Una plataforma microfluídica para estudiar la bioobstrucción en medios porosos

Resumen

El presente protocolo describe una plataforma microfluídica para estudiar el desarrollo de biopelículas en medios porosos cuasi-2D mediante la combinación de imágenes de microscopía de alta resolución con mediciones simultáneas de diferencia de presión. La plataforma cuantifica la influencia del tamaño de poro y las tasas de flujo de fluidos en medios porosos en la bioobstrucción.

Resumen

Las biopelículas bacterianas se encuentran en varios medios porosos ambientales e industriales, incluidos los suelos y las membranas de filtración. Las biopelículas crecen bajo ciertas condiciones de flujo y pueden obstruir los poros, redirigiendo así el flujo de fluido local. La capacidad de las biopelículas para obstruir los poros, la llamada bioobstrucción, puede tener un efecto tremendo en la permeabilidad local del medio poroso, creando una acumulación de presión en el sistema e impactando el flujo másico a través de él. Para comprender la interacción entre el crecimiento de la biopelícula y el flujo de fluidos en diferentes condiciones físicas (por ejemplo, a diferentes velocidades de flujo y tamaños de poro), en el presente estudio, se desarrolla una plataforma microfluídica para visualizar el desarrollo de la biopelícula utilizando un microscopio bajo condiciones físicas controladas e impuestas externamente. La acumulación de presión inducida por la biopelícula en el medio poroso se puede medir simultáneamente utilizando sensores de presión y, más tarde, correlacionarse con la cobertura superficial de la biopelícula. La plataforma presentada proporciona una línea de base para un enfoque sistemático para investigar la bioobstrucción causada por biopelículas en medios porosos en condiciones de flujo y se puede adaptar para estudiar aislados ambientales o biopelículas multiespecies.

Introducción

Las biopelículas (colonias bacterianas incrustadas en una matriz autosecretada de sustancias extrapoliméricas (EPS), son ubicuas en medios porosos naturales, como suelos y acuíferos¹, y aplicaciones técnicas y médicas, como biorremediación², filtración de agua³ y dispositivos médicos⁴. La matriz de biofilm está compuesta por polisacáridos, fibras proteicas y ADN extracelular^5,6, y depende fuertemente de los microorganismos, la disponibilidad de nutrientes^, así como las condiciones ambientales⁷. Sin embargo, las funciones de la matriz son universales; Forma el andamio de la estructura del biofilm, protege a la comunidad microbiana de tensiones mecánicas y químicas, y es en gran parte responsable de las propiedades reológicas de los biofilms⁵.

En medios porosos, el crecimiento de biopelículas puede obstruir los poros, causando la llamada bioobstrucción. El desarrollo del biofilm está controlado por el flujo de fluido y el tamaño de poro, definido como la distancia que separa dos pilares, del medio poroso 8,9,10. Tanto el tamaño de poro como el flujo de fluido controlan el transporte de nutrientes y las fuerzas de cizallamiento locales. A su vez, el biofilm creciente obstruye los poros, afectando la distribución de la velocidad del fluido 11,12,13, el transporte de masa y la conductividad hidráulica del medio poroso ^14,15. Los cambios en la conductividad hidráulica se reflejan a través del aumento de la presión en sistemas confinados^16,17,18,19. Los estudios microfluídicos actuales en el desarrollo de biopelículas y la bioobstrucción se centran en estudiar el impacto de las velocidades de flujo en geometrías homogéneas^16,20 (es decir, con un tamaño de poro singular) o medios porosos heterogéneos^12,21,22. Sin embargo, para desentrañar los efectos de las tasas de flujo y el tamaño de poro en el desarrollo de biopelículas y los cambios de presión resultantes en el medio poroso bioobstruido, se requiere una plataforma experimental altamente controlable y versátil que permita el estudio de diferentes geometrías de medios porosos y condiciones ambientales en paralelo.

El presente estudio introduce una plataforma microfluídica que combina mediciones de presión con imágenes simultáneas de la biopelícula en evolución dentro del medio poroso. Debido a su permeabilidad al gas, biocompatibilidad y flexibilidad en el diseño de la geometría del canal, un dispositivo microfluídico hecho de polidimetilsiloxano (PDMS) es una herramienta adecuada para estudiar el desarrollo de biopelículas en medios porosos. La microfluídica permite el control de las condiciones físicas y químicas (por ejemplo, flujo de fluidos y concentración de nutrientes) con alta precisión para imitar el ambiente de los hábitats microbianos²³. Además, los dispositivos microfluídicos se pueden visualizar fácilmente con resolución micrométrica utilizando un microscopio óptico y junto con mediciones en línea (por ejemplo, la presión local).

En este trabajo, los experimentos se centran en estudiar el impacto del tamaño de poro en un análogo de medio poroso homogéneo bajo condiciones de flujo impuesto controladas. El flujo de un medio de cultivo se impone utilizando una bomba de jeringa, y la diferencia de presión a través del canal microfluídico se mide simultáneamente con sensores de presión. El desarrollo del biofilm se inicia mediante la siembra de un cultivo planctónico de Bacillus subtilis en el canal microfluídico. Las imágenes regulares de la biopelícula en evolución y el análisis de imágenes permiten obtener información resuelta a escala de poros en la cobertura de la superficie bajo diversas condiciones experimentales. La información correlacionada del cambio de presión y el grado de bioobstrucción proporciona información crucial para las estimaciones de permeabilidad de medios porosos bioobstruidos.

Protocolo

1. Preparación de obleas de silicio

1. Diseñe las geometrías del canal microfluídico en el software de diseño asistido por computadora (CAD; consulte la Tabla de materiales) e imprímalo en una película transparente para crear la fotomáscara (Figura 1A).
2. Fabrice el molde maestro mediante litografía suave (en condiciones de sala limpia) siguiendo los pasos a continuación.
   1. Hornear la oblea de silicio a 200 °C durante 2 h.
   2. Coloque la oblea en el centro de una centrifugadora y vierta SU8 3050 fotorresistente (consulte la Tabla de materiales) en la oblea. Capa de centrifugado a 1.700 rpm durante 40 s con un tiempo de rampa de 10 s/100 rpm.
      NOTA: Los parámetros de centrifugado se ajustaron para obtener un espesor objetivo de 100 μm para el SU8 3050.
   3. Después del proceso de centrifugado, hornee suavemente la oblea de silicio a 65 °C durante 600 s y 95 °C durante 2.700 s. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente durante la noche.
      NOTA: El enfriamiento nocturno mejora la adhesión del SU8 a la oblea.
   4. Coloque la fotomáscara (paso 1.1) sobre la oblea y exponerla a la luz UV, con una energía de exposición de 250 mJ/^cm2 y a una longitud de onda de 350 nm.
   5. Después de la exposición, hornear el sustrato expuesto a 65 °C durante 60 s y 95 °C durante 300 s.
   6. Desarrolle la oblea de silicio para obtener el molde maestro sumergiéndolo en un vaso de precipitados lleno de revelador mrDev600 (consulte la Tabla de materiales). Agite suavemente el vaso de precipitados durante 1.800 s para lavar la resistencia no polimerizada. Luego, lave por salpicaduras rociando isopropanol sobre la oblea de silicio y seque al aire.
   7. Hornear la oblea de silicio a 200 °C durante 1.800 s.
3. Silanizar el molde maestro a través de la deposición de vapor de 20 μL de silano Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) (ver Tabla de materiales) colocado en un portaobjetos de vidrio junto al molde durante 40 minutos en un desecador de vacío, creando una presión manométrica de 100 mbar.

2. Fabricación del dispositivo microfluídico

NOTA: El procedimiento de fabricación descrito aquí es para un dispositivo microfluídico con un canal microfluídico. Sin embargo, el mismo método se puede aplicar para fabricar un dispositivo microfluídico con múltiples canales microfluídicos en paralelo.

1. Mezcle el elastómero con su reticulante en una proporción de 10:1 (consulte la Tabla de materiales) para preparar una mezcla de PDMS. Revuelva la mezcla hasta que se mezcle uniformemente y se vuelva opaca debido a las burbujas de aire cerradas.
2. Desgasifica la mezcla en un desecador al vacío, creando una presión manométrica de 100 mbar hasta que se eliminen las burbujas de aire atrapadas y se vea transparente. El tiempo requerido para la desgasificación suele ser de 30 minutos.
3. Coloque el molde maestro (paso 1) en una placa de cultivo celular (consulte la Tabla de materiales). Verter 20 g de la mezcla PDMS en el molde maestro para producir canales con un espesor final de 5 mm.
4. Hornear el molde maestro a 70 °C durante 2 h.
5. Corte el PDMS curado alrededor del canal microfluídico (a una distancia de aproximadamente 3 mm) con una cuchilla y luego retire el canal microfluídico PDMS del molde maestro.
6. Para crear la entrada y salida de los canales microfluídicos, perfore los orificios con un punzón de biopsia (diámetro de 1,5 mm) en sus extremidades (parte superior de los triángulos, véase la figura 1A). Perfore un orificio adicional en el centro del triángulo de entrada para instalar el sensor de presión más adelante.
7. Lave un portaobjetos de vidrio y el canal microfluídico con una solución detergente al 1% disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos, luego enjuáguelos con agua desionizada. Posteriormente, lave el canal microfluídico PDMS y el portaobjetos de vidrio con isopropanol. Luego, enjuáguelos nuevamente con agua desionizada. Seque el canal microfluídico PDMS y el portaobjetos de vidrio con aire comprimido a 1 bar durante 1 min.
   NOTA: La estructura porosa del PDMS debe estar completamente seca para que la unión sea efectiva.
8. Coloque el portaobjetos de vidrio y el canal microfluídico en un limpiador de plasma (consulte la Tabla de materiales) y asegúrese de que las superficies a unir estén hacia arriba. Encienda el limpiador de plasma y trate el canal microfluídico y el portaobjetos de vidrio con plasma de aire a un flujo de aire de 1 SL / h (litro estándar por hora) durante 1 minuto. Conecte el canal microfluídico al portaobjetos de vidrio inmediatamente después de sacarlos del limpiador poniéndolos en contacto entre sí.
   NOTA: Asegúrese de no tocar las superficies tratadas, ya que esto podría afectar la unión. Al fabricar un dispositivo microfluídico con múltiples canales microfluídicos, exponga los canales microfluídicos simultáneamente y únalos en un solo paso.
9. Coloque el dispositivo microfluídico unido en una placa caliente a 80 °C durante al menos 15 minutos.
10. Almacene el dispositivo microfluídico en una placa de cultivo celular limpio hasta que comience el experimento.

3. Preparación de la suspensión bacteriana

1. Cultivar una población de Bacillus subtilis NCIB 3610 20 h antes del inicio del experimento inoculando directamente 3 ml de medio de cultivo de caldo nutriente nº 3 (ver Tabla de materiales) de un stock de glicerol congelado en un tubo de cultivo de 15 ml. Incubar en una incubadora agitadora a 30 °C y 200 rpm durante la noche (durante 16 h).
2. Hacer un subcultivo a partir del cultivo nocturno 4 h antes del inicio del experimento añadiendo 3 μL del cultivo nocturno en 3 ml de medio de cultivo fresco (dilución 1:1.000) en un tubo de cultivo de 15 ml. Incubar el subcultivo en una incubadora de agitación a 30 °C a 200 rpm durante 3,5-4 h para obtener una densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀) de 0,1.

4. Experimento de crecimiento de biofilm

1. Encienda la incubadora de cajas del microscopio 3 h antes del experimento para garantizar una temperatura estable de 25 °C. Monte la bomba de jeringa y los sensores de presión (consulte la Tabla de materiales).
2. Conecte el tubo de entrada y salida al dispositivo microfluídico. Inserte directamente una aguja (con un diámetro exterior de 0,6 mm) en el tubo de entrada para asegurar la conexión entre el tubo y la jeringa.
3. Coloque el dispositivo microfluídico, 30 ml de agua desionizada y 30 ml de medio de cultivo en un desecador al vacío y desgasifique durante al menos 1 h. Luego, tire lentamente del medio de cultivo y del agua desionizada en dos jeringas separadas de 30 ml.
   NOTA: Este paso es crucial para evitar la formación de burbujas en el canal mientras se lava con el medio de cultivo.
4. Monte el dispositivo microfluídico en el microscopio y coloque el tubo de salida en un contenedor de residuos.
   1. Conecte la jeringa llena de agua desionizada al canal microfluídico a través del tubo microfluídico e inyecte lentamente el agua hasta que salga de la salida del sensor de presión. Llene el sensor de presión con agua y enjuague todas las burbujas del tubo que conecta el canal microfluídico y el sensor de presión. Cierre la salida del sensor de presión con los tornillos dedicados al sensor de presión.
      NOTA: El procedimiento de llenado descrito garantiza que los cambios de presión en la entrada de los canales microfluídicos se registrarán con precisión. Cuando ejecute un experimento con múltiples canales microfluídicos, conecte cada canal a una jeringa separada para garantizar condiciones de flujo iguales en todos los canales.
5. Llene el resto del canal microfluídico con el agua desionizada.
6. Coloque un filtro de 1,2 μm (consulte la Tabla de materiales) en la jeringa de los medios de cultivo. Luego, retire la jeringa de agua y conecte cuidadosamente la jeringa de medios de cultivo al tubo microfluídico de entrada. Monte la jeringa en la bomba de la jeringa y enjuague el canal con el medio de cultivo a un caudal de 2 ml/h durante 1 h.
   NOTA: El filtro evita que las células bacterianas entren en la jeringa durante la carga. El lavado del canal microfluídico con los medios de cultivo eliminará las burbujas restantes en la estructura porosa.
7. Ajuste la bomba de jeringa al caudal deseado (aquí 1 ml / h) durante el experimento y ajuste la lectura de presión de los sensores de presión a cero.
   NOTA: Al establecer la lectura de presión inicial en cero, solo se medirá la diferencia de presión causada por el desarrollo de biopelículas durante el experimento.
8. Pipetear 1 ml del cultivo bacteriano a un OD₆₀₀ de 0,1 en un vial de centrífuga de 1,5 ml. Cargue el cultivo bacteriano en el canal microfluídico colocando el tubo de salida en el vial de la centrífuga. Después de esperar 5 minutos para eliminar cualquier burbuja de aire potencial de la salida de los tubos, retire 150 μL de solución bacteriana a una velocidad de flujo de 1 ml / h, hasta que el canal microfluídico se llene con el cultivo bacteriano.
9. Retire con cuidado el filtro de la jeringa del medio de cultivo y coloque la salida en el contenedor de residuos. Dejar las células bacterianas en condiciones de flujo cero en el canal microfluídico durante 3 h para permitir su fijación superficial en el medio poroso.
   NOTA: Se optimizó la eliminación de las células bacterianas en condiciones de flujo cero durante 3 h para la unión de la cepa bacteriana utilizada y se aseguró un cultivo bacteriano bien oxigenado. Otras cepas bacterianas pueden requerir más o menos tiempo.
10. Para comenzar el experimento, inicie el flujo ajustando la bomba de jeringa al caudal deseado (aquí 1 ml / h) y comience la lectura de presión a 1 Hz.
11. Adquiera imágenes de la biopelícula en crecimiento en el intervalo de tiempo, la configuración óptica y el aumento deseados.
    NOTA: En el presente estudio, las imágenes con un aumento de 4x en el modo de campo claro en 18 posiciones que abarcan todo el dominio del medio poroso se adquirieron cada 6 minutos durante 24 h.

5. Análisis de imágenes

1. Reconstruir todo el medio poroso a partir de las secuencias de imágenes grabadas mediante la unión de las imágenes de las 18 posiciones utilizando un software de análisis de imágenes (ver Tabla de materiales) y un algoritmo de costura²⁴.
2. Guarde las secuencias de imágenes unidas como una secuencia de imágenes singulares.
   NOTA: Si los archivos son demasiado grandes, en este punto, las imágenes se pueden reescalar y agrupar a un tamaño razonable para su posterior procesamiento.
3. Crea una máscara de los pilares del medio poroso para eliminarlos del análisis.
4. Eliminar el fondo de las imágenes dividiéndolas por su fondo con la imagen tomada a t = 0 h (Figura 2A) y binarizar las imágenes en un umbral adecuado para segmentar el biofilm (Figura 2B).
5. Calcule la saturación de la biopelícula calculando el área cubierta por la biopelícula (número de píxeles atribuidos a la biopelícula) en comparación con el área vacía del dominio poroso (Figura 3).

Resultados

Para el presente estudio, se utilizó un dispositivo microfluídico con tres canales microfluídicos paralelos con diferentes tamaños de poro (Figura 1) para estudiar sistemáticamente la formación de biopelículas en medios porosos. El proceso de formación de biopelículas se visualizó utilizando microscopía de campo claro. Las células bacterianas y la biopelícula aparecieron en las imágenes como píxeles más oscuros (Figura 2). Además, se observó un...

Discusión

Los análogos de medios porosos microfluídicos junto con sensores de presión proporcionan una herramienta adecuada para estudiar el desarrollo de biopelículas en medios porosos. La versatilidad en el diseño del medio poroso microfluídico, específicamente la disposición de los pilares, incluido el diámetro, las formas irregulares y el tamaño de poro, permite la investigación de muchas geometrías. Estas geometrías van desde poros individuales hasta obstáculos altamente complejos y dispuestos irregularmente que...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer