使用静态和动态方法相结合的方法评估有机过氧酸根除乳品生物膜的功效

摘要

该协议描述了一种结合静态和动态方法的方法，以评估有机过氧酸在乳制品行业中根除生物膜的功效。这种方法也可用于测试新的生物或化学配方控制生物膜的有效性。

摘要

乳制品行业中生物膜的存在是一个主要问题，因为它们对加工厂中经常使用的大多数原位清洗（CIP）程序具有很高的抵抗力，因此可能导致生产不安全和改变的乳制品。因此，为乳品行业开发新的生物膜控制策略势在必行。该协议旨在评估有机过氧酸（过氧乙酸，过丙酸和过乳酸以及基于过氧乙酸的商业消毒剂）使用静态和动态方法的组合根除乳制品生物膜的功效。使用最小生物膜根除浓度（MBEC）测定（一种静态高通量筛选方法）对所有生物膜或混合生物膜中最强的产生生物膜的细菌进行测试。与推荐浓度的消毒剂接触时间为5分钟，成功消除了单个和混合生物膜。目前正在进行研究，以使用疾病控制中心（CDC）生物膜反应器来证实这些观察结果，这是一种模拟 原位 条件的动态方法。这种类型的生物反应器可以使用不锈钢表面，该表面构成了大多数工业设备和表面。反应器的初步结果似乎证实了有机过氧酸对生物膜的功效。本研究中描述的组合方法可用于开发和测试用于控制生物膜和根除微生物的新生物或化学制剂。

引言

乳制品行业是全球主要工业部门，包括在加拿大，那里有超过 10，500 个奶牛场，每年生产近 9000 万升牛奶¹。尽管乳制品行业（包括加工厂）有严格的卫生要求，但牛奶是微生物的重要培养基，因此，乳制品可能含有微生物，包括腐败或病原微生物。这些病原体可引起各种疾病;例如，沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌可分别引起胃肠炎和脑膜炎²。腐败微生物可以通过产生气体、细胞外酶或酸来影响乳制品的质量和感官特性³.牛奶的外观和颜色也可能改变，例如通过假单胞菌spp.4。

其中一些微生物可以在不同的表面上形成生物膜，包括不锈钢。这种生物膜使微生物能够在设备表面持续存在和繁殖，从而污染乳制品⁵。生物膜也存在问题，因为它们能够阻碍传热并加速设备的腐蚀，导致设备过早更换，从而导致经济损失⁶。

原位清洗（CIP）程序使食品工业能够控制微生物的生长。这些程序涉及依次使用氢氧化钠、硝酸，有时还包括含有次氯酸和过氧乙酸^7，8 的消毒剂。次氯酸虽然对微生物非常有效，但它也会与天然有机物发生反应，导致有毒副产物^的形成9。过氧乙酸不产生有害副产物¹⁰;然而，它在食品工业中对生物膜的有效性变化很大^10，11。最近，已经研究了其他过氧酸，包括过丙酸和过乳酸的抗菌活性，它们似乎是控制生物膜中微生物生长的良好替代品^12，13。

因此，本研究旨在评估有机过氧酸（过氧乙酸、过丙酸和过乳酸以及基于过氧乙酸的消毒剂）根除乳品生物膜的功效，该方法结合了最小生物膜根除浓度 （MBEC） 测定、静态高通量筛选方法和美国疾病控制中心 （CDC） 生物膜反应器（一种模拟原 位 的动态方法 条件。MBEC测定在协议中以下称为"生物膜微量滴定板"。这里介绍的协议和代表性结果证明了有机过氧酸的功效及其在控制乳制品行业中微生物生物膜的潜在应用。

研究方案

本文所载的工作需要一个生物安全2级实验室，并已获得拉瓦尔大学机构生物安全委员会的批准（项目编号119689）。

注意:图1中的流程 图 总结了结合静态和动态方法的方法，该方法用于评估有机过氧酸根除生物膜的功效。

1. 材料准备

1. 微生物分离物
   1. 使用前15分钟打开生物安全柜（BSC），并用70%（v / v）酒精溶液清洁。
   2. BSC 无菌后，放置一瓶待测试的微生物分离物（本研究中为偶氮假单 胞菌或 短单胞 菌囊泡）、接种环、装有 10 mL 无菌胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 的 15 mL 管和涡旋混合器。在放入平衡计分卡之前，用酒精对所有材料进行消毒。
   3. 涡旋微生物分离物小瓶以使培养物均质化。
   4. 无菌地将 20 μL 微生物分离物转移到 15 mL 管中包含的 10 mL 无菌 TSB 中，并在 30 °C 下以 160 rpm 搅拌孵育 16-24 小时。
      注意: 水泡芽孢杆菌 必须按照处理病原微生物所需的指南在密闭 2 级实验室中使用。处理人员必须经过适当的培训，并且必须戴安全眼镜，手套和外套。
2. 消毒剂
   1. 要制备有机过氧酸溶液 （60 mL），将 24 mL 过氧化氢和 36 mL 酸（乙酸、丙酸或乳酸）加入 250 mL 锥形瓶中。然后，加入预定义体积的 10 M 硫酸（过氧乙酸为 655 μL，过丙酸为 635 μL，过乳酸为 715 μL）。轻轻摇动烧瓶进行混合，然后将烧瓶放入化学罩内设置的30°C水浴中。将烧瓶孵育2天，每天早上温和混合。
      注意:商用过氧乙酸消毒剂（见 材料表）由制造商直接提供。
      注意:消毒剂必须在化学罩下使用。在实验期间必须戴安全眼镜和手套。有关消毒剂的更多信息，请参阅相应的材料安全数据表。
   2. 按如下所述对过氧化氢进行滴定。
      1. 将一个空的300 mL烧杯放在分析天平上（参见 材料表）并去皮。将大约 0.23 克消毒剂装入烧杯中，并注意添加的确切重量。在烧杯中加入100g冷的1N硫酸溶液，在烧杯中加入磁力搅拌棒，并将其放在搅拌板上。
      2. 让溶液搅拌直至完全均质。然后，向烧杯中加入三滴铁指示剂溶液（H₂O中的0.1wt%），并用0.1N硫酸铈溶液滴定，直到溶液从鲑鱼粉红色变为浅蓝色。注意添加的硫酸铈溶液的体积。
      3. 使用以下公式计算过氧化氢的百分比:
         等式 （1）
         其中 S 是添加的硫酸铈溶液的体积，N 是硫酸铈溶液的正态性 （0.1 N），W 是样品的重量 （~0.2300 g），0.017 = （1 mol H 2 O 2/2 mol Ce） × （34.0147 g H 2 O 2 /1 mol H 2 O）₂× （1 L/1，000 mL）
   3. 按如下所述对有机过氧酸进行滴定。
      1. 将 20 mL 的 7.5% （w/v） 碘化钾溶液加入烧杯中。用0.1N硫代硫酸钠溶液缓慢滴定，直到溶液的蓝色开始变成浅棕色/橙色。
      2. 向烧杯中加入 2 mL 淀粉溶液（H₂O 中的 1 wt%），并用 0.1 N 硫代硫酸钠溶液滴定，直到溶液从黑色变为橙色。注意使用的硫代硫酸钠溶液的体积。
      3. 使用以下公式计算有机过氧酸的百分比:
         等式 （2）
         其中T是使用的硫代硫酸钠溶液的体积，N是硫代硫酸钠溶液的正常性（0.1 N），W是样品的重量（~0.2300g），0.038 = （1 mol CH 3 COOOH/1 mol I 2） × （1 mol I 2/2 mol S₂ O 3） × （76.06 g/1 mol CH₃COOOH） × （1 L/1，000 mL）
         注意:重复步骤1.2.2和步骤1.2.3，再用两个样品执行每个测试一式三份。

2. 形成单一和混合生物膜

1. 生物膜微量滴定板
   1. 涡旋含有细菌培养物的试管（20μL菌株+ 10mLTSB培养基，在步骤1.1.4中制备）。在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上进行连续稀释和铺板，以确定过夜培养物的细菌细胞计数（cfu）。然后，将 100 μL 培养物无菌转移到 10 mL 无菌 TSB 培养基中（终浓度约为 2 x 10⁷ cfu/mL）。
      注意:对于使用生物反应器的测定，将体积为 100 μL 的微生物分离物转移到 100 mL 无菌 TSB 中。
   2. 涡旋管。对于每种细菌，使用多通道移液器将稀释的细菌培养物一式三份转移到生物膜微量滴定板（每孔 150 μL）中。将 150 μL TSB 培养基加载到三个新孔中作为对照。将生物膜微量滴定板（参见 材料表）在30°C下孵育24小时而不搅拌。
      注意:对于混合生物膜测定，每种悬浮液加入 75 μL，总体积为 150 μL。生物膜微量滴定板在其盖子上包含钉子，在其上形成生物膜。
2. 生物反应器
   1. 按照制造商的说明清洁和风干生物反应器的部件（参见 材料表），然后按照如下所述继续制备反应器。
      1. 首先，将扁平刀片放置在 1 L 玻璃烧杯（生物反应器）内，该烧杯通过磁棒连接到其支架上，并通过安装在生物反应器盖内侧的塑料条将设置保持在直立位置。
      2. 使用螺丝刀将不锈钢试样或滑块（见 材料表）放在聚丙烯棒上，然后将它们插入盖子上的孔中，而无需将其定位销放在凹口中，以使蒸汽在灭菌过程中逸出。
      3. 用铝箔覆盖所有生物反应器通风口，并用铝箔包裹其余设备，即管子 L/S 18 （ID = 7.9 mm） 和 L/S 16 （ID = 3.1 mm）、玻璃流断裂、容器盖、螺丝刀、镊子和 0.2 μm 过滤器。
         注意: 将硅管（见 材料表）插入位于介质容器盖内表面的倒钩中。
      4. 高压灭菌生物反应器，在121°C下干循环20分钟。
   2. 以间歇模式（第一步）在生物反应器中进行生物膜形成。
      1. 在BSC中，将管L/S 18的一端连接到生物反应器的出口，并保持另一端用铝箔包裹以保持无菌。
      2. 从生物反应器盖上取下一个试样或载玻片支架，并将其放入无菌 50 mL 管中。然后，使用 50 mL 血清移液管将 340 mL 的 300 mg/L TSB 培养基填充到生物反应器的烧杯中，通过棒占据的孔。
      3. 使用 5 mL 移液管通过之前使用的相同孔口，用 1 mL 细菌溶液（~10⁸ cfu/mL 偶 氮甲酸疟原虫）接种生物反应器中的培养基，然后将棒放回其原始位置。将已放置在盖孔中的杆定位，使销钉适合其各自的凹口。
      4. 将0.2μm细菌空气吹扫过滤器放置在直径最小的管末端，该过滤器位于生物反应器的盖子上。另一根相同直径的管子仍然用金属螺帽或紧密关闭的硅胶塞永久堵塞。
      5. 将生物反应器放在设置在30°C的加热板上24小时，并以130rpm搅拌。
         注意:对于多物种生物膜的形成，使用等体积的不同细菌培养物以获得1mL的总接种物体积。
   3. 在生物反应器中以连续流动模式（第二步）形成生物膜。
      1. 将含有18 L无菌蒸馏水的大瓶放入BSC中，并加入2 L 1，000 mg / L TSB培养基以获得100 mg / L的终浓度。
      2. 用无菌盖盖住容器，两个管子连接到该盖子。第一个是固定在盖子内表面的硅胶管，用于泵送介质。第二根管（L/S 16）连接到外部端口，以允许液体流向生物反应器。将0.2μm过滤器放入培养基容器盖上的第二个管中。
      3. 将第二根管连接到蠕动泵，并将另一端连接到玻璃流断路，然后将其插入生物反应器盖上的较大管中。
      4. 使用另一个 20 L 大瓶收集生物反应器的流出物。将连接到生物反应器出口出水口的管端连接到废物容器的盖子上。将0.2μm过滤器插入该容器盖上的管中。
      5. 以 11.3 mL/min 的流速启动蠕动泵，并使系统运行 24 小时。
         注意:生物反应器中生物膜形成过程中使用的培养基或牛奶的流速（11.3mL / min）通过将340mL（对应于反应器内液体的体积）除以30分钟的停留时间来确定。
   4. 回收细菌生物膜。
      1. 关闭蠕动泵，停止搅拌和加热生物反应器。
      2. 小心地从生物反应器中取出每根棒，并在 40 mL PBS 中冲洗试样或载玻片 3 次以消除浮游细菌。之后，使用适当的螺丝刀将试样或玻片释放到含有 40 mL PBS 的无菌 50 mL 锥形管中。涡旋管30秒，将它们转移到放置在超声仪浴中的架子上，并以40 kHz的速度对管子进行超声处理30秒（这需要110 W的功率）。重复此操作 3 次。
      3. 将 40 mL 生物膜悬浮液收集在无菌 50 mL 锥形管中，然后用 2 mL 无菌 PBS 溶液冲洗试样或载玻片。回收这种漂洗液并将其添加到已经收集的生物膜悬浮液中。
   5. 枚举生物膜中的活细菌:使用获得的生物膜悬浮液，进行 10 倍连续稀释，然后将 100 μL 的 ^{10-5 和 10-6} 稀释液一式三份接种在 TSA 上。将板在30°C孵育24小时。计算琼脂平板上存在的菌落数，并根据ASTM E2562-17¹⁴使用以下公式计算试样和载玻片上的细菌密度（活无柄细菌）:
      等式 （3）
      其中 X 是菌落形成单位（CFU）的数量， B 是铺板的体积（0.1mL）， V 是生物膜悬浮的体积（储备溶液）， A 是被生物膜覆盖的试样或载玻片的表面， D 是稀释因子。

3. 有机过氧酸根除生物膜功效的定量评价

1. 生物膜微量滴定板
   1. 将 200 μL 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 加入到 96 孔微孔板的三个孔中。
   2. 将生物膜微孔板的盖子（带有在钉子上形成的生物膜）转移到含有PBS的96孔微孔板上10秒，以洗涤生物膜并消除浮游细菌。
   3. 准备所需浓度的消毒剂（例如，25 ppm、50 ppm、500 ppm、1，000 ppm、5，000 ppm、10，000 ppm 和 25，000 ppm）。
      注意:所有稀释液均使用无菌蒸馏水无菌进行。
   4. 将 200 μL 每种浓度的消毒剂加入新的 96 孔微量滴定板的孔中，一式三份。将生物膜微量滴定板的盖子转移到包含消毒剂的96孔微量滴定板上，并在室温下孵育板所需的暴露时间。
   5. 将 200 μL Dey-Engley 中和肉汤添加到新的 96 孔微量滴定板的孔中。将生物膜微量滴定板的盖子转移到含有中和肉汤的96孔微量滴定板上。用封口膜密封微量滴定板，并将其以40kHz置于浴超声仪中30分钟。
   6. 30分钟后，从超声仪中取出微量滴定板并去除封口膜。将 100 μL 从包含超声处理后分离的生物膜的 96 孔板的第一列转移到新的 96 孔微量滴定板的第一排。
   7. 将 180 μL 无菌 1x PBS 加入新的 96 孔微孔板（在步骤 3.1.6 中制备）的孔中，第一行除外。将 20 μL 生物膜溶液从第一行转移到含有 180 μL 1x PBS 的第二行孔中（第 2 行，稀释度:10⁻¹）。然后，将第二行中所含的 20 μL 液体转移到下一行中含有 180 μL 1x PBS（第 3 行，稀释度:10⁻²）的孔中。重复相同的步骤以获得^10-5和10-7之间的稀释度。
   8. 在TSA上接种100μL稀释液，并根据每种细菌生长所需的参数孵育板。
   9. 孵育后，计数cfus并使用以下公式计算每个PEG的log 10密度和每个消毒剂浓度下的log₁₀减少:
      等式 （4）
      其中 X 是点中计数的菌落形成单位， B 是铺板体积（0.01mL）， V 是孔体积（0.20mL）， A 是钉表面积（46.63mm²）， D 是稀释度。
      等式 （5）
   10. 在独立的日子重复每个实验 3 次。
       注意:"消除生物膜的消毒剂的最低浓度"或MBEC对应于没有细菌生长的最低消毒剂浓度。
2. 生物反应器
   注意:遵循ASTM标准E2871-19¹⁵ 的程序对 偶氮假单胞菌 PFlA1进行此测试。
   1. 首先在生物反应器的试样上形成生物膜，如步骤2.2所述。然后，取下固定试样的杆，并在含有 30 mL PBS 的锥形管内冲洗。
   2. 使用螺丝刀将每张试样放入无菌 50 mL 锥形管中，然后加入 4 mL 适当的有机过氧酸溶液或 PBS 用于对照。孵育 5 分钟，然后加入 36 mL Dey-Engley 中和肉汤。涡旋30秒，然后使用超声仪浴以40 kHz超声处理30秒。重复该过程3x以获得生物膜悬浮液。
   3. 同样，冲洗所有其他棒并从试样中回收生物膜。在TSA培养基上连续稀释生物膜悬浮液和板0.1 mL。将板在30°C孵育24小时。
   4. 孵育后，计数cfus，然后计算每个试样的生物膜密度（方程6），来自同一棒的每组三个试样的平均对数密度（LD），包括处理和对照（方程7），以及消毒剂的对数减少（方程8）使用以下公式:
      等式 （6）
      其中 X 是计数的菌落形成单位/试样的平均值， B 是铺板的体积（0.1mL）， V 是消毒剂或PBS加中和剂的体积（40mL）， D 是稀释液。
      等式 （7）
      等式 （8）

4. 有机过氧酸根除生物膜功效的定性评价

注意:用消毒剂处理后（步骤3.1.1至步骤3.1.5），制备静态方法中在生物膜微量滴定板的钉子上形成的偶 氮假单胞菌 生物膜，并通过扫描电子和共聚焦显微镜观察进行分析。

1. 扫描电子显微镜
   1. 将 200 μL 1x PBS 加入 96 孔微孔板的三个孔中。将盖子从生物膜微量滴定板（步骤3.1.5）转移到含有PBS的96孔微孔板上，并在室温下放置10秒以消除Dey-Engley中和肉汤。
   2. 使用无菌的针鼻钳从生物膜微量滴定板上取下钉子。将每个钉子放入罩下的空小瓶中，并向每个小瓶中加入初级固定剂（0.1M 二甲胂酸钠缓冲液pH 7.5中的5%戊二醛）。盖上每个小瓶并在4°C下孵育24小时。
   3. 孵育后，用移液管倒出固定剂，并将所有液体废物丢弃在适当的容器中。取下每个小瓶的盖子，并将它们放在罩子中风干72小时。
   4. 通过将环氧树脂（见材料表）涂在每根短管的平坦上表面，将样品安装在铝短管上（见材料表）。然后，用镊子小心地将钉子固定在存根上。
   5. 用 EMS950x + 350s 金溅射（参见 材料表）在 2 x 10⁻¹ bar 氩气压力和 20 mA 电流下金属化样品 4 分钟。通过用银漆将钉子的侧面涂在未暴露于金的侧面来进行适当的接地（参见 材料表）。
   6. 使用SEM控制用户界面版本6.28在扫描电子显微镜上获取图像（参见 材料表）。本研究中使用的加速电压为15 kV，放大倍数分别为300倍和2，000倍。
2. 共聚焦显微镜
   1. 将 200 μL 1x PBS 加入 96 孔微量滴定板的三个孔中。将盖子从生物膜微孔板转移到含有PBS的96孔板中，并放置10秒以消除Dey-Engley中和肉汤。
   2. 通过将 3 μL 绿色荧光染料和 3 μL 红色荧光染料（参见 材料表）加入 1 mL 无菌水中来制备荧光染料溶液。
   3. 将 200 μL 染色溶液加入 96 孔微量滴定板的一个孔中。将盖子从生物膜微量滴定板转移到含有染色溶液的96孔板中。用铝箔覆盖生物膜微量滴定板，并在室温下孵育样品20-30分钟。
   4. 将 200 μL 灭菌水加入 96 孔微孔板的孔中。然后，将盖子从生物膜微孔板转移到含有水的96孔微孔板上，并放置直到观察。
   5. 使用共聚焦激光扫描显微镜（参见 材料表）和63x / 1.40油DIC物镜可视化在钉子上形成的生物膜。使用相关软件获取图像（参见 材料表）。用于绿色和红色荧光染料的荧光激发波长分别为482 nm和490 nm。
      注意:为获得最佳效果，请将钉子切开并放入60毫米培养皿中，然后用无菌水填充培养皿。

结果

SEM分析显示生物膜微孔板钉上存在由偶氮假单胞菌PFl1A产生的生物膜（图2A）。可以观察到三维生物膜结构。P. azotoformans PFl1A先前被确定为使用96孔微量滴定板¹²的强大生物膜生产者（A₅₇₀>1.5）。

此外，使用生物反应器在不锈钢载玻片上形成的偶氮福曼斯PFl1A生物膜似乎非常致密，并显示出具有三维结构的成熟...

讨论

MBEC测定（生物膜微孔板测定）是第一种被ASTM¹⁷认可为标准生物膜根除测试的方法。我们的研究和其他研究表明，使用该测定时有两个关键步骤:超声处理步骤（时间和功率）和消毒剂处理时间¹⁸。斯图尔特和帕克还提出了可能影响测定结果的其他参数，例如微生物种类，生物膜年龄，表面积/体积比等。¹⁹. 最后，重要的是要注意，微孔板盖上的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm filters	Corning	09-754-28	diameter: 50 mm, PTFE- Membrane
316 stainless-steel disc coupon	Biosurface Technologies Corporation	RD128-316
316 stainless-steel slide coupon	Biosurface Technologies Corporation	CBR 2128-316
96-microtiter plate	Corning	07-200-89	cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate
Acetic acid	Sigma Aldrich	27225	store at RT
Aluminium stubs	Electron Microscopy Science	75830-10	32x5mm
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25%	Electron Microscopy Sciences	16220	store at -20 °C
AB204-S/FACT Analytical balance	Mettler Toledo	AB204-S
Bacterial Vent Filter (0.45 µm)	Biosurface Technologies Corporation	BST 02915
BioDestroy	Groupe Sani Marc	09-10215	commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT
Carboy LDPE 20 L	Cole Parmer	06031-52
CDC biofilm reactor	Biosurface Technologies Corporation	CRB 90	bioreactor
Cerium (IV) sulphate	Thermo Scientific	35650-K2	store at RT
Confocal laser scanning microscope  LSM 700	Zeiss	LSM 700
Dey-Engley neutralizing broth	Millipore	D3435-500G	store at 4 °C
EMS950x + 350s gold sputter	Electron Microscopy Sciences
Epoxy resin	Electron Microscopy Sciences	14121	with BDMA
Ethyl alcohol 95%, USP	Greenfield global	P016EA95	store at RT
Ferroin indicator solution	Sigma Aldrich	318922-100ML	store at RT
Filling/venting cap	Cole Parmer	RK-06258-00
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit	Invitrogen	L10316	fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at - 20 °C
Glass flow break	Biosurface Technologies Corporation	FB 50
Gold with silver paint	Electron Microscopy Sciences	12684-15
Heating plate set	Biosurface Technologies Corporation	110V Stir Plate
Hex screwdriver	Biosurface Technologies Corporation	CBR 5497
Hydrogen peroxide	Sigma	216763	store at 4 °C
Inoculating loops	VWR	12000-812	sterile, 10 µl
Lactic acid	Laboratoire MAT	LU-0200	store at RT
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head	Cole Parmer	77200-60
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base	Innovotech	19111	Biofilm microtiter plate
Oxford agar base	Thermo Scientific	OXCM0856B	store at 4 °C
Plastic coupon holder	Biosurface Technologies Corporation	CBR 2203
Plastic slide holder rod	Biosurface Technologies Corporation	CBR 2203-GL
Potassium iodide	Fisher Chemical	P410-500	store at RT
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm)	Wiha	26015
Propionic acid	Laboratoire MAT	PF-0221	store at RT
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance	Cole Parmer	UZ-11976-3
Scanning electron microscope JSM-6360LV model	JEOL	JSM-6360LV	SEM and user control interface
Screw cap tube, 15 mL	Sarstedt	62.554.205	(LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Screw cap tube, 50 mL	Sarstedt	62.547.205	(LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE
Sodium Cacodylate Trihydrate	Electron Microscopy Sciences	12300	store at -20 °C
Sodium thiosulfate	Thermo Scientific	AC124270010	store at RT
Sonication bath	Fisher	15-336-122	5,7 L
Starch solution	Anachemia	AC8615	store at RT
Sulfuric acid	Sigma Aldrich	258105-500ML	store at RT
Tryptic soy agar	BD Bacto	DF0369-17-6	store at RT
Tryptic soy broth	BD Bacto	DF0370-17-3	store at RT
Tubing Masterflex L/S 16 25'	Cole Parmer	MFX0642416
Tubing Masterflex L/S 18 25'	Cole Parmer	MFX0642418
Tygon SPT-3350 silicon tubing	Saint-Gobain	ABW18NSF	IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in.
Vortex	Cole Parmer	UZ-04724-00
Water bath	VWR	89202-970
Zen software	Zeiss