다공성 매체의 생물 막힘을 연구하기 위한 미세유체 플랫폼

요약

본 프로토콜은 고해상도 현미경 이미징과 동시 압력 차이 측정을 결합하여 준 2D 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 미세 유체 플랫폼을 설명합니다. 이 플랫폼은 다공성 매체의 공극 크기와 유체 유속이 생물 막힘에 미치는 영향을 정량화합니다.

초록

박테리아 생물막은 토양 및 여과막을 포함한 여러 환경 및 산업 다공성 매체에서 발견됩니다. 생물막은 특정 유동 조건에서 자라며 기공을 막아 국소 유체 흐름을 리디렉션할 수 있습니다. 생물막이 기공을 막는 능력, 이른바 생물막힘은 다공성 매질의 국부 투과성에 엄청난 영향을 미쳐 시스템에 압력 상승을 일으키고 이를 통과하는 질량 흐름에 영향을 줄 수 있습니다. 상이한 물리적 조건(예를 들어, 상이한 유속 및 공극 크기에서)하에서 생물막 성장과 유체 유동 사이의 상호작용을 이해하기 위해, 본 연구에서, 미세유체 플랫폼은 외부에서 부과되고 제어된 물리적 조건 하에서 현미경을 사용하여 생물막 발달을 시각화하기 위해 개발된다. 다공성 매질의 생물막 유도 압력 축적은 압력 센서를 사용하여 동시에 측정할 수 있으며, 나중에 생물막의 표면 커버리지와 상관관계가 있습니다. 제시된 플랫폼은 유동 조건에서 다공성 매체의 생물막으로 인한 생물막을 조사하기 위한 체계적인 접근 방식의 기준선을 제공하며 환경 분리주 또는 다종 생물막 연구에 적용할 수 있습니다.

서문

생물막(biofilm) - 엑스트라 폴리머 물질(extra-polymeric substances, EPS)의 자가 분비 매트릭스에 포매된 박테리아 집락 - 은 토양 및 대수층¹과 같은 천연 다공성 매체와 생물 정화(bioremediation⁾², 물 여과(water filtration)³ 및 의료 기기⁽medical devices)4와 같은 기술 및 의료 응용 분야에서 흔히 볼 수 있다. 생물막 기질은 다당류, 단백질 섬유, 세포외 DNA(extracellular DNA)^5,6로 구성되어 있으며, 미생물, 영양소의 가용성^, 환경 조건에 따라 크게 좌우된다⁷. 그러나 매트릭스의 기능은 보편적입니다. 생물막 구조의 스캐폴드를 형성하고, 기계적 및 화학적 응력으로부터 미생물 군집을 보호하며, 생물막의 유변학적 특성에 크게 기여한다⁵.

다공성 매질에서 생물막의 성장은 모공을 막아 소위 생물 막힘을 유발할 수 있습니다. 생물막 발달은 다공^{성 매질}의 두 기둥을 분리하는 거리로 정의되는 유체 흐름 및 기공 크기에 의해 제어됩니다 8,9,10. 기공 크기와 유체 흐름은 모두 영양소 수송과 국소 전단력을 제어합니다. 차례로, 성장하는 생물막은 기공을 막고, 유체(11,12,13)의 속도 분포, 질량 수송, 및 다공성 매질(^14,15)의 수압 전도도에 영향을 미친다. 유압 전도도의 변화는 밀폐 시스템^(16,17,18,19)의 압력 증가를 통해 반영됩니다. 생물막 발달 및 생물막힘에 대한 현재의 미세유체 연구는 균질한 기하학적 구조(즉, 단일 기공 크기) 또는 이질적인 다공성 매체(^12,21,22)에서 유속의 영향을 연구하는 데 중점을 둡니다. 그러나 생물막 발달에 대한 유속 및 공극 크기의 영향과 그에 따른 생물 막힌 다공성 배지의 압력 변화를 풀기 위해서는 다양한 다공성 배지 형상 및 환경 조건을 병렬로 연구할 수 있는 고도로 제어 가능하고 다재다능한 실험 플랫폼이 필요합니다.

본 연구는 압력 측정과 다공성 매질 내에서 진화하는 생물막의 동시 이미징을 결합한 미세유체 플랫폼을 소개합니다. 채널 형상 설계의 가스 투과성, 생체 적합성 및 유연성으로 인해 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만들어진 미세유체 장치는 다공성 매질에서 생물막 발달을 연구하는 데 적합한 도구입니다. 미세유체공학은 물리적, 화학적 조건(예를 들어, 유체 흐름 및 영양소 농도)을 매우 정밀하게 제어하여 미생물 서식지의 환경을 모방할 수 있게 한다²³. 또한, 미세유체 장치는 광학 현미경을 사용하여 마이크로미터 해상도로 쉽게 이미지화할 수 있고 온라인 측정(예: 국부 압력)과 결합할 수 있습니다.

이 작업에서 실험은 제어된 부과 흐름 조건에서 균일한 다공성 매질 아날로그에서 공극 크기의 영향을 연구하는 데 중점을 둡니다. 배양 배지의 흐름은 주사기 펌프를 사용하여 부과되며 미세 유체 채널을 통한 압력 차이는 압력 센서와 동시에 측정됩니다. 생물막 발달은 미세유체 채널에 Bacillus subtilis 의 플랑크톤 배양을 파종함으로써 시작됩니다. 진화하는 생물막의 정기적인 이미징 및 이미지 분석을 통해 다양한 실험 조건에서 표면 커버리지에 대한 공극 스케일 분해 정보를 얻을 수 있습니다. 압력 변화와 생물 막힘 정도에 대한 상관 정보는 생체 막힌 다공성 매체의 투과성 추정에 중요한 정보를 제공합니다.

프로토콜

1. 실리콘 웨이퍼 준비

1. CAD(Computer-Aided Design, 재료 표 참조) 소프트웨어에서 미세유체 채널의 형상을 설계하고 투명 필름에 인쇄하여 포토마스크를 만듭니다(그림 1A).
2. 아래 단계에 따라 소프트 리소그래피(클린룸 조건에서)로 마스터 몰드를 제작합니다.
   1. 실리콘 웨이퍼를 200°C에서 2시간 동안 굽습니다.
   2. 웨이퍼를 스핀 코터의 중앙에 놓고 SU8 3050 포토레지스트( 재료 표 참조)를 웨이퍼에 붓습니다. 1,700rpm에서 40초 동안 10s/100rpm 램프 시간으로 스핀 코팅합니다.
      참고: 스핀 코팅 매개변수는 SU8 3050에 대해 100μm의 목표 두께를 얻도록 설정되었습니다.
   3. 스핀 코팅 공정 후 실리콘 웨이퍼를 65°C에서 600초, 95°C에서 2,700초 동안 소프트 베이킹합니다. 웨이퍼를 실온에서 밤새 식히십시오.
      참고: 하룻밤 냉각은 웨이퍼에 대한 SU8의 접착력을 향상시킵니다.
   4. 포토마스크(단계 1.1)를 웨이퍼에 놓고 250mJ/^cm2 의 노출 에너지와 350nm의 파장으로 UV 광에 노출시킵니다.
   5. 노출 후 노출된 기판을 65°C에서 60초 동안, 95°C에서 300초 동안 베이크합니다.
   6. 실리콘 웨이퍼를 mrDev600 현상액으로 채워진 비커에 담궈 마스터 몰드를 얻기 위해 현상한다( 재료 표 참조). 비커를 1,800초 동안 부드럽게 흔들어 중합되지 않은 레지스트를 씻어냅니다. 그런 다음 실리콘 웨이퍼에 이소프로판올을 분사하여 스플래시 세척하고 자연 건조합니다.
   7. 실리콘 웨이퍼를 200°C에서 1,800초 동안 하드 베이크합니다.
3. 20μL의 트리클로로(1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸) 실란( 재료 표 참조)을 진공 데시케이터에서 40분 동안 금형 옆의 유리 슬라이드에 놓고 100mbar의 게이지 압력을 생성하여 마스터 금형을 실란화합니다.

2. 미세 유체 장치의 제작

참고: 여기에 설명된 제조 절차는 하나의 미세유체 채널이 있는 미세유체 장치에 대한 것입니다. 그러나, 동일한 방법이 다수의 미세유체 채널을 갖는 미세유체 소자를 병렬로 제조하는 데 적용될 수 있다.

1. 엘라스토머와 가교제를 10:1의 비율로 혼합하여( 재료 표 참조) PDMS 혼합물을 제조합니다. 혼합물이 균일하게 혼합되고 밀폐된 기포로 인해 불투명해질 때까지 저어줍니다.
2. 진공 건조기에서 혼합물을 탈기하고 갇힌 기포가 제거되고 투명해 보일 때까지 100mbar의 게이지 압력을 생성합니다. 가스 제거에 필요한 시간은 일반적으로 30분입니다.
3. 마스터 몰드(단계 1)를 세포 배양 접시에 넣습니다( 재료 표 참조). PDMS 혼합물 20g을 마스터 몰드에 부어 최종 두께가 5mm인 채널을 만듭니다.
4. 마스터 몰드를 70°C에서 2시간 동안 굽습니다.
5. 블레이드를 사용하여 미세유체 채널 주위(약 3mm 거리)의 경화된 PDMS를 절단한 다음 PDMS 미세유체 채널을 마스터 몰드에서 떼어냅니다.
6. 미세유체 채널의 입구와 출구를 만들려면 말단에 생검 펀치(직경 1.5mm)로 구멍을 뚫습니다(삼각형 상단, 그림 1A 참조). 입구 삼각형 중앙에 구멍을 하나 더 뚫어 나중에 압력 센서를 설치합니다.
7. 유리 슬라이드 및 미세유체 채널을 시중에서 판매되는 1% 세제 용액( 재료 표 참조)으로 5분 동안 세척한 다음, 탈이온수로 헹굽니다. 그 후, PDMS 미세유체 채널 및 유리 슬라이드를 이소프로판올로 세척한다. 그런 다음 탈이온수로 다시 헹굽니다. PDMS 미세유체 채널과 유리 슬라이드를 1bar에서 1분 동안 압축 공기로 건조시킵니다.
   참고: PDMS의 다공성 구조는 결합이 효과적이기 위해 완전히 건조되어야 합니다.
8. 유리 슬라이드와 미세유체 채널을 플라즈마 클리너( 재료 표 참조)에 넣고 접착할 표면이 위를 향하도록 합니다. 플라즈마 클리너를 켜고 미세유체 채널과 유리 슬라이드를 1분 동안 1SL/h(시간당 표준 리터)의 공기 흐름에서 공기 플라즈마로 처리합니다. 미세유체 채널을 서로 접촉시켜 청소기에서 꺼낸 직후 유리 슬라이드에 접착합니다.
   알림: 처리된 표면을 만지면 접착에 영향을 줄 수 있으므로 만지지 마십시오. 여러 개의 미세유체 채널이 있는 미세유체 장치를 제작할 때 미세유체 채널을 동시에 노출시키고 단일 단계로 결합합니다.
9. 접합된 미세유체 장치를 80°C 핫 플레이트에 최소 15분 동안 놓습니다.
10. 실험이 시작될 때까지 미세유체 장치를 깨끗한 세포 배양 접시에 보관하십시오.

3. 박테리아 현탁액의 제조

1. 실험 시작 20시간 전에 15 mL 배양 튜브에 냉동된 글리세롤 스톡으로부터 3 mL의 영양 배양액 3번 배양 배지(재료 표 참조)를 직접 접종하여 Bacillus subtilis NCIB 3610의 개체군을 성장시킵니다. 30°C 및 200rpm의 진탕 인큐베이터에서 하룻밤 동안(16시간 동안) 배양합니다.
2. 15 mL 배양 튜브에 3 mL의 신선한 배양 배지(1:1,000 희석)에 하룻밤 배양물 3 μL를 첨가하여 실험 시작 4시간 전에 하룻밤 배양으로부터 계대배양을 한다. 계대배양물을 30°C에서 200 rpm으로 3.5-4시간 동안 진탕 배양하여 600 nm에서 0.1의 광학 밀도(_OD600)를 얻었다.

4. 생물막 성장 실험

1. 실험 3시간 전에 현미경의 배양기 박스를 켜서 25°C의 안정된 온도를 확보한다. 주사기 펌프와 압력 센서를 장착합니다( 재료 표 참조).
2. 입구 및 출구 튜브를 미세 유체 장치에 연결합니다. 바늘(외경 0.6mm)을 입구 튜브에 직접 삽입하여 튜브와 주사기 사이의 연결을 고정합니다.
3. 미세유체 장치, 탈이온수 30mL 및 배양액 30mL를 진공 데시케이터에 넣고 최소 1시간 동안 탈기합니다. 그런 다음 배양 배지와 탈이온수를 두 개의 개별 30mL 주사기로 천천히 당깁니다.
   참고: 이 단계는 배양 배지와 플러싱하는 동안 채널에 기포가 형성되는 것을 방지하는 데 중요합니다.
4. 현미경에 미세 유체 장치를 장착하고 배출 튜브를 폐기물 용기에 넣습니다.
   1. 탈이온수로 채워진 주사기를 미세유체 튜브를 통해 미세유체 채널에 연결하고 압력 센서 배출구에서 나올 때까지 물을 천천히 주입합니다. 압력 센서에 물을 채우고 미세유체 채널과 압력 센서를 연결하는 튜브에서 모든 기포를 씻어냅니다. 압력 센서 전용 나사로 압력 센서의 배출구를 닫습니다.
      알림: 설명된 충전 절차는 미세유체 채널 입구의 압력 변화가 정확하게 기록되도록 합니다. 여러 미세유체 채널로 실험을 실행할 때 각 채널을 별도의 주사기에 연결하여 모든 채널에서 동일한 흐름 조건을 보장합니다.
5. 미세유체 채널의 나머지 부분을 탈이온수로 채웁니다.
6. 배양 배지 주사기에 1.2μm 필터( 재료 표 참조)를 놓습니다. 그런 다음 물 주사기를 제거하고 배양 배지 주사기를 입구 미세유체 튜브에 조심스럽게 연결합니다. 주사기를 주사기 펌프에 장착하고 1시간 동안 2mL/h의 유속으로 배양 배지로 채널을 세척합니다.
   알림: 필터는 로딩 중에 박테리아 세포가 주사기에 들어가는 것을 방지합니다. 배양 배지로 미세유체 채널을 플러싱하면 다공성 구조에 남아 있는 기포가 제거됩니다.
7. 실험 중에 주사기 펌프를 원하는 유속(여기서는 1mL/h)으로 설정하고 압력 센서의 압력 판독값을 0으로 설정합니다.
   알림: 초기 압력 판독값을 0으로 설정하면 실험 중 생물막 발달로 인한 압력 차이만 측정됩니다.
8. 1.5 mL 원심분리 바이알에서 0.1의_OD600 에서 1 mL의 박테리아 배양물을 피펫팅한다. 출구 튜브를 원심분리기 바이알에 넣어 박테리아 배양을 미세유체 채널에 로드합니다. 튜브의 배출구에서 잠재적인 기포를 제거하기 위해 5분 동안 기다린 후 미세유체 채널이 박테리아 배양으로 채워질 때까지 1mL/h의 유속으로 박테리아 용액 150μL를 빼냅니다.
9. 배양 배지 주사기 필터를 조심스럽게 제거하고 배출구를 폐기물 용기에 넣습니다. 박테리아 세포를 미세유체 채널에서 3시간 동안 제로 흐름 상태로 두어 다공성 배지에 표면 부착을 허용합니다.
   참고: 박테리아 세포를 3시간 동안 제로 흐름 조건으로 두는 것은 산소가 잘 공급된 박테리아 배양을 보장하면서 사용된 박테리아 균주의 부착에 최적화되었습니다. 다른 박테리아 균주는 더 많거나 적은 시간이 필요할 수 있습니다.
10. 실험을 시작하려면 주사기 펌프를 원하는 유속(여기서는 1mL/h)으로 설정하여 유량을 시작하고 1Hz에서 압력 판독을 시작합니다.
11. 원하는 시간 간격, 광학 구성 및 배율로 성장하는 생물막의 이미지를 획득합니다.
    참고: 본 연구에서는 다공성 배지의 전체 도메인에 걸쳐 있는 18개 위치에서 명시야 모드에서 4배 배율의 이미지를 24시간 동안 6분마다 획득했습니다.

5. 이미지 분석

1. 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조) 및 스티칭 알고리즘(²⁴)을 사용하여 18개 위치로부터의 이미지를 스티칭하여 기록된 이미지 시퀀스로부터 전체 다공성 매체를 재구성한다.
2. 스티칭된 이미지 시퀀스를 단일 이미지의 시퀀스로 저장합니다.
   참고: 파일이 너무 크면 이 시점에서 이미지 크기를 조정하고 추가 처리를 위해 적절한 크기로 범주화할 수 있습니다.
3. 다공성 매체의 기둥 마스크를 만들어 분석에서 제거합니다.
4. t = 0h에서 촬영한 이미지를 배경으로 나누어 이미지의 배경을 제거하고(그림 2A) 생물막을 분할하는 데 적합한 임계값에서 이미지를 이진화합니다(그림 2B).
5. 다공성 도메인의 공극 면적과 비교하여 생물막이 덮고 있는 면적(생물막에 기인하는 픽셀 수)을 계산하여 생물막의 포화도를 계산합니다(그림 3).

결과

본 연구에서는 기공 크기가 다른 3개의 평행한 미세유체 채널을 가진 미세유체 장치를 사용하여(그림 1) 다공성 매질의 생물막 형성을 체계적으로 연구했습니다. 생물막 형성 과정은 명시야 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. 박테리아 세포와 생물막은 이미지에서 더 어두운 픽셀로 나타났습니다(그림 2). 또한, 점진적인 막힘 과정이 관찰되었다. 24...

토론

압력 센서와 결합된 미세유체 다공성 배지 유사체는 다공성 배지에서 생물막 발달을 연구하는 데 적합한 도구를 제공합니다. 미세유체 다공성 매질 설계의 다양성, 특히 직경, 불규칙한 모양 및 기공 크기를 포함한 기둥의 배열은 많은 형상을 조사할 수 있게 해줍니다. 이러한 기하학적 구조는 단일 기공에서 다양한 자연(예: 토양) 및 산업용(예: 멤브레인 및 필터) 다공성 매체를 모방한 매우 복잡...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer