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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la propagazione del virus Zika (ZIKV) in cellule renali di scimmia verde africana Vero e la quantificazione di ZIKV utilizzando metodi di immunorilevazione colorimetrica basati su cellule nei formati a 24 e 96 pozzetti (high throughput).

Abstract

Il virus Zika (ZIKV) è un virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus. L'infezione da ZIKV è stata associata ad anomalie cerebrali congenite e potenzialmente alla sindrome di Guillain-Barré negli adulti. La ricerca su ZIKV per comprendere i meccanismi della malattia è importante per facilitare lo sviluppo di vaccini e trattamenti. Il metodo di quantificazione dei virus è cruciale e fondamentale nel campo della virologia. Il focus forming assay (FFA) è un test di quantificazione del virus che rileva l'antigene virale con gli anticorpi e identifica i focolai di infezione delle cellule utilizzando la tecnica di immunocolorazione della perossidasi. L'attuale studio descrive il protocollo di propagazione e quantificazione del virus utilizzando sia i formati a 24 pozzetti che a 96 pozzetti (high throughput). Rispetto ad altri studi simili, questo protocollo ha ulteriormente descritto l'ottimizzazione delle dimensioni dei focolai, che può servire come guida per espandere l'uso di questo test per altri virus. In primo luogo, la propagazione di ZIKV viene eseguita in cellule Vero per 3 giorni. Il surnatante di coltura contenente ZIKV viene raccolto e quantificato utilizzando l'FFA. In breve, la coltura virale viene inoculata su cellule Vero e incubata per 2-3 giorni. La formazione di focolai viene quindi determinata dopo processi di colorazione ottimizzati, tra cui la fissazione cellulare, la permeabilizzazione, il blocco, il legame degli anticorpi e l'incubazione con substrato di perossidasi. I focolai virali colorati vengono visualizzati utilizzando uno stereomicroscopio (conteggio manuale in formato a 24 pozzetti) o un analizzatore software (conteggio automatizzato in formato a 96 pozzetti). L'FFA fornisce risultati riproducibili e relativamente rapidi (3-4 giorni) ed è adatto per essere utilizzato per diversi virus, compresi quelli che non formano placca. Successivamente, questo protocollo è utile per lo studio dell'infezione da ZIKV e potrebbe essere utilizzato per rilevare altri virus clinicamente importanti.

Introduzione

L'infezione da virus Zika (ZIKV) è una malattia virale emergente trasmessa dalle zanzare. Il primo isolamento di ZIKV avvenne in Uganda nel 1947 1,2; È rimasta trascurata dal 1947 al 2007, poiché i sintomi clinici sono più comunemente asintomatici e caratterizzati da malattia febbrile autolimitante. Nel 2007, l'epidemia di Zika è iniziata nelle isole Yap 3,4, seguita da epidemie più grandi nelle regioni del Pacifico (Polinesia francese, Isola di Pasqua, Isole Cook e Nuova Caledonia) dal 2013 al 2014 5,6,7,8, dove la grave complicanza neurologica sindrome di Guillain-Barré (GBS) è stata segnalata per la prima volta negli adulti 9. Tra il 2015 e il 2016, la prima epidemia diffusa di ZIKV si è diffusa nelle Americhe dopo l'emergere del genotipo asiatico di ZIKV in Brasile già nel 201310. Durante questa epidemia, sono stati segnalati da 440.000 a 1,3 milioni di casi di microcefalia e altri disturbi neurologici nei neonati. Attualmente non esiste una cura o un trattamento specifico per l'infezione da ZIKV; quindi, c'è un urgente bisogno medico di vaccini ZIKV in grado di prevenire le infezioni, in particolare durante la gravidanza.

La quantificazione dei virus è un processo per determinare il numero di virus presenti in un campione. Svolge un ruolo importante nella ricerca e i laboratori accademici coinvolgono molti campi, come la medicina e le scienze della vita. Questo processo è importante anche in settori commerciali, come la produzione di vaccini virali, proteine ricombinanti, antigeni virali o agenti antivirali. Per la quantificazione dei virus possono essere utilizzati molti metodi o saggi12. La scelta dei metodi o dei saggi dipende normalmente dalle caratteristiche del virus, dal livello di accuratezza desiderato e dalla natura dell'esperimento o della ricerca. In generale, i metodi di quantificazione dei virus possono essere suddivisi in due categorie: saggi molecolari che rilevano la presenza di acido nucleico virale (DNA o RNA) e saggi che misurano l'infettività del virus in vitro12. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR, per il DNA) o la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR, per l'RNA)13 e la PCR a goccia digitale14 sono esempi di tecniche molecolari comuni utilizzate per quantificare l'acido nucleico virale in un dato campione15. Tuttavia, queste tecniche molecolari altamente sensibili non sono in grado di distinguere tra virus vitali e non vitali15. Pertanto, le ricerche che richiedono informazioni sulle caratteristiche biologiche, come l'infettività del virus sulle cellule, non possono essere completate utilizzando le tecniche molecolari sopra menzionate; Sono necessari saggi in grado di misurare e determinare la presenza di virus vitali. I saggi che misurano l'infettività del virus includono il test di formazione della placca (PFA), la dose infettiva di coltura tissutale al 50% (TCID50), il test di focalizzazione fluorescente e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)12.

Il PFA, sviluppato da Renato Dulbecco nel 1952, è uno dei metodi più comunemente utilizzati per la titolazione del virus, anche per ZIKV16. Viene utilizzato per determinare direttamente le concentrazioni virali per i virioni litici infettivi. Il metodo si basa sulla capacità di un virus litico di produrre effetti citopatici (CPE; zone di morte cellulare o placche, un'area di infezione circondata da cellule non infette) in un monostrato di cellule inoculate dopo l'infezione virale. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti nel test che ne influenzano l'utilità. Il test richiede molto tempo (richiede circa 7-10 giorni, a seconda dei virus), dipende da CPE ed è soggetto a errori. Nel presente studio, riportiamo una tecnica immunocolorimetrica, il test di formazione del fuoco (FFA), per rilevare e quantificare ZIKV in formati di piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti.

Protocollo

1. Propagazione del virus

  1. Preparazione delle cellule
    1. Coltivare le cellule Vero in un matraccio da75 cm contenente 12 mL di terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 2 mM di L-glutammina (vedi Tabella dei materiali). Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
    2. Monitorare le cellule al microscopio; una volta che le celle raggiungono il 70%-90% di confluenza, sono pronte per essere utilizzate (Figura 1A).
      NOTA: Le celle Vero raddoppiano ogni 24 h17 circa. Le diluizioni di 1:10 dovrebbero richiedere da 3 a 4 giorni per raggiungere l'80%-90% di confluenza in un pallone da75 cm 2 . Monitora le cellule ogni giorno o a giorni alterni.
  2. Infezione del monostrato cellulare
    1. Rimuovere il terreno di coltura dal matraccio di coltura cellulare utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Sciacquare il matraccio con 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (dPBS) di Dulbecco 2 volte utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
      NOTA: Un becher con ipoclorito di sodio al 10% deve essere preparato per disinfettare eventuali rifiuti liquidi infettivi scartati da palloni/piastre.
    2. Aggiungere 2 mL di DMEM esente da siero (DMEM integrato con 2 mM di L-glutammina senza FBS) e 20 μL di inoculo ZIKV nel pallone di coltura cellulare. Incubare il matraccio con una leggera oscillazione per 1 ora a temperatura ambiente per consentire l'adsorbimento del virus.
      NOTA: La titolazione del grezzo iniziale di ZIKV sarà utile per determinare il volume dell'aggiunta dell'inoculo di ZIKV (fase 2).
      ATTENZIONE: ZIKV è classificato come patogeno di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Tutte le procedure con materiali contenenti ZIKV devono essere condotte in una cabina di biosicurezza certificata e seguire tutte le procedure operative standard di laboratorio (SOP) con adeguati dispositivi di protezione individuale.
  3. Aggiunta del supporto di sovrapposizione
    1. Dopo l'incubazione di 1 ora, rimuovere ed eliminare l'inoculo virale diluito utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml. Sciacquare il pallone di coltura cellulare con 3 mL di dPBS 2x.
    2. Aggiungere 12 mL di terreno di mantenimento (DMEM integrato con FBS al 2%, L-glutammina 2 mM e penicillina-streptomicina 100 U/mL) nel pallone di coltura cellulare per mantenere le cellule infette.
    3. Incubare le cellule Vero infette per 3 giorni in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: Monitorare quotidianamente la CPE delle cellule Vero infette al microscopio.
  4. Raccolta del surnatante per colture cellulari contenente ZIKV
    1. Il giorno 3 dopo l'infezione, si può osservare l'arrotondamento e il distacco delle cellule (CPE) (Figura 1B-D). Prelevare il surnatante della coltura cellulare contenente lo ZIKV in una provetta da centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
    2. Utilizzare un filtro per siringa in polietersulfone da 0,22 μm (vedere la tabella dei materiali) per filtrare il surnatante della coltura cellulare. Aliquotare 500 μL del surnatante filtrato per colture cellulari in provette con tappo a vite da 2,0 mL e conservare a -80 °C fino al successivo utilizzo.
      NOTA: Lo ZIKV raccolto può essere conservato a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
      ATTENZIONE: Se si utilizza un ago per siringa, è necessario prendere ulteriori precauzioni, poiché l'ago può perforare la pelle. È necessario stabilire le SOP di laboratorio.

2. Quantificazione del virus

  1. Preparazione delle cellule
    1. Seminare le cellule Vero in apposite piastre (piastra a 24 pozzetti: 0,5 ml/pozzetto, 7,5 x 104 cellule/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 0,1 ml/pozzetto, 1,5 x 104 cellule/pozzetto) e incubare la piastra per una notte in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: Ci sono cinque diversi punti temporali da testare (piastra a 24 pozzetti: 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore post-infezione; piastra a 96 pozzetti: 24 ore, 36 ore, 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione); Pertanto, prepara un piatto per ogni punto temporale.
    2. Dopo l'incubazione di 24 ore e una volta che le cellule raggiungono il 70%-90% di confluenza (Figura 1E), la piastra è pronta per l'infezione. Procedere alla preparazione del brodo virale diluito (fase 2.2) prima dell'infezione del monostrato cellulare.
  2. Diluizione del virus
    1. Per le piastre da 24 e 96 pozzetti, preparare sei provette sterili per microcentrifuga da 1,5 mL per ciascuna piastra per effettuare una diluizione decuplicata (da 10-1 a 10-5), incluso un controllo negativo. Per la configurazione dell'esperimento per una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 450 μL di DMEM privo di siero in tutte e sei le provette per microcentrifuga. Per la configurazione dell'esperimento per una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 135 μL di DMEM privo di siero in sei provette.
      NOTA: Etichettare chiaramente ogni provetta per indicare la diluizione del suo contenuto prima di eseguire la diluizione seriale decuplicata.
    2. Per eseguire la diluizione seriale, per la configurazione dell'esperimento su piastra a 24 pozzetti, aggiungere 50 μL di ZIKV raccolto dalla fase 1 nella provetta 10-1 che contiene 450 μL di DMEM privo di siero. Per la configurazione dell'esperimento su piastra a 96 pozzetti, aggiungere 15 μL di ZIKV nella provetta 10-1 che contiene 135 μL di DMEM privo di siero.
    3. Vorticare ogni provetta per mescolare il virus e il mezzo. Questa è la prima diluizione decuplicata.
      NOTA: Per garantire un'accurata diluizione seriale, è necessaria una corretta miscelazione del virus e del terreno di coltura in ciascuna provetta di diluizione.
    4. Per la configurazione dell'esperimento su piastra a 24 pozzetti, utilizzare un puntale di pipetta nuovo per risospendere la provetta 10-1 e trasferire 50 μL di ZIKV diluito nella provetta 10-2 come seconda diluizione decuplicata. Per la configurazione dell'esperimento su piastra a 96 pozzetti, utilizzare un puntale di pipetta nuovo per risospendere la provetta da 10-1 e trasferire 15 μL di ZIKV diluito nella provetta da 10-2 come seconda diluizione decuplicata.
    5. Ripetere il passaggio 2.2.4 quattro volte fino alla quinta provetta (escludere il controllo negativo).
      NOTA: Utilizzare un puntale per pipette nuovo dopo ogni fase di pipettaggio per evitare la contaminazione incrociata.
  3. Infezione del monostrato cellulare
    1. Rimuovere ed eliminare il terreno condizionato da ciascun pozzetto (piastra a 24 pozzetti: 0,5 ml/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 0,1 ml/pozzetto).
    2. Risciacquare ogni pozzetto con dPBS 2x (piastra a 24 pozzetti: 300 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 60 μL/pozzetto).
    3. Procedendo dalla diluizione più alta a quella più bassa, aggiungere ciascun inoculo virale diluito in serie nel pozzetto (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto).
      NOTA: L'infezione di ciascuna diluizione verrà eseguita in pozzetti duplicati. Mantenere due pozzetti non infetti come controllo negativo. Etichettare chiaramente la piastra e i pozzetti per evitare confusione. Sostituire i puntali delle pipette dopo ogni fase di pipettaggio per evitare la contaminazione incrociata.
    4. Incubare la piastra con un leggero dondolio per 1 ora a temperatura ambiente per consentire l'adsorbimento del virus.
  4. Aggiunta del terreno di coltura cellulare di copertura
    1. Dopo 1 ora di incubazione, rimuovere ed eliminare la sospensione virale dalla concentrazione più bassa a quella più alta.
    2. Lavare le cellule infette con dPBS 2x (piastra a 24 pozzetti: 300 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 60 μL/pozzetto).
    3. Sovrapporre il pozzetto con DMEM (integrato con FBS al 2%, L-glutammina 2 mM e penicillina-streptomicina 100 U/mL) e carbossimetilcellulosa a bassa viscosità all'1,5% (CMC; vedere la tabella dei materiali) (piastra a 24 pozzetti: 1 ml/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 0,2 ml/pozzetto).
    4. Incubare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 .
      NOTA: Non disturbare la piastra durante questo periodo di incubazione.
    5. Estrarre la piastra dall'incubatore per colture cellulari per la colorazione in diversi momenti (piastra a 24 pozzetti: 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione; piastra a 96 pozzetti: 24 ore, 36 ore, 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione).

3. Colorazione

  1. Fissazione cellulare
    1. Dopo le ore specifiche di incubazione (piastra a 24 pozzetti: 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione; piastra a 96 pozzetti: 24 ore, 36 ore, 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione), rimuovere ed eliminare il terreno di rivestimento e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS. Per la piastra a 96 pozzetti, rimuovere ed eliminare il mezzo di sovrapposizione e lavare le cellule 3 volte con 60 μL/pozzetto di 1 PBS con una pipetta multicanale.
    2. Aggiungere il 4% di paraformaldeide per fissare le cellule (piastra a 24 pozzetti: 300 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 60 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 min.
      ATTENZIONE: La paraformaldeide è una formaldeide polimerizzata solida. È una polvere cristallina bianca, solida e infiammabile che rilascia gas formaldeide quando viene miscelata con acqua o riscaldata. Tutte le procedure che prevedono l'uso di paraformaldeide devono essere condotte in una cappa chimica certificata o in involucri esaustivi approvati secondo le SOP di laboratorio specifiche per le sostanze chimiche contenenti formaldeide.
    3. Dopo 20 minuti, scartare la paraformaldeide e lavare le cellule 3 volte con 1 PBS. Eseguire la permeabilizzazione, il blocco e l'incubazione degli anticorpi seguendo i passaggi 3.2-3.5.
      NOTA: Quando si smaltisce la paraformaldeide al 4%, seguire la procedura di smaltimento dei rifiuti dell'università o dell'istituto.
  2. Permeabilizzazione cellulare
    1. Aggiungere l'1% di ottilfenossia poli(etilenossi)etanolo (vedere Tabella dei materiali) per permeabilizzare le cellule (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Dopo 15 minuti, scartare l'ottilfenossia poli(etilenossi)etanolo e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS.
  3. Inceppamento
    1. Aggiungere il 3% di latte scremato per ridurre il legame non specifico nel campione (piastra a 24 pozzetti: 500 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 100 μL/pozzetto). Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2 ore.
    2. Dopo 2 ore, scartare il latte scremato al 3% e lavare le cellule 3 volte con 1 PBS.
      NOTA: Questo è un punto di arresto. Dopo l'aggiunta del 3% di latte scremato, le piastre possono essere conservate a 4 °C fino a 2 giorni prima dell'inserimento degli anticorpi primari.
  4. Incubazione di anticorpi primari
    1. Aggiungere l'anticorpo monoclonale anti-flavivirus, 4G2 (clone D1-4G2-4-15; anticorpo primario, vedere la tabella dei materiali) diluito in latte scremato all'1% (rapporto 1:1.000) (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Incubare la piastra a 37 °C per 1 h.
    2. Dopo 1 ora, rimuovere la soluzione contenente l'anticorpo monoclonale e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS.
  5. Incubazione secondaria degli anticorpi
    1. Aggiungere l'anticorpo secondario IgG di capra anti-topo coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (vedere Tabella dei materiali) diluito in latte scremato all'1% (rapporto 1:1.000) (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Incubare le piastre a 37 °C per 1 h.
    2. Dopo 1 ora, rimuovere la soluzione contenente l'anticorpo secondario e lavare le cellule 3 volte con 1x PBS.
  6. Incubazione del substrato
    1. Aggiungere il substrato di perossidasi 3,3'diaminobenzidina (DAB) (vedere la tabella dei materiali) e incubare la piastra per 30 minuti al buio (piastra a 24 pozzetti: 200 μL/pozzetto; piastra a 96 pozzetti: 40 μL/pozzetto). Dopo 30 minuti, interrompere la reazione lavando i pozzetti con acqua.
    2. Asciugare le piastre all'aria durante la notte e procedere all'enumerazione dei focolai dopo che le piastre sono completamente asciutte.

4. Determinazione del titolo virale

  1. Processo di conteggio manuale dei focolai (formato a 24 pozzetti)
    1. I fuochi possono essere visualizzati al microscopio stereoscopico. Selezionare la diluizione che produce 50-200 fuochi.
    2. Contare i fuochi per ogni replica della diluizione selezionata. Calcolare il numero medio di focolai per ciascuna delle diluizioni selezionate.
    3. Calcolare l'unità formante focolai per mL (FFU/mL) per ciascun campione con la formula seguente: FFU/mL = numero medio di focolai contati/(diluizione x volume di virus diluito aggiunto).
  2. Processo automatizzato di conteggio dei focolai (formato a 96 pozzetti)
    1. Eseguire la scansione della piastra a 96 pozzetti su un analizzatore software commerciale.
      1. Fare doppio clic sul software (vedere la tabella dei materiali) per aprirlo.
      2. Fare clic su Switch Suites (Cambia suite) e assicurarsi che la suite sia passata a quella applicabile (Figura 1A supplementare). Fare clic su OK.
      3. Iniziare la scansione facendo clic su Scansione > Scansione dell'intera lastra (Figura 1B supplementare).
      4. Fare clic su Dashboard per assicurarsi che il formato di acquisizione sia il formato a 96 pozzetti (Figura 2A supplementare).
      5. Selezionare la modalità di centraggio come "Preallineamento automatico verificato dall'utente" (Figura 2B supplementare).
      6. Fare clic su Espelli per caricare la piastra.
        NOTA: Aprire il coperchio della piastra e posizionarla verso l'alto con la fila A in alto (Figura supplementare 3A).
      7. Immettere il nome della targa e fare clic su OK. Fare clic su Carica per caricare la piastra.
      8. Fare clic su Avvia per avviare la scansione. Successivamente, calibrare le posizioni per A1, A12 e H1 utilizzando i pulsanti "Su, Giù, Sinistra, Destra" e fare clic su Conferma (Figura supplementare 3B).
        NOTA: Il software inizierà la scansione di ogni pozzetto.
      9. Una volta completata la scansione, verrà visualizzata un'immagine panoramica. Fare clic su Chiudi.
      10. Esci dalla scansione facendo clic su Torna al centralino.
    2. Contare la piastra a 96 pozzetti utilizzando il software.
      1. Fare clic su Conteggio > Conteggio intelligente.
      2. Sul software, mostrerà "Passaggio 1 di 5: selezionare le piastre da contare". Fare clic su Caricare piastra/e. Spuntare l'intera cartella e fare clic su Seleziona per importare la lastra scansionata (Figura supplementare 4A).
      3. Sul software, mostrerà "Passaggio 2 di 5: definire i parametri di conteggio". Fare clic su Regola parametri e verranno visualizzati i parametri (processo diffuso; piccolo/normale/grande/più grande/più grande +1; separazione spot; area contata; bilanciamento dello sfondo; rimozione delle fibre; gating).
        NOTA: Iniziare con un pozzetto e controllare avanti e indietro per trovare le impostazioni migliori per tutti i pozzetti.
      4. Al termine, fare clic su Avanti (Figura 4B supplementare).
      5. Sul software, mostrerà "Passaggio 3 di 5: seleziona/deseleziona i pozzetti". Una volta completata la selezione del pozzetto da contare, cliccare su Avanti per procedere.
        NOTA: I pozzetti selezionati per il conteggio appariranno con una "C" nell'angolo in alto a destra di ciascun pozzetto (Figura supplementare 5A).
      6. Sul software, mostrerà "Passaggio 4 di 5: Impostazioni di output". Fare clic su Visualizza/Modifica impostazioni di output per verificare se le impostazioni (come il formato immagine) sono adatte. Fare clic su Salva ed esci > Avanti (Figura 5B supplementare).
      7. Sul software, mostrerà "Passaggio 5 di 5: avvia il conteggio automatico". Fare clic su Avvia conteggio automatico (Figura supplementare 6A).
      8. Una volta completato, fai clic su Esci dal conteggio automatico.
  3. Eseguire il controllo di qualità (QC) nell'analizzatore di software commerciale.
    1. Nella pagina del centralino, fare clic su Controllo qualità > Aggiungi piastra. Spuntare l'intera cartella per importare la piastra contata, fare clic su Seleziona > Avvia CQ (Figura 6B supplementare).
    2. Fare doppio clic su ciascun pozzetto per controllare i punti. Fare clic su Conteggio per rimuovere eventuali macchie. Il software inizierà a contare.
      NOTA: Assicurarsi che l'opzione "Macchie: Rimuovi" sia selezionata. Il completamento del conteggio può essere indicato dal numero contato di fuochi, ad esempio "30" (Figura supplementare 7A).
    3. Una volta terminato il conteggio (indicato dal numero contato di fuochi, ad esempio "30"), fare clic su "Sì" per rimuovere le macchie (Figura supplementare 7B). Fare triplo clic con il pulsante sinistro del mouse sul punto da rimuovere. Fare clic con il pulsante destro del mouse per terminare, quindi fare clic su Sì.
    4. Fare clic su Finish Plate e andare alla panoramica del progetto una volta completato il controllo qualità.
  4. Eseguire l'imaging utilizzando l'analizzatore software.
    1. Controllare l'immagine della piastra scansionata, conteggiata e QC (Figura 2).

Risultati

Lo ZIKV può essere quantificato utilizzando l'FFA, come illustrato schematicamente nella Figura 3. Per la piastra a 24 pozzetti, le cellule Vero infette sono state fissate a 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione. I risultati hanno mostrato che le cellule sono rimaste intatte (non è stato osservato alcun distacco cellulare) dopo 96 ore (4 giorni) dall'infezione (Figura 4 e Figura 8A-E supplementare). La comparsa di focolai vi...

Discussione

Esistono diversi test per determinare il titolo del virus; il PFA ha un protocollo di quantificazione del virus simile a quello dell'FFA, in cui l'inoculo virale viene diluito per consentire di distinguere le singole placche o focolai. Dopo la colorazione, ogni placca o focolai indica una singola particella infettiva nell'inoculo19. Il PFA è colorato con cristallo viola per visualizzare la formazione di placca causata dalla lisi o dalla morte cellulare. Quindi, il PFA richiede più tempo, in quan...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) e il finanziamento del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 di questo studio, che mostra il flusso di lavoro della colorazione per il test di formazione dei focolai, è adattata da "DAB Immunoistochemistry" di BioRender.com (2022). Estratto da https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filterSartoriusS6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tubeNest615601
10 mL sterile serological pipetteLabserv14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS)Gibco14190-136
2.0 mL Screw cap tube AxygenSCT-200-SS-C-S
24-well plateCorning3526
25 mL Sterile serological pipettesLabserv14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrateThermo Scientific34065
37 °C incubator with 5% CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL sterile serological pipetteLabserv14955155
50 mL centrifuge tubeFalconLAB352070
75 cm2 tissue culture flask Corning430725U
96-well plateFalcon353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS)N/AN/A22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class IIHoltenHB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot AnalyzerImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco12800-017
Fetal bovine serum (FBS)BovogenSFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP)MilliporeSigma12-349
HemacytometerLaboroptik LTDNeubauer improved
IGEPAL CA-630 detergentSigma-AldrichI8896Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscopeZEISSTELAVAL 31
Laboratory rockerFINEPCRCR300
L-GlutamineGibco25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC)Sigma-AldrichC5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL)Eppendorf3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL)Eppendorf3125000052
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Penicillin-streptomycinGibco15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL)Eppendorf3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL)Eppendorf3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL)Eppendorf3123000055
Skim milkSunlac Low FatN/APrepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium HypochloriteCloroxN/ATo disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
StereomicroscopeNikonSMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G NeedleTerumoSS10L21G
Vero African green monkey kidney cells -ECACC 88020401Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

Riferimenti

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