פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר סתימה ביולוגית במדיה נקבובית

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה מיקרופלואידית לחקר התפתחות ביופילם במדיה נקבובית כמו-דו-ממדית על ידי שילוב של דימות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה עם מדידות הפרשי לחצים בו זמנית. הפלטפורמה מכמתת את ההשפעה של גודל הנקבוביות וקצב זרימת הנוזלים במדיה נקבובית על סתימה ביולוגית.

Abstract

ביופילמים חיידקיים נמצאים במספר מדיות נקבוביות סביבתיות ותעשייתיות, כולל קרקעות וקרומי סינון. ביופילמים גדלים בתנאי זרימה מסוימים ויכולים לסתום נקבוביות, ובכך לכוון מחדש את זרימת הנוזל המקומית. היכולת של ביופילמים לסתום נקבוביות, מה שמכונה ביו-סתימה, יכולה להיות בעלת השפעה עצומה על החדירות המקומית של התווך הנקבובי, ליצור הצטברות לחץ במערכת ולהשפיע על זרימת המסה דרכו. כדי להבין את יחסי הגומלין בין צמיחת ביופילם וזרימת נוזלים בתנאים פיזיקליים שונים (למשל, במהירויות זרימה שונות ובגדלים שונים של נקבוביות), במחקר הנוכחי פותחה פלטפורמה מיקרופלואידית כדי להמחיש התפתחות ביופילם באמצעות מיקרוסקופ בתנאים פיזיקליים חיצוניים ומבוקרים. ניתן למדוד את הצטברות הלחץ הנגרמת על ידי ביופילם בתווך הנקבובי בו זמנית באמצעות חיישני לחץ, ומאוחר יותר, בקורלציה עם כיסוי פני השטח של הביופילם. הפלטפורמה המוצגת מספקת בסיס לגישה שיטתית לחקר סתימות ביולוגיות הנגרמות על ידי ביופילמים במדיה נקבובית בתנאי זרימה, וניתן להתאים אותה לחקר מבודדים סביבתיים או ביופילמים מרובי מינים.

Introduction

ביופילמים - מושבות חיידקים המשובצות במטריצה מפרישה עצמית של חומרים חוץ-פולימריים (EPS) - נמצאות בכל מקום במדיה נקבובית טבעית, כגון קרקעות ואקוויפרים¹, וביישומים טכניים ורפואיים, כגון טיפול ביולוגי², סינון מים³ ומכשירים רפואיים⁴. מטריצת הביופילם מורכבת מרב-סוכרים, סיבי חלבון ודנ"א חוץ-תאי^5,6, והיא תלויה מאוד במיקרואורגניזמים^, בזמינות חומרי המזון ובתנאי הסביבה⁷. עם זאת, הפונקציות של המטריצה הן אוניברסליות; הוא מהווה את הפיגום של מבנה הביופילם, מגן על קהילת החיידקים מפני לחצים מכניים וכימיים, ואחראי במידה רבה לתכונות הריאולוגיות של הביופילמים⁵.

במדיה נקבובית, הצמיחה של ביופילמים יכולה לסתום נקבוביות, מה שגורם למה שנקרא bioclogging. התפתחות הביופילם נשלטת על ידי זרימת הנוזל וגודל הנקבוביות, המוגדר כמרחק המפריד בין שני עמודים, של התווך הנקבובי 8,9,10. הן גודל הנקבוביות והן זרימת הנוזלים שולטים בהובלת החומרים המזינים ובכוחות הגזירה המקומיים. בתורו, הביופילם הגדל סותם נקבוביות, ומשפיע על התפלגות המהירות של הנוזל 11,12,13, על הסעת ההמונים ועל המוליכות ההידראולית של התווך הנקבובי ^14,15. השינויים במוליכות הידראולית משתקפים באמצעות לחץ מוגבר במערכות סגורות^16,17,18,19. מחקרים מיקרופלואידים עכשוויים בפיתוח ביופילם וסתימה ביולוגית מתמקדים בחקר ההשפעה של מהירויות זרימה בגיאומטריות הומוגניות^16,20 (כלומר, עם גודל נקבוביות יחיד) או מדיה נקבובית הטרוגנית^12,21,22. עם זאת, כדי להתיר את ההשפעות של קצבי הזרימה וגודל הנקבוביות על התפתחות הביופילם ושינויי הלחץ הנובעים מכך בתווך הנקבובי הסתום, נדרשת פלטפורמה ניסיונית רב-תכליתית וניתנת לשליטה המאפשרת לחקור גיאומטריות מדיה נקבוביות שונות ותנאי סביבה במקביל.

המחקר הנוכחי מציג פלטפורמה מיקרופלואידית המשלבת מדידות לחץ עם הדמיה סימולטנית של הביופילם המתפתח בתווך הנקבובי. בשל חדירות הגז, התאימות הביולוגית והגמישות שלו בתכנון גיאומטריית התעלה, התקן מיקרופלואידי העשוי מפולידימתילסילוקסאן (PDMS) הוא כלי מתאים לחקר התפתחות ביופילם במדיה נקבובית. מיקרופלואידיקה מאפשרת בקרה של תנאים פיזיקליים וכימיים (למשל, זרימת נוזלים וריכוז חומרי מזון) בדיוק גבוה כדי לחקות את הסביבה של בתי גידול מיקרוביאליים²³. יתר על כן, התקנים מיקרופלואידים ניתן בקלות לצלם עם רזולוציה מיקרומטרית באמצעות מיקרוסקופ אופטי בשילוב עם מדידות מקוונות (למשל, הלחץ המקומי).

בעבודה זו, הניסויים מתמקדים בחקר ההשפעה של גודל הנקבוביות בתווך נקבובי הומוגני אנלוגי בתנאי זרימה כפויים מבוקרים. זרימת מדיום תרבית מוטלת באמצעות משאבת מזרק, והפרש הלחצים דרך התעלה המיקרופלואידית נמדד בו זמנית באמצעות חיישני לחץ. פיתוח ביופילם מתחיל על ידי זריעת תרבית פלנקטונית של Bacillus subtilis בתעלה המיקרופלואידית. הדמיה סדירה של הביופילם המתפתח וניתוח התמונה מאפשרת לקבל מידע מפוענח בקנה מידה נקבובי על כיסוי פני השטח בתנאי ניסוי שונים. המידע המתואם של שינוי הלחץ והיקף הסתימה הביולוגית מספק קלט חיוני להערכות חדירות של מדיה נקבובית סתומה ביולוגית.

Protocol

1. הכנת פרוסות סיליקון

1. עצבו את הגיאומטריות של התעלה המיקרופלואידית בתוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD; ראו טבלת חומרים) והדפיסו אותה על סרט צילום שקוף כדי ליצור את מסיכת הפוטו (איור 1A).
2. ייצרו את תבנית האב על ידי ליתוגרפיה רכה (בתנאי חדר נקי) לפי השלבים הבאים.
   1. אופים את רקיק הסיליקון בטמפרטורה של 200°C למשך שעתיים.
   2. הניחו את רקיק הפרוסות במרכז ציפוי מסתובב ושפכו את ה-photoresist SU8 3050 (ראו טבלת חומרים) על הפרוסה. מעיל מסתובב ב-1,700 סל"ד למשך 40 שניות עם זמן רמפה של 10 שניות ל-100 סל"ד.
      הערה: פרמטרי ציפוי הספין הוגדרו להשגת עובי יעד של 100 מיקרומטר עבור SU8 3050.
   3. לאחר תהליך הציפוי המסתובב, אפו ברך את רקיק הסיליקון בטמפרטורה של 65°C למשך 600 שניות ו-95°C במשך 2,700 שניות. תנו לרקיק להתקרר בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
      הערה: קירור הלילה משפר את ההיצמדות של SU8 לרקיק.
   4. הניחו את מסיכת הפוטו (שלב 1.1) על הפרוסת וחשפו אותה לאור UV, עם אנרגיית חשיפה של 250 mJ/cm² ובאורך גל של 350 ננומטר.
   5. לאחר החשיפה, אופים את המצע החשוף ב 65 ° C במשך 60 s ו 95 ° C במשך 300 שניות.
   6. פתח את פרוסת הסיליקון כדי להשיג את תבנית האב על ידי טבילתה בכוס מלאה במפתח mrDev600 (ראה טבלת חומרים). נערו בעדינות את הכד במשך 1,800 שניות כדי לשטוף את ההתנגדות הלא פולימרית. לאחר מכן, יש להתיז כביסה על ידי ריסוס איזופרופנול על פרוסת הסיליקון ולייבש באוויר.
   7. אפו בחוזקה את רקיק הסיליקון בטמפרטורה של 200°C במשך 1,800 שניות.
3. סילניזציה של תבנית האב באמצעות שקיעת אדים של 20 μL של סילאן Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) (ראה טבלת חומרים) שהונחה על מגלשת זכוכית ליד התבנית למשך 40 דקות במייבש ואקום, ויצרה לחץ מד של 100 mbar.

2. ייצור המכשיר המיקרופלואידי

הערה: הליך הייצור המתואר כאן הוא עבור התקן מיקרופלואידי עם תעלה מיקרופלואידית אחת. עם זאת, אותה שיטה יכולה להיות מיושמת כדי לייצר מכשיר microfluidic עם תעלות microfluidic מרובים במקביל.

1. ערבבו את האלסטומר עם הקרוסלינקר שלו ביחס של 10:1 (ראו טבלת חומרים) להכנת תערובת PDMS. מערבבים את התערובת עד שהיא מתערבבת באופן אחיד והופכת אטומה בגלל בועות האוויר הסגורות.
2. משחררים את התערובת במייבש ואקום, ויוצרים לחץ מד של 100 mbar עד להסרת בועות האוויר הכלואות והיא נראית שקופה. הזמן הדרוש לפירוק גזים הוא בדרך כלל 30 דקות.
3. מניחים את תבנית האב (שלב 1) בכלי תרבית תאים (ראו טבלת חומרים). יוצקים 20 גרם של תערובת PDMS על תבנית האב כדי לייצר תעלות עם עובי סופי של 5 מ"מ.
4. אופים את תבנית המאסטר ב 70 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
5. חתכו את ה-PDMS שנרפא סביב התעלה המיקרופלואידית (במרחק של כ-3 מ"מ) באמצעות להב, ולאחר מכן קלפו את התעלה המיקרופלואידית PDMS מהתבנית הראשית.
6. כדי ליצור את הכניסה והמוצא של התעלות המיקרופלואידיות, ניקבו חורים בעזרת ניקוב ביופסיה (קוטר של 1.5 מ"מ) בגפיים (החלק העליון של המשולשים, ראו איור 1A). נקב חור אחד נוסף במרכז משולש הכניסה כדי להתקין את חיישן הלחץ מאוחר יותר.
7. שטפו מגלשת זכוכית ואת התעלה המיקרופלואידית בתמיסת דטרגנט 1% הזמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו אותם במים נטולי יונים. לאחר מכן, שטפו את התעלה המיקרופלואידית PDMS ואת מגלשת הזכוכית עם איזופרופנול. לאחר מכן, שטפו אותם שוב במים נטולי יונים. יבש את התעלה המיקרופלואידית PDMS ואת מגלשת הזכוכית עם אוויר דחוס בבר אחד למשך דקה אחת.
   הערה: המבנה הנקבובי של PDMS חייב להיות יבש לחלוטין כדי שההדבקה תהיה יעילה.
8. הניחו את מגלשת הזכוכית ואת התעלה המיקרופלואידית בחומר ניקוי פלזמה (ראו טבלת חומרים) וודאו שהמשטחים שיש לחבר פונים כלפי מעלה. הפעל את שואב הפלזמה וטפל בתעלה המיקרופלואידית ובמגלשת הזכוכית עם פלסמת אוויר בזרימת אוויר של 1 SL/h (ליטר סטנדרטי לשעה) למשך דקה אחת. חברו את התעלה המיקרופלואידית למגלשת הזכוכית מיד לאחר הוצאתם מהמנקה על ידי הצבתם במגע זה עם זה.
   הערה: הקפד לא לגעת במשטחים המטופלים, מכיוון שהדבר עלול להשפיע על ההדבקה. בעת ייצור מכשיר מיקרופלואידי עם תעלות מיקרופלואידיות מרובות, חשוף את התעלות המיקרופלואידיות בו זמנית וקשר אותן בשלב אחד.
9. הניחו את המכשיר המיקרופלואידי המלוכד על פלטה חמה של 80°C למשך 15 דקות לפחות.
10. אחסנו את המכשיר המיקרופלואידי בצלחת תרבית תאים נקייה עד לתחילת הניסוי.

3. הכנת ההשעיה החיידקית

1. גידול אוכלוסייה של Bacillus subtilis NCIB 3610 20 שעות לפני תחילת הניסוי על ידי חיסון ישיר של 3 מ"ל של מרק מזין מס '3 מדיום תרבית (ראה טבלת חומרים) ממלאי גליצרול קפוא בצינור תרבית של 15 מ"ל. דוגרים באינקובטור רועד ב-30 מעלות צלזיוס וב-200 סל"ד למשך הלילה (למשך 16 שעות).
2. צור תת-תרבית מתרבית הלילה 4 שעות לפני תחילת הניסוי על ידי הוספת 3 מיקרוליטר של תרבית הלילה ב-3 מ"ל של מדיום תרבית טרי (דילול של 1:1,000) בצינור תרבית של 15 מ"ל. לדגור על תת-התרבות באינקובטור רועד ב-30°C ב-200 סל"ד למשך 3.5-4 שעות כדי לקבל צפיפות אופטית ב-600 ננומטר (OD₆₀₀) של 0.1.

4. ניסוי גידול ביופילם

1. הפעל את אינקובטור התיבה של המיקרוסקופ 3 שעות לפני הניסוי כדי להבטיח טמפרטורה יציבה של 25 מעלות צלזיוס. הרכיבו את משאבת המזרק ואת חיישני הלחץ (ראו טבלת חומרים).
2. חבר את צינורות הכניסה והיציאה להתקן המיקרופלואידי. הכנס ישירות מחט (בקוטר חיצוני של 0.6 מ"מ) לתוך צינור הכניסה כדי לאבטח את החיבור בין הצינור למזרק.
3. הניחו את המכשיר המיקרופלואידי, 30 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה ו-30 מ"ל של מדיום תרבית במייבש ואקום ונטרלו אותם למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן, משכו באיטיות את מדיום התרבית ואת המים שעברו דה-יוניזציה לשני מזרקים נפרדים של 30 מ"ל.
   הערה: שלב זה חיוני למניעת היווצרות בועות בערוץ תוך כדי שטיפה עם מדיום התרבות.
4. הרכיבו את המכשיר המיקרופלואידי על המיקרוסקופ והניחו את צינור היציאה במיכל פסולת.
   1. חברו את המזרק המלא במים שעברו דה-יוניזציה לתעלה המיקרופלואידית דרך הצינור המיקרופלואידי והזריקו את המים באיטיות עד שהם יוצאים ממוצא חיישן הלחץ. מלאו את חיישן הלחץ במים ושטפו את כל הבועות מהצינור המחבר בין התעלה המיקרופלואידית לחיישן הלחץ. סגור את היציאה של חיישן הלחץ עם הברגים הייעודיים לחיישן הלחץ.
      הערה: הליך המילוי המתואר מבטיח ששינויי הלחץ בכניסת התעלות המיקרופלואידיות יירשמו במדויק. בעת ביצוע ניסוי עם תעלות מיקרופלואידיות מרובות, חבר כל ערוץ למזרק נפרד כדי להבטיח תנאי זרימה שווים בכל הערוצים.
5. מלאו את שאר התעלה המיקרופלואידית במים שעברו דה-יוניזציה.
6. הניחו מסנן של 1.2 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) על מזרק המדיה לתרבית. לאחר מכן, הסר את מזרק המים וחבר בזהירות את מזרק המדיה התרבית לצינור המיקרופלואידי הנכנס. הרכיבו את המזרק על משאבת המזרק ושטפו את התעלה בתווך התרבית בקצב זרימה של 2 מ"ל/שעה למשך שעה.
   הערה: המסנן מונע מתאי חיידקים להיכנס למזרק במהלך ההעמסה. שטיפת התעלה המיקרופלואידית עם אמצעי התרבית תסיר את הבועות הנותרות במבנה הנקבובי.
7. כוונו את משאבת המזרק בקצב הזרימה הרצוי (כאן 1 מ"ל/שעה) במהלך הניסוי וכוונו את קריאת הלחץ של חיישני הלחץ לאפס.
   הערה: על ידי הגדרת קריאת הלחץ הראשונית לאפס, רק הפרש הלחצים שנגרם על ידי התפתחות ביופילם במהלך הניסוי יימדד.
8. פיפטה 1 מ"ל של תרבית חיידקים ב OD₆₀₀ של 0.1 בבקבוקון צנטריפוגה 1.5 מ"ל. טען את תרבית החיידקים לתוך התעלה המיקרופלואידית על ידי הכנסת צינור היציאה לתוך בקבוקון הצנטריפוגה. לאחר המתנה של 5 דקות להסרת בועות אוויר פוטנציאליות ממוצא הצינורות, משכו 150 מיקרוליטר של תמיסה חיידקית בקצב זרימה של 1 מ"ל/שעה, עד שהתעלה המיקרופלואידית תתמלא בתרבית החיידקים.
9. הסירו בזהירות את מסנן מזרק המדיה התרבית והכניסו את השקע למיכל האשפה. השאירו את תאי החיידק בתנאי זרימה אפסית בתעלה המיקרופלואידית למשך 3 שעות כדי לאפשר את חיבור פני השטח שלהם בתווך הנקבובי.
   הערה: השארת תאי החיידק בתנאי זרימה אפסית למשך 3 שעות הייתה אופטימלית לחיבור הזן החיידקי המשמש תוך הבטחת תרבית חיידקים מחומצנת היטב. זני חיידקים אחרים עשויים לדרוש פחות או יותר זמן.
10. כדי להתחיל את הניסוי, התחל את הזרימה על ידי הגדרת משאבת המזרק לקצב הזרימה הרצוי (כאן 1 מ"ל / שעה) והתחל את קריאת הלחץ על 1 הרץ.
11. קבל תמונות של הביופילם הגדל במרווח הזמן הרצוי, תצורה אופטית והגדלה.
    הערה: במחקר הנוכחי, תמונות בהגדלה פי 4 במצב שדה בהיר ב-18 מיקומים המשתרעים על פני כל תחום התווך הנקבובי נרכשו כל 6 דקות למשך 24 שעות.

5. ניתוח תמונות

1. שחזר את כל המדיום הנקבובי מתוך רצפי התמונות שצולמו על ידי תפירת התמונות מ-18 המיקומים באמצעות תוכנת ניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים) ואלגוריתם תפירה²⁴.
2. שמרו את רצפי התמונות התפורים כרצף של תמונות בודדות.
   הערה: אם הקבצים גדולים מדי, בשלב זה, ניתן לשנות את גודל התמונות ולאגד אותן לגודל סביר לצורך עיבוד נוסף.
3. צור מסכה של עמודי התווך הנקבובי כדי להסיר אותם מהניתוח.
4. הסירו את הרקע של התמונות על-ידי חלוקתן לפי הרקע שלהן עם התמונה שצולמה ב-t = 0 שעות (איור 2A) ובצעו בינאריזציה של התמונות בסף המתאים לפלח את הביופילם (איור 2B).
5. חשבו את הרוויה של הביופילם על-ידי חישוב השטח המכוסה על-ידי הביופילם (מספר הפיקסלים המיוחסים לביופילם) בהשוואה לאזור הריק של התחום הנקבובי (איור 3).

תוצאות

במחקר הנוכחי נעשה שימוש במכשיר מיקרופלואידי עם שלוש תעלות מיקרופלואידיות מקבילות עם גדלי נקבוביות שונים (איור 1) כדי לחקור באופן שיטתי היווצרות ביופילם במדיה נקבובית. תהליך היווצרות הביופילם הודגם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. תאי החיידקים והביופילם הופיעו בתמונות כפיקסל?...

Discussion

אנלוגים של מדיה נקבובית מיקרופלואידית בשילוב עם חיישני לחץ מספקים כלי מתאים לחקר התפתחות ביופילם במדיה נקבובית. הרבגוניות בעיצוב התווך הנקבובי המיקרופלואידי, במיוחד סידור העמודים, כולל קוטר, צורות לא סדירות וגודל נקבוביות, מאפשרת חקירה של גיאומטריות רבות. גיאומטריות אלה נעות בין נקבובי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer