多孔質媒体中のバイオクラッシングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

要約

本プロトコルは、高解像度顕微鏡イメージングと同時圧力差測定を組み合わせることにより、 準2D多孔質媒体におけるバイオフィルムの発生を研究するためのマイクロ流体プラットフォームについて説明しています。このプラットフォームは、バイオ詰まりに対する多孔質媒体中の細孔径と流体流量の影響を定量化します。

要約

細菌バイオフィルムは、土壌やろ過膜など、いくつかの環境および工業用多孔質媒体に含まれています。バイオフィルムは特定の流動条件下で成長し、細孔を詰まらせ、それによって局所的な流体の流れをリダイレクトする可能性があります。バイオフィルムが細孔を詰まらせる能力、いわゆるバイオクラックは、多孔質媒体の局所的な透過性に多大な影響を及ぼし、システム内に圧力が上昇し、システムを通る質量の流れに影響を与える可能性があります。本研究では、異なる物理的条件(例えば、異なる流速および細孔サイズ)におけるバイオフィルムの成長と流体の流れとの間の相互作用を理解するために、外部から課され制御された物理的条件下で顕微鏡を使用してバイオフィルムの発達を視覚化するためのマイクロ流体プラットフォームを開発する。多孔質媒体中のバイオフィルム誘発圧力上昇は、圧力センサーを使用して同時に測定することができ、後でバイオフィルムの表面被覆率と相関させる。提示されたプラットフォームは、フロー条件下で多孔質媒体中のバイオフィルムによって引き起こされるバイオロギングを調査するための体系的なアプローチのベースラインを提供し、環境分離株または複数種のバイオフィルムの研究に適応することができます。

概要

バイオフィルム(高分子外物質(EPS)の自己分泌マトリックスに埋め込まれた細菌コロニー)は、土壌や帯水層¹などの天然多孔質媒体や、バイオレメディエーション²、水ろ過³、医療機器⁴などの技術的および医学的用途に遍在しています。バイオフィルムマトリックスは、多糖類、タンパク質繊維、および細胞外^DNA5,6で構成されており、微生物、栄養素の利用可能性、および環境条件に強く依存します⁷。それでも、行列の関数は普遍的です。バイオフィルム構造の足場を形成し、微生物群集を機械的および化学的ストレスから保護し、バイオフィルムのレオロジー特性に大きく関与しています⁵。

多孔質媒体では、バイオフィルムの成長が毛穴を詰まらせ、いわゆるバイオ目詰まりを引き起こす可能性があります。バイオフィルムの発達は、多孔質媒体^8、9、10

プロトコル

1. シリコンウェーハの準備

1. コンピュータ支援設計(CAD、 材料表を参照)ソフトウェアでマイクロ流体チャネルの形状を設計し、それを透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します(図1A)。
2. 以下の手順に従って、ソフトリソグラフィー(クリーンルーム条件下)でマスターモールドを製作します。
   1. シリコンウェーハを200°Cで2時間焼きます。
   2. ウェーハをスピンコーターの中央に置き、SU8 3050フォトレジスト( 材料表を参照)をウェーハに注ぎます。スピンコートは1,700rpmで40秒間、ランプタイムは10秒/100rpmです。
      注:スピンコーティングパラメータは、SU8 3050のターゲット厚さ100μmになるように設定されました。
   3. スピンコーティングプロセスの後、シリコンウェーハを65°Cで600秒間、95°Cで2,700秒間ソフトベークします。ウェーハを室温で一晩冷まします。
      注意: 一晩冷却すると、SU8のウェーハへの接着力が向上します。
   4. フォトマスク(ステップ1.1)をウェーハ上に置き、露光エネルギー250mJ/^cm2 、波長350nmのUV光に露光します。
   5. 露光後、露光した基板を65°Cで60....

結果

本研究では、孔径の異なる3つの平行なマイクロ流体チャネルを備えたマイクロ流体デバイス(図1)を使用して、多孔質媒体中のバイオフィルム形成を体系的に研究しました。バイオフィルム形成過程は、明視野顕微鏡を用いて可視化した。細菌細胞とバイオフィルムは、より暗いピクセルとして画像に現れました(図2)。さらに、緩やかな目詰まりプ.......

ディスカッション

圧力センサーと組み合わせたマイクロ流体多孔質媒体類似体は、多孔質媒体中のバイオフィルム発達を研究するための適切なツールを提供します。マイクロ流体多孔質媒体の設計における多様性、特に直径、不規則な形状、孔径などの柱の配置により、多くの形状の調査が可能になります。これらの形状は、単一の細孔から、異なる天然(例えば、土壌)および工業用(例えば、膜およびフィル?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrodisc 25 mm Syringe Filter, 1.2 µm Versapor Membrane	Pall Corporation	PN4190	1.2 µm filters
BD 10 mL Syringe (Luer-Lock)	BD	300912	used to fill the channel with deionised water
Box Incubator	Life Imaging Services		used to have a stable temperature during the biofilm growth experiment
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge vial	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		syringe pump
CorelCAD	CorelDRAW		software used to design the microfluidic channel geometries
Culture tubes (14 mL, sterile)	greiner bio-one		Culture tubes
Drying oven, VENTI-Line	VWR		Oven to cure the PDMS
Handy	Migros		Detergent solution
Hot plate with temperature control	VRW		to cure the PDMS-glass bonding after plasma treatment
ImageJ	FIJI		Image analysis software
Innova 42 Inc Shaker (New Brunswick)	Eppendorf		Incubator
Isopropanol (> 99.8%)	Sigma Aldrich	67-63-0
Masterflex transfer tubing	Masterflex	HV-06419-05	0.020'' ID, 0.06'' OD
Micro Slides, Plain, 75 x 60 mm	Corning	2947-75X50	Glass slides
Microfluidic pressure sensor (1 bar)	Elveflow		Pressure sensors
Miltex Biopsy puncher, diameter 1.5 mm	Integra		Puncher to make the inlet and outlet holes of the microfluidic channel
mrDev600 developer	Microresist
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Microscope
Nutrient broth n°3	Sigma Aldrich
Omnifix Syringe with Luer-Lock	B.Braun		syringes of different volume
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	used to plasma bond the PDMS and the glass slide
Precision wipes (Kimtech Science)	Kimberly Clark	KCP-7552	to dry the glass slide
Scale	VWR-CH	611-2605	used to weigh the elastomer to crosslinking agent ratio
Silicon wafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N//Phos <100> 1-10 Ω cm
Spincoater, Spin module SM150	Sawatec
SU8 3050 Photoresist	Kayakuam
Süss MA6 Mask aligner	SUSS MicroTec Group		used to align the chrome-glass mask
Sylgard 184	Dow Corning		silicone elastomer kit; curing agent
Techni Etch Cr01	Technic		Technic
Tissue culture dish 150	TPP	93150
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H perfluorooctyl) silane	Sigma Aldrich	Sigma Aldrich	used to silanize the silicane wafer
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer