研究多孔介质中生物堵塞的微流体平台

摘要

本协议描述了一个微流体平台，通过将高分辨率显微镜成像与同时压差测量相结合来研究 准二维多孔介质中的生物膜发展。该平台量化了多孔介质中孔径和流体流速对生物堵塞的影响。

摘要

细菌生物膜存在于几种环境和工业多孔介质中，包括土壤和过滤膜。生物膜在某些流动条件下生长并会堵塞孔隙，从而改变局部流体流动的方向。生物膜堵塞孔隙的能力，即所谓的生物堵塞，会对多孔介质的局部渗透性产生巨大影响，在系统中产生压力积聚，并影响通过它的质量流。为了了解生物膜生长与流体流动在不同物理条件下（例如，在不同的流速和孔径下）之间的相互作用，在本研究中，开发了一个微流体平台，以在外部施加的受控物理条件下使用显微镜可视化生物膜的发展。可以使用压力传感器同时测量多孔介质中生物膜引起的压力积聚，然后与生物膜的表面覆盖率相关联。所提出的平台为研究流动条件下多孔介质中生物膜引起的生物堵塞的系统方法提供了基线，并且可以适用于研究环境分离物或多物种生物膜。

引言

生物膜 - 嵌入自分泌的超聚合物物质（EPS）基质中的细菌菌落 - 在天然多孔介质中无处不在，例如土壤和含水层¹，以及技术和医疗应用，例如生物修复²，水过滤³和医疗设备⁴。生物膜基质由多糖、蛋白质纤维和细胞外 DNA⁵，⁶ 组成^，并且在很大程度上取决于微生物、营养物质的可用性以及环境条件⁷。然而，矩阵的功能是通用的;它形成生物膜结构的支架，保护微生物群落免受机械和化学应力的影响，并且主要负责生物膜的流变特性⁵。

在多孔介质中，生物膜的生长会堵塞毛孔，导致所谓的生物堵塞。生物膜的形成由流体流动和孔径控制，定义为多孔介质⁸，^9，10的两根支柱之间的距离。孔径和流体流量都控制着养分的输送和局部剪切力。反过来，生长的生物膜堵塞孔隙，影响流体¹¹，12，¹³的速度分布，质量传递和多孔介质^14，15的导水率。水力传导率的变化通过密闭系统中压力的增加反映出来¹⁶，¹⁷，^18，19。目前生物膜开发和生物堵塞的微流体研究集中在研究均匀几何形状¹⁶，20（即具有单一孔径）或异质多孔介质¹²，^21，22中的流速的影响。然而，为了解开流速和孔径对生物膜发育的影响以及生物堵塞多孔介质中由此产生的压力变化，需要一个高度可控和多功能的实验平台，可以并行研究不同的多孔介质几何形状和环境条件。

本研究引入了一种微流体平台，该平台将压力测量与多孔介质内不断发展的生物膜同时成像相结合。由于其透气性、生物相容性和通道几何形状设计的灵活性，由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的微流体装置是研究多孔介质中生物膜发育的合适工具。微流体允许高精度地控制物理和化学条件（例如，流体流动和营养浓度），以模拟微生物栖息地的环境²³.此外，微流体装置可以使用光学显微镜以微米分辨率轻松成像，并与在线测量（例如，局部压力）相结合。

在这项工作中，实验的重点是研究在受控的强加流动条件下均匀多孔介质模拟中孔径的影响。使用注射泵施加培养基的流量，并通过压力传感器同时测量通过微流体通道的压差。通过在微流体通道中播种 枯草芽孢 杆菌的浮游培养物来启动生物膜开发。对不断发展的生物膜进行定期成像和图像分析，可以在各种实验条件下获得有关表面覆盖的孔隙尺度分辨信息。压力变化和生物堵塞程度的相关信息为生物堵塞多孔介质的渗透率估计提供了重要的输入。

研究方案

1. 硅片制备

1. 在计算机辅助设计（CAD;见 材料表）软件中设计微流体通道的几何形状，并将其打印到透明薄膜上以创建光掩模（图1A）。
2. 按照以下步骤通过软光刻（在洁净室条件下）制造母模。
   1. 将硅片在200°C下烘烤2小时。
   2. 将晶圆放在旋涂机的中心，然后将SU8 3050光刻胶（见 材料表）倒在晶圆上。以 1，700 rpm 的速度旋转涂层 40 秒，坡道时间为 10 s/100 rpm。
      注意: 旋转涂层参数设置为获得 SU8 3050 的 100 μm 目标厚度。
   3. 旋涂过程后，将硅片在65°C下软烘烤600秒，在95°C下软烘烤2，700秒。让晶圆在室温下冷却过夜。
      注意:过夜冷却增强了SU8对晶圆的附着力。
   4. 将光掩模（步骤1.1）放在晶圆上并将其暴露在紫外光下，曝光能量为250 mJ / cm² ，波长为350 nm。
   5. 曝光后，将暴露的基材在65°C下烘烤60秒，在95°C烘烤300秒。
   6. 通过将硅晶圆浸入装有mrDev600显影剂的烧杯中来开发硅晶圆以获得主模具（参见 材料表）。轻轻摇晃烧杯1，800秒以洗掉未聚合的抗蚀剂。然后，通过在硅片上喷洒异丙醇并风干来飞溅洗涤。
   7. 将硅晶片在200°C下硬烤1，800秒。
3. 通过在真空干燥器中将20μL三氯（1H，1H，2H，2H-全氟辛基）硅烷（参见材料表）气相沉积在模具旁边的载玻片上40分钟，产生100mbar的 表压，使母模硅烷化。

2. 微流控装置的制造

注意:此处描述的制造程序适用于具有一个微流体通道的微流体装置。然而，相同的方法可以应用于制造具有多个微流控通道并联的微流控装置。

1. 将弹性体与其交联剂以10:1的比例混合（参见 材料表）以制备PDMS混合物。搅拌混合物，直到它均匀混合并因封闭的气泡而变得不透明。
2. 在真空干燥器中对混合物进行脱气，产生 100 mbar 的表压，直到夹留的气泡被去除并且看起来透明。脱气所需的时间通常为30分钟。
3. 将母模（步骤1）放入细胞培养皿中（见 材料表）。将 20 g PDMS 混合物倒在母模上，以生产最终厚度为 5 mm 的通道。
4. 将母模在70°C烘烤2小时。
5. 使用刀片在微流体通道周围（距离约3mm）切割固化的PDMS，然后将PDMS微流体通道从母模上剥离。
6. 为了创建微流体通道的入口和出口，在其末端（三角形顶部，见 图1A）处用活检打孔（直径为1.5毫米）。在入口三角形的中心再打一个孔，以便稍后安装压力传感器。
7. 用市售的1%洗涤剂溶液（参见 材料表）洗涤载玻片和微流体通道5分钟，然后用去离子水冲洗。此后，用异丙醇洗涤PDMS微流体通道和载玻片。然后，用去离子水再次冲洗。用1巴的压缩空气干燥PDMS微流体通道和载玻片1分钟。
   注意:PDMS的多孔结构必须完全干燥才能有效粘合。
8. 将载玻片和微流体通道放入等离子清洁器中（参见 材料表），并确保要粘合的表面朝上。打开等离子清洁器，用空气等离子体以1 SL / h（每小时标准升）的气流处理微流体通道和载玻片1分钟。将微流体通道从清洁器中取出后，立即将它们相互接触，将它们粘合到载玻片上。
   注意:确保不要接触处理过的表面，因为这可能会影响粘合。在制造具有多个微流控通道的微流控装置时，同时暴露微流控通道并将它们粘合在一个步骤中。
9. 将粘合的微流体装置放在80°C热板上至少15分钟。
10. 将微流体装置储存在干净的细胞培养皿中，直到实验开始。

3.细菌悬浮液的制备

1. 在实验开始前20小时培养枯 草芽孢杆菌 NCIB 3610群体，方法是直接从15mL培养管中的冷冻甘油原液中接种3mL营养肉汤3号培养基（参见 材料表）。在振荡培养箱中以30°C和200rpm孵育过夜（16小时）。
2. 在实验开始前 4 小时从过夜培养物中制备传代培养物，方法是在 15 mL 培养管中的 3 mL 新鲜培养基（1:1，000 稀释度）中加入 3 μL 过夜培养物。将传代培养物在30°C的振荡培养箱中以200rpm孵育3.5-4小时，以获得600nm处的光密度（OD₆₀₀）为0.1。

4. 生物膜生长实验

1. 在实验前3小时打开显微镜的箱式培养箱，以确保温度稳定在25°C。 安装注射泵和压力传感器（见 材料表）。
2. 将入口和出口管连接到微流体装置。直接将针头（外径为0.6毫米）插入入口管中，以确保管子和注射器之间的连接。
3. 将微流体装置，30mL去离子水和30mL培养基置于真空干燥器中并脱气至少1小时。然后，缓慢地将培养基和去离子水拉入两个单独的 30 mL 注射器中。
   注意:此步骤对于防止在使用培养基冲洗时在通道中形成气泡至关重要。
4. 将微流体装置安装在显微镜上，并将出口管放入废物容器中。
   1. 通过微流体管将装满去离子水的注射器连接到微流体通道，然后缓慢注入水，直到水从压力传感器出口流出。用水填充压力传感器，并冲洗连接微流体通道和压力传感器的管道中的所有气泡。用专用于压力传感器的螺钉关闭压力传感器的出口。
      注意:所描述的填充程序可确保精确记录微流体通道入口处的压力变化。当使用多个微流体通道进行实验时，将每个通道连接到单独的注射器，以确保所有通道中的流动条件相同。
5. 用去离子水填充微流体通道的其余部分。
6. 在培养基注射器上放置1.2μm过滤器（见 材料表）。然后，取出水注射器并小心地将培养基注射器连接到入口微流体管。将注射器安装在注射泵上，并以2mL / h的流速用培养基冲洗通道1小时。
   注意:过滤器可防止细菌细胞在装载过程中进入注射器。用培养基冲洗微流体通道将去除多孔结构中剩余的气泡。
7. 在实验过程中将注射泵设置为所需的流速（此处为1 mL / h），并将压力传感器的压力读数设置为零。
   注意:通过将初始压力读数设置为零，将仅测量实验期间由生物膜发育引起的压力差。
8. 在 1.5 mL 离心瓶中以 OD₆₀₀ 的 0.1 吸取 1 mL 细菌培养物。通过将出口管放入离心机小瓶中，将细菌培养物加载到微流体通道中。等待 5 分钟以去除管出口中的任何潜在气泡后，以 1 mL/h 的流速提取 150 μL 细菌溶液，直到微流体通道充满细菌培养物。
9. 小心地取出培养基注射器过滤器并将出口放入废物容器中。将细菌细胞在微流体通道中的零流条件下放置3小时，以允许它们在多孔介质中的表面附着。
   注意:将细菌细胞置于零流量条件下3小时，针对所用细菌菌株的附着进行了优化，同时确保氧合良好的细菌培养物。其他细菌菌株可能需要或多或少的时间。
10. 要开始实验，通过将注射泵设置为所需的流速（此处为1 mL / h）来启动流量，并以1 Hz开始压力读数。
11. 以所需的时间间隔、光学配置和放大倍率获取生长生物膜的图像。
    注意:在本研究中，每6分钟采集一次4倍放大倍率的图像，在明场模式下跨越多孔介质的整个域的18个位置，持续24小时。

5. 图像分析

1. 通过使用图像分析软件（参见 材料表）和拼接算法²⁴，从18个位置拼接图像，从记录的图像序列重建整个多孔介质。
2. 将拼接的图像序列另存为单个图像序列。
   注意:如果文件太大，此时可以将图像重新缩放并装箱为合理的大小以进行进一步处理。
3. 创建多孔介质支柱的掩码以将其从分析中移除。
4. 通过将图像的背景除以背景与在t = 0小时拍摄的图像（图2A）来去除图像的背景，并在适合分割生物膜的阈值下将图像二值化（图2B）。
5. 通过计算生物膜覆盖的面积（归因于生物膜的像素数）与多孔域的空隙面积（图3）相比，计算生物膜的饱和度。

结果

在本研究中，使用具有三个具有不同孔径的平行微流控通道的微流控装置（图1）系统地研究多孔介质中生物膜的形成。使用明场显微镜可视化生物膜形成过程。细菌细胞和生物膜在图像中显示为较暗的像素（图2）。此外，观察到逐渐堵塞的过程;在24小时的实验中，最初随机生长的生物膜定植了几乎整个多孔介质。

在 Q = 1 mL...

讨论

微流体多孔介质类似物与压力传感器相结合，为研究多孔介质中的生物膜发展提供了合适的工具。微流体多孔介质设计的多功能性，特别是柱子的排列，包括直径、不规则形状和孔径，允许研究许多几何形状。这些几何形状的范围从单个孔隙到高度复杂、不规则排列的障碍物，模仿不同的自然（例如土壤）和工业（例如膜和过滤器）多孔介质。在目前的微流体平台中，创建了三种多孔介质几何形?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer