרים) כדי לחדור את התאים (צלחת 24 באר: 200 מיקרוליטר / באר; צלחת 96 באר: 40 מיקרוליטר / באר). דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
2. לאחר 15 דקות, השליכו את האוקטילפנוקסי פולי(אתילנאוקסי) אתנול ושטפו את התאים 3x עם 1x PBS.
חסימת
1. הוסיפו 3% חלב רזה כדי להפחית את הקשירה הלא ספציפית בדגימה (צלחת 24 באר: 500 מיקרוליטר / באר; צלחת 96 באר: 100 מיקרוליטר / באר). דוגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
2. לאחר שעתיים, השליכו את החלב הרזה 3% ושטפו את התאים 3x עם 1x PBS.
  הערה: זוהי נקודת עצירה. לאחר הוספת 3% חלב רזה, ניתן לאחסן את הצלחות ב 4 ° C עד יומיים לפני החדרת נוגדנים ראשוניים.
דגירה ראשונית של נוגדנים
1. הוסף נוגדן חד שבטי אנטי-פלבי-וירוס, 4G2 (שיבוט D1-4G2-4-15; נוגדן ראשוני, ראה טבלת חומרים) מדולל בחלב רזה 1% (יחס 1:1,000) (צלחת 24 באר: 200 מיקרוליטר / באר; צלחת 96 באר: 40 מיקרוליטר / באר). לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 1 שעה.
2. לאחר 1 שעה, להסיר את הפתרון המכיל נוגדן חד שבטי ולשטוף את התאים 3x עם 1x PBS.
דגירה משנית של נוגדנים
1. הוסף נוגדן משני מסוג IgG נגד עכבר המצומד לפרוקסידז חזרת (HRP) (ראה טבלת חומרים) מדולל בחלב רזה 1% (יחס של 1:1,000) (צלחת 24 באר: 200 מיקרוליטר / באר; צלחת 96 באר: 40 מיקרוליטר / באר). לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 1 שעה.
2. לאחר 1 שעה, להסיר את הפתרון המכיל את הנוגדן המשני ולשטוף את התאים 3x עם 1x PBS.
דגירה במצע
1. מוסיפים מצע פרוקסידז 3,3'diaminobenzidine (DAB) (ראו טבלת חומרים) ודגרו על הצלחת למשך 30 דקות בחושך (צלחת 24 באר: 200 מיקרוליטר / באר; צלחת 96 באר: 40 מיקרוליטר / באר). לאחר 30 דקות, להפסיק את התגובה על ידי שטיפת הבארות עם מים.
2. ייבשו את הצלחות באוויר למשך הלילה והמשיכו לספירת מוקדים לאחר שהלוחות יבשים לחלוטין.

4. קביעת טיטר הנגיף

תהליך ספירת מוקדים ידני (פורמט 24 בארות)
1. ניתן לדמיין מוקדים תחת מיקרוסקופ סטריאו. בחר את הדילול שמייצר 50-200 מוקדים.
2. ספרו את המוקדים עבור כל העתק של הדילול שנבחר. חשב את מספר המוקדים הממוצע עבור כל אחד מהדילולים שנבחרו.
3. חשב את יחידת יצירת המוקדים למ"ל (FFU/mL) עבור כל דגימה עם הנוסחה הבאה: FFU/mL = מספר ממוצע של מוקדים שנספרו / (דילול x נפח של וירוס מדולל נוסף).
תהליך ספירת מוקדים אוטומטי (פורמט 96 בארות)
1. סרוק את צלחת 96 הבאר על מנתח תוכנה מסחרי.
  1. לחץ פעמיים על התוכנה (ראה טבלת חומרים) כדי לפתוח.
  2. לחץ על Switch Suites וודא שהחבילה עוברת לכל סוויטה רלוונטית (איור משלים 1A). לחץ על אישור.
  3. התחל את הסריקה על-ידי לחיצה על סרוק > סריקת צלחת מלאה (איור משלים 1B).
  4. לחץ על לוח מחוונים כדי לוודא שפורמט הלכידה הוא פורמט 96 בארות (איור משלים 2A).
  5. בחר את מצב המרכוז כ"יישור מוקדם אוטומטי של המשתמש מאומת" (איור משלים 2B).
  6. לחץ על הוצא כדי לטעון את הצלחת.
    הערה: פתחו את מכסה הלוח והניחו אותו כלפי מעלה עם שורה A בחלק העליון (איור משלים 3A).
  7. הזן את שם הצלחת ולחץ על אישור. לחץ על טען כדי לטעון את הצלחת.
  8. לחץ על התחל כדי להתחיל בסריקה. לאחר מכן, כיילו את המיקומים עבור A1, A12 ו-H1 באמצעות הכפתורים "למעלה, למטה, שמאלה, ימין" ולחצו על אישור (איור משלים 3B).
    הערה: התוכנה תתחיל לסרוק כל באר.
  9. לאחר השלמת הסריקה, תופיע תמונת סקירה. לחץ על סגור.
  10. צא מהסריקה על-ידי לחיצה על חזור למרכזייה.
2. ספור את צלחת 96 באר באמצעות התוכנה.
  1. לחצו על 'ספירה' >'ספירה חכמה'.
  2. בתוכנה, הוא יציג "שלב 1 מתוך 5: בחר צלחות לספור". לחץ על טען לוחות. סמן את כל התיקיה ולחץ על בחר כדי לייבא את הצלחת הסרוקה (איור משלים 4A).
  3. בתוכנה, הוא יציג "שלב 2 מתוך 5: הגדר פרמטרים לספירה". לחץ על התאמת פרמטרים, והפרמטרים יוצגו (תהליך מפוזר; קטן/רגיל/גדול/גדול/גדול +1; הפרדת נקודות; שטח נספר; איזון רקע; הסרת סיבים; גידור).
    הערה: התחל עם באר אחת, ובדוק הלוך ושוב כדי למצוא את ההגדרות הטובות ביותר עבור כל הבארות.
  4. לאחר שתסיים, לחץ על הבא (איור משלים 4B).
  5. בתוכנה, הוא יציג "שלב 3 מתוך 5: בחר / בטל בחירה של בארות". לאחר השלמת בחירת הבאר שיש לספור, לחץ על הבא כדי להמשיך.
    הערה: הבארות שנבחרו להיספר יופיעו עם האות C בפינה הימנית העליונה של כל באר (איור משלים 5A).
  6. בתוכנה, הוא יציג "שלב 4 מתוך 5: הגדרות פלט". לחץ על הצג / שנה הגדרות פלט כדי לבדוק אם ההגדרות (כגון פורמט תמונה) מתאימות. לחץ על שמור וצא > הבא (איור משלים 5B).
  7. בתוכנה, הוא יציג "שלב 5 מתוך 5: התחל ספירה אוטומטית". לחץ על התחל ספירה אוטומטית (איור משלים 6A).
  8. לאחר שתסיים, לחץ על צא מהספירה האוטומטית.
ביצוע בקרת איכות (QC) במנתח התוכנה המסחרית.
1. בדף המרכזייה, לחץ על בקרת איכות > הוסף לוחות. סמן את כל התיקיה כדי לייבא את הצלחת שנספרה, לחץ על בחר > התחל QC (איור משלים 6B).
2. לחץ פעמיים על כל באר כדי לבדוק את הכתמים. לחץ על ספירה כדי להסיר כתמים. התוכנה תתחיל לספור.
  הערה: ודא שהאפשרות "כתמים: הסר" מסומנת. השלמת הספירה יכולה להיות מסומנת על ידי מספר המוקדים שנספר, למשל "30" (איור משלים 7A).
3. לאחר סיום הספירה (מצוין על-ידי מספר המוקדים שנספר, לדוגמה "30"), לחץ על "כן" כדי להסיר כתמים (איור משלים 7B). לחץ לחיצה שמאלית משולשת על המקום להסרה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסיים, ולאחר מכן לחץ על כן.
4. לחץ על Finish Plate ועבור אל Project Overview לאחר השלמת ה- QC.
בצע הדמיה באמצעות מנתח התוכנה.
1. בדקו את תמונת לוח ה-QC הסרוקה, הנספרת ותמונת לוח ה-QC (איור 2).

תוצאות

ניתן לכמת את ZIKV באמצעות FFA, כפי שמתואר באופן סכמטי באיור 3. עבור צלחת 24 בארות, תאי Vero נגועים תוקנו ב 48 שעות, 60 שעות, 72 שעות, 84 שעות, ו 96 שעות לאחר ההדבקה. התוצאות הראו שהתאים נשארו שלמים (לא נצפתה היפרדות תאים) לאחר 96 שעות (4 ימים) לאחר ההדבקה (איור 4 ואיור משלים 8...

Discussion

ישנן מספר בדיקות כדי לקבוע titer וירוס; ל- PFA יש פרוטוקול כימות וירוסים דומה ל- FFA, שבו החיסון נגד הנגיף מדולל כדי לאפשר הבחנה בין פלאקים או מוקדים בודדים. לאחר הצביעה, כל פלאק או מוקד מצביע על חלקיק זיהומי יחיד בחיסון¹⁹. ה- PFA מוכתם בסגול קריסטל כדי לדמיין היווצרות פלאק הנגרמת על ידי ?...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה קיבל תמיכה ממשרד ההשכלה הגבוהה מלזיה במסגרת תוכנית מענקי המחקר לטווח ארוך (LRGS MRUN שלב 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) ומימון לתוכנית מרכז המצוינות של המוסד הגבוה (HICoE) (MO002-2019). איור 3 במחקר זה שמראה את זרימת העבודה של צביעה עבור בדיקת יצירת מוקדים מותאמת מתוך "DAB Immunohistochemistry" על ידי BioRender.com (2022). מקור: https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter	Sartorius	S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube	Nest	615601
10 mL sterile serological pipette	Labserv	14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS)	Gibco	14190-136
2.0 mL Screw cap tube	Axygen	SCT-200-SS-C-S
24-well plate	Corning	3526
25 mL Sterile serological pipettes	Labserv	14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate	Thermo Scientific	34065
37 °C incubator with 5% CO₂	Sanyo	MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette	Labserv	14955155
50 mL centrifuge tube	Falcon	LAB352070
75 cm² tissue culture flask	Corning	430725U
96-well plate	Falcon	353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)	MilliporeSigma	MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)	N/A	N/A	22.8 g of 8 mM Na₂HPO₄, 4.0 g of 1.5 mM KH₂PO₄, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H₂O
Biological safety cabinet, Class II	Holten	HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer	ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)	CTL-S6UNV12	Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum (FBS)	Bovogen	SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)	MilliporeSigma	12-349
Hemacytometer	Laboroptik LTD	Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent	Sigma-Aldrich	I8896	Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL
Inverted microscope	ZEISS	TELAVAL 31
Laboratory rocker	FINEPCR	CR300
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)	Sigma-Aldrich	C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)	Eppendorf	3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)	Eppendorf	3125000052
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL)	Eppendorf	3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)	Eppendorf	3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)	Eppendorf	3123000055
Skim milk	Sunlac Low Fat	N/A	Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite	Clorox	N/A	To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle	Terumo	SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells	-	ECACC 88020401	Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

References

Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

194 ZIKV Flavivirus Guillain Barr FFA 24 96

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: