Микрофлюидная платформа для изучения биозасорения пористых сред

Резюме

Настоящий протокол описывает микрофлюидную платформу для изучения развития биопленки в квази-2D пористых средах путем сочетания микроскопической визуализации высокого разрешения с одновременными измерениями разности давлений. Платформа количественно оценивает влияние размера пор и скорости потока жидкости в пористых средах на биозасорение.

Аннотация

Бактериальные биопленки обнаруживаются в нескольких экологических и промышленных пористых средах, включая почвы и фильтрующие мембраны. Биопленки растут при определенных условиях течения и могут закупоривать поры, тем самым перенаправляя локальный поток жидкости. Способность биопленок закупоривать поры, так называемое биозасорение, может оказывать огромное влияние на локальную проницаемость пористой среды, создавая нарастание давления в системе и влияя на массовый поток через нее. Чтобы понять взаимодействие между ростом биопленки и потоком жидкости в различных физических условиях (например, при разных скоростях потока и размерах пор), в настоящем исследовании разработана микрофлюидная платформа для визуализации развития биопленки с использованием микроскопа в контролируемых извне, контролируемых физических условиях. Индуцированное биопленкой накопление давления в пористой среде может быть измерено одновременно с помощью датчиков давления и, позднее, коррелировано с поверхностным покрытием биопленки. Представленная платформа обеспечивает основу для системного подхода к исследованию биозасорения, вызванного биопленками в пористых средах в условиях течения, и может быть адаптирована для изучения изолятов окружающей среды или многовидовых биопленок.

Введение

Биопленки - бактериальные колонии, встроенные в самосекретируемую матрицу экстраполимерных веществ (EPS) - повсеместно используются в природных пористых средах, таких как почвы и водоносные горизонты¹, а также в технических и медицинских применениях, таких как биоремедиация², фильтрация воды³ и медицинские устройства⁴. Матрица биопленки состоит из полисахаридов, белковых волокон и внеклеточной ДНК^5,6 и сильно зависит от микроорганизмов, наличия питательных веществ^, а также условий окружающей среды⁷. Тем не менее, функции матрицы универсальны; Он образует каркас структуры биопленки, защищает микробное сообщество от механических и химических воздействий и в значительной степени отвечает за реологические свойства биопленок⁵.

В пористых средах рост биопленок может закупоривать поры, вызывая так называемое биозасорение. Развитие биопленки контролируется потоком жидкости и размером пор, определяемым как расстояние, разделяющее два столба, пористой среды ^8,9,10. Как размер пор, так и поток жидкости контролируют перенос питательных веществ и локальные силы сдвига. В свою очередь, растущая биопленка закупоривает поры, влияя на распределение скоростей жидкости 11,12,13, массоперенос и гидравлическую проводимость пористой среды ^14,15. Изменения гидравлической проводимости отражаются через повышение давления в замкнутых системах^16,17,18,19. Современные микрофлюидные исследования в области развития биопленки и биозасорения сосредоточены на изучении влияния скоростей потока в однородных геометрических формах^16,20 (т.е. с особым размером пор) или гетерогенных пористых средах^12,21,22. Однако для того, чтобы распутать влияние скоростей потока и размера пор на развитие биопленки и результирующие изменения давления в биозасоренной пористой среде, требуется высококонтролируемая и универсальная экспериментальная платформа, позволяющая параллельно изучать различные геометрии пористых сред и условия окружающей среды.

В настоящем исследовании представлена микрофлюидная платформа, которая сочетает в себе измерения давления с одновременной визуализацией развивающейся биопленки в пористой среде. Благодаря своей газопроницаемости, биосовместимости и гибкости в конструкции геометрии канала микрофлюидное устройство из полидиметилсилоксана (PDMS) является подходящим инструментом для изучения развития биопленки в пористых средах. Микрофлюидика позволяет контролировать физические и химические условия (например, поток жидкости и концентрацию питательных веществ) с высокой точностью, имитируя среду микробных местообитаний²³. Кроме того, микрофлюидные устройства могут быть легко отображены с микрометрическим разрешением с использованием оптического микроскопа и объединены с онлайн-измерениями (например, локальным давлением).

В данной работе эксперименты сосредоточены на изучении влияния размера пор в однородной пористой среде-аналоге при контролируемых условиях навязанного течения. Поток питательной среды нагнетается с помощью шприцевого насоса, а перепад давления через микрофлюидный канал измеряется одновременно датчиками давления. Развитие биопленки инициируется посевом планктонной культуры Bacillus subtilis в микрофлюидный канал. Регулярная визуализация развивающейся биопленки и анализ изображений позволяет получить информацию о покрытии поверхности в различных экспериментальных условиях. Коррелированная информация об изменении давления и степени биозасорения дает важные исходные данные для оценки проницаемости биозасоренных пористых сред.

протокол

1. Подготовка кремниевой пластины

1. Спроектируйте геометрию микрофлюидного канала в программном обеспечении автоматизированного проектирования (САПР; см. Таблицу материалов) и распечатайте ее на прозрачной пленке для создания фотошаблона (рис. 1А).
2. Изготовьте мастер-форму с помощью мягкой литографии (в условиях чистого помещения), выполнив следующие действия.
   1. Выпекайте кремниевую пластину при температуре 200 °C в течение 2 часов.
   2. Поместите пластину в центр спин-коутера и налейте на пластину фоторезист SU8 3050 (см. Таблицу материалов). Отжимное покрытие при 1 700 об/мин в течение 40 с временем нарастания 10 с/100 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры спинового покрытия были установлены для получения толщины мишени 100 мкм для SU8 3050.
   3. После процесса отжима кремниевая пластина мягко запекается при 65 ° C в течение 600 с и 95 ° C в течение 2,700 с. Дайте вафле остыть при комнатной температуре в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ночное охлаждение улучшает адгезию SU8 к пластине.
   4. Поместите фотошаблон (шаг 1.1) на пластину и подвергните ее воздействию ультрафиолетового света с энергией экспозиции 250 мДж/^см2 и длиной волны 350 нм.
   5. После экспозиции запекайте открытую подложку при 65 ° C в течение 60 с и 95 ° C в течение 300 с.
   6. Разработайте кремниевую пластину для получения мастер-формы, погрузив ее в стакан, заполненный проявителем mrDev600 (см. Таблицу материалов). Осторожно встряхните стакан в течение 1,800 с, чтобы смыть неполимеризованный резист. Затем промойте брызгами, распылив изопропанол на кремниевую пластину, и высушите на воздухе.
   7. Запекайте кремниевую пластину при температуре 200 °C в течение 1,800 с.
3. Силанизировать мастер-форму путем осаждения из паровой фазы 20 мкл трихлор (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил) силана (см. Таблицу материалов), помещенного на предметное стекло рядом с формой на 40 мин в вакуумном эксикаторе, создавая манометрическое давление 100 мбар.

2. Изготовление микрофлюидного устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная здесь процедура изготовления предназначена для микрофлюидного устройства с одним микрофлюидным каналом. Однако тот же метод может быть применен для изготовления микрофлюидного устройства с несколькими микрофлюидными каналами параллельно.

1. Смешайте эластомер со сшивающим агентом в соотношении 10:1 (см. Таблицу материалов), чтобы приготовить смесь PDMS. Перемешивайте смесь, пока она не перемешается равномерно и не станет непрозрачной из-за закрытых пузырьков воздуха.
2. Дегазируйте смесь в вакуумном эксикаторе, создавая манометрическое давление 100 мбар до тех пор, пока захваченные пузырьки воздуха не будут удалены и она не станет прозрачной. Время, необходимое для дегазации, обычно составляет 30 минут.
3. Поместите мастер-форму (шаг 1) в чашку для культивирования клеток (см. Таблицу материалов). Вылейте 20 г смеси PDMS на мастер-форму, чтобы получить каналы с конечной толщиной 5 мм.
4. Выпекайте мастер-форму при температуре 70 °C в течение 2 часов.
5. Разрежьте отвержденный PDMS вокруг микрофлюидного канала (на расстоянии примерно 3 мм) с помощью лезвия, а затем снимите микрофлюидный канал PDMS с мастер-формы.
6. Чтобы создать вход и выход микрофлюидных каналов, проделайте отверстия с помощью биопсийного пуансона (диаметр 1,5 мм) на его концах (верхняя часть треугольников, см. рис. 1А). Проделайте одно дополнительное отверстие в центре впускного треугольника, чтобы позже установить датчик давления.
7. Промойте предметное стекло и микрофлюидный канал имеющимся в продаже 1% раствором моющего средства (см. Таблицу материалов) в течение 5 мин, затем промойте их деионизированной водой. После этого промойте микрофлюидный канал PDMS и предметное стекло изопропанолом. Затем снова промойте их деионизированной водой. Высушите микрофлюидный канал PDMS и предметное стекло сжатым воздухом при давлении 1 бар в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пористая структура PDMS должна быть полностью сухой, чтобы склеивание было эффективным.
8. Поместите предметное стекло и микрофлюидный канал в плазменный очиститель (см. Таблицу материалов) и убедитесь, что склеиваемые поверхности обращены вверх. Включите плазменный очиститель и обработайте микрофлюидный канал и предметное стекло воздушной плазмой при расходе воздуха 1 SL/ч (стандартный литр в час) в течение 1 мин. Прикрепите микрофлюидный канал к предметному стеклу сразу после извлечения его из очистителя, соприкоснувшись друг с другом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к обработанным поверхностям, так как это может повлиять на склеивание. При изготовлении микрофлюидного устройства с несколькими микрофлюидными каналами одновременно экспонируйте микрофлюидные каналы и соединяйте их за один шаг.
9. Поместите связанное микрофлюидное устройство на конфорку с температурой 80 °C не менее чем на 15 минут.
10. Храните микрофлюидное устройство в чистой чашке для культивирования клеток до начала эксперимента.

3. Приготовление бактериальной суспензии

1. Вырастите популяцию Bacillus subtilis NCIB 3610 за 20 ч до начала эксперимента путем прямой инокуляции 3 мл питательного бульона питательной питательной питательной среды No 3 (см. Таблицу материалов) из замороженного глицеринового бульона в культуральную пробирку объемом 15 мл. Инкубировать в встряхивающем инкубаторе при 30 °C и 200 об/мин в течение ночи (в течение 16 часов).
2. Сделайте субкультуру из ночной культуры за 4 ч до начала эксперимента, добавив 3 мкл ночной культуры в 3 мл свежей питательной среды (разведение 1:1000) в пробирке для культивирования 15 мл. Инкубируют субкультуру в встряхивающем инкубаторе при 30 °C при 200 об/мин в течение 3,5-4 ч до получения оптической плотности при 600 нм (OD₆₀₀) 0,1.

4. Эксперимент по выращиванию биопленки

1. Включите ящик инкубатора микроскопа за 3 ч до начала эксперимента, чтобы обеспечить стабильную температуру 25 °С. Установите шприцевой насос и датчики давления (см. Таблицу материалов).
2. Подсоедините впускную и выпускную трубки к микрофлюидному устройству. Непосредственно вставьте иглу (с наружным диаметром 0.6 мм) во впускную трубку, чтобы закрепить соединение между трубкой и шприцем.
3. Поместите микрофлюидное устройство, 30 мл деионизированной воды и 30 мл питательной среды в вакуумный эксикатор и дегазируйте их в течение не менее 1 часа. Затем медленно наберите питательную среду и деионизированную воду в два отдельных шприца по 30 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для предотвращения образования пузырьков в канале при промывке питательной средой.
4. Установите микрофлюидное устройство на микроскоп и поместите выпускную трубку в контейнер для отходов.
   1. Подсоедините шприц, наполненный деионизированной водой, к микрофлюидному каналу через микрофлюидную трубку и медленно вводите воду, пока она не выйдет из выходного отверстия датчика давления. Наполните датчик давления водой и промойте все пузырьки из трубки, соединяющей микрофлюидный канал и датчик давления. Закройте выходное отверстие датчика давления винтами, предназначенными для датчика давления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная процедура наполнения гарантирует, что изменения давления на входе в микрофлюидные каналы будут точно зарегистрированы. При проведении эксперимента с несколькими микрофлюидными каналами подключите каждый канал к отдельному шприцу, чтобы обеспечить одинаковые условия потока во всех каналах.
5. Заполните остальную часть микрофлюидного канала деионизированной водой.
6. Поместите фильтр размером 1,2 мкм (см. Таблицу материалов) на шприц питательной среды. Затем извлеките шприц с водой и осторожно подсоедините шприц питательной среды к входной микрофлюидной трубке. Установите шприц на шприцевой насос и промывайте канал питательной средой со скоростью потока 2 мл/ч в течение 1 часа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр предотвращает попадание бактериальных клеток в шприц во время загрузки. Промывка микрофлюидного канала питательной средой удалит оставшиеся пузырьки в пористой структуре.
7. Установите шприцевой насос на желаемую скорость потока (здесь 1 мл / ч) во время эксперимента и установите показания давления датчиков давления на ноль.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установив начальное показание давления на ноль, будет измеряться только разность давлений, вызванная образованием биопленки во время эксперимента.
8. Пипетка 1 мл бактериальной культуры при OD₆₀₀ 0,1 во флаконе центрифуги объемом 1,5 мл. Загрузите бактериальную культуру в микрофлюидный канал, поместив выпускную трубку во флакон центрифуги. Подождав 5 минут, чтобы удалить любые потенциальные пузырьки воздуха из выходного отверстия пробирки, извлеките 150 мкл бактериального раствора со скоростью потока 1 мл / ч, пока микрофлюидный канал не будет заполнен бактериальной культурой.
9. Осторожно снимите шприцевой фильтр питательной среды и поместите выпускное отверстие в контейнер для отходов. Оставьте бактериальные клетки в условиях нулевого потока в микрофлюидном канале на 3 часа, чтобы обеспечить их поверхностное прикрепление в пористой среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставление бактериальных клеток в условиях нулевого потока в течение 3 часов было оптимизировано для прикрепления бактериального штамма, используемого при обеспечении хорошо насыщенной кислородом бактериальной культуры. Другим бактериальным штаммам может потребоваться больше или меньше времени.
10. Чтобы начать эксперимент, запустите поток, установив шприцевой насос на желаемую скорость потока (здесь 1 мл / ч) и начните считывание давления с 1 Гц.
11. Получение изображений растущей биопленки с нужным интервалом времени, оптической конфигурацией и увеличением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании изображения с 4-кратным увеличением в режиме яркого поля в 18 положениях, охватывающих весь домен пористой среды, были получены каждые 6 минут в течение 24 часов.

5. Анализ изображений

1. Реконструируйте всю пористую среду из последовательностей изображений, записанных путем сшивания изображений из 18 позиций с использованием программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов) и алгоритма^{сшивания 24}.
2. Сохраните сшитые последовательности изображений как последовательность отдельных изображений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если файлы слишком большие, на этом этапе изображения можно изменить масштаб и объединить их до разумного размера для дальнейшей обработки.
3. Создайте маску из столбов пористой среды, чтобы удалить их из анализа.
4. Удалите фон изображений, разделив их по фону с изображением, полученным при t = 0 h (рис. 2A), и бинаризируйте изображения на пороге, подходящем для сегментации биопленки (рис. 2B).
5. Вычислите насыщенность биопленки, вычислив площадь, покрытую биопленкой (количество пикселей, приписываемых биопленке), по сравнению с областью пустоты пористого домена (рис. 3).

Результаты

Для настоящего исследования было использовано микрофлюидное устройство с тремя параллельными микрофлюидными каналами с различными размерами пор (рис. 1) для систематического изучения образования биопленки в пористых средах. Процесс образования биопленки визуализиро...

Обсуждение

Микрофлюидные пористые аналоги в сочетании с датчиками давления обеспечивают подходящий инструмент для изучения развития биопленки в пористых средах. Универсальность конструкции микрофлюидной пористой среды, в частности, расположение столбов, включая диаметр, неправильные формы и ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer