复合盐胁迫对辣椒种子萌发的影响及耐盐性分析

摘要

下面的论文介绍了一种方案，用于测量两种辣椒品种的种子萌发、幼苗生长和生理指标，这些品种在响应六种混合盐浓度时具有耐盐性差异。该协议可用于评估辣椒品种的耐盐性。

摘要

为确定辣椒在萌发期的耐盐性和生理机制，以耐盐性差异较大的红天湖101和新乡8品种为研究材料。使用六种 0、3、5、10、15 和 20 g/L 的混合盐浓度，使用等摩尔比得出的 Na 2 CO 3、NaHCO₃、NaCl、CaCl 2、MgCl 2、MgSO₄ 和 Na ₂SO₄。为确定其效果，测定种子萌发、幼苗生长和生理等相关指标，并利用隶属函数分析对耐盐性进行综合评价。结果表明:随着混合盐浓度的增加，两个品种的萌发势、发芽指数、发芽率、种子萌发活力指数、根长和根鲜重显著降低，而相对盐率逐渐增加;地上下胚轴长度和鲜重先增加后降低，丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性先降低后增加。红天湖101种子的发芽势、发芽指数、萌发率、种子萌发活力指数、根长、根鲜重、MDA和Pro含量以及CAT活性均高于新乡8号。但红天湖101的下胚轴长度、地上鲜重和相对盐率均低于新乡8号。耐盐性综合评价表明，随着混合盐浓度的增加，两个隶属函数指标的总加权值先增大后减小。与隶属函数值最高的5 g/L相比，盐浓度为3 g/L、10 g/L和15 g/L的指数分别降低了4.7%—11.1%、25.3%—28.3%和41.4%—45.1%。本研究为耐盐辣椒品种的选育提供了理论指导，分析了耐盐和耐盐栽培的生理机制。

引言

盐度是全球作物生产力的主要限制因素¹.目前，世界上近19.5%的灌溉土地和2.1%的旱地受到盐碱化的影响，每年约有1%的农田退化为盐碱地。到2050年，预计50%的耕地将受到盐碱化的影响^2，3。除了自然因素，如天然岩石风化和沿海附近或周围的咸雨水，地表蒸发快，降雨量少，农业管理方法不合理，加剧了土壤盐碱化的过程。土壤盐碱化抑制了植物根系的生长，并减少了水分和养分从植物根部到叶子的吸收和运输。这种抑制导致生理性缺水、营养失衡和离子毒性，导致作物产量下降和作物产量完全丧失。耕地盐碱化正逐渐成为影响全球农业粮食生产的最关键的非生物胁迫因素之一⁴.盐胁迫减少了可用于农业的耕地，这可能导致未来农产品供需之间的严重不平衡。因此，探讨土壤盐渍化对作物生长的影响及生理生化机制，有利于培育耐盐品种、盐渍土可持续利用和农产品安全。

辣椒（辣椒 L.）因其高营养和药用价值而在世界各地种植。例如，辣椒素是一种生物碱，负责胡椒的辛辣味。辣椒素可用于缓解疼痛， 减肥， 改善心血管， 胃肠道， 和呼吸系统， 以及其他^{几种应用.}胡椒还富含生物活性物质，尤其是不同的抗氧化化合物（类胡萝卜素、酚类和类黄酮）和维生素^{C 6}。目前，据报道，辣椒是我国种植面积最大的蔬菜作物，年种植面积超过1.5×10⁶ 公顷，占我国蔬菜种植总面积的8%-10%。辣椒产业已成为我国最大的蔬菜产业之一，^产值最高7。然而，辣椒栽培经常受到多种生物（害虫和真菌）和非生物胁迫，特别是盐胁迫，对种子萌发、生长和发育有直接的负面影响，导致辣椒果实产量^{和品质下降}8.

种子萌发是植物与环境相互作用的第一阶段。种子萌发对周围介质的波动高度敏感，特别是土壤盐胁迫可能对生理和代谢产生逆转作用，最终扰乱作物的正常生长、发育和形态^发生9。在以往的研究中，广泛研究了盐胁迫下辣椒种子的萌发和幼苗生长;然而，大多数研究使用NaCl作为诱导应力的唯一盐¹⁰，^11，12。然而，土壤盐害主要是由于钠盐、钙盐和镁盐解离产生的Na+、^Ca2+、Mg²⁺、Cl-、CO₃ 2-和SO^{4 2-}离子毒性。由于离子之间的协同作用和拮抗作用，混合盐和单一盐对作物生长发育的影响可能大不相同。然而，辣椒种子在混合盐中萌发和生长的相应特征尚不清楚。因此，本研究以耐盐性差异显著的2个辣椒品种为材料。分析7种盐等摩尔混合后不同盐浓度对辣椒种子萌发、生长及生理生化指标的影响，可以揭示辣椒种子萌发对盐胁迫的响应机制。还可为强壮辣椒幼苗的栽培以及盐碱耕地的高产优质栽培提供理论依据。

研究方案

注意:本文提出了一种评估不同混合盐胁迫下辣椒种子萌发和幼苗生长的响应特征和内部机制的协议，可作为种子耐盐性评估的参考方法。

1. 实验准备

1. 为栽培品种准备作物种子——耐盐性强的红天湖101和低耐盐的新乡8号。
2. 制备0.2%KMnO₄ 溶液作为种子消毒试剂。首先，称取 4.0 g KMnO₄，然后加入 2，000 mL 蒸馏水。
   注意:高锰酸钾由于其强氧化性通常不稳定;因此，在使用前立即准备。
3. 使用七种盐制备混合盐，包括碳酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、氯化钙、氯化镁、硫酸镁和硫酸钠¹³。各加入相同摩尔量，依次分别占混合盐总质量比的14.8%、11.7%、8.2%、15.5%、13.3%、16.7%和19.8%。
4. 准备培养皿（一次性使用）和滤纸（中速定性滤纸），直径均为9厘米。
   注意:培养皿的材料可以更改;但是，培养皿和滤纸的直径必须相同。

2.种子浸泡和发芽准备

1. 为了优化种子，从每个品种中选择大小一致、颗粒饱满的辣椒种子，红天湖101和新乡8种子的平均直径分别为4.2 mm和3.7 mm。根据测试工作负载计算选择的种子总数。
2. 对于种子消毒，将选定的辣椒种子浸泡在0.2%KMnO₄ 溶液中15分钟，然后用蒸馏水冲洗五次。
3. 对于种子浸泡，将灭菌的种子转移到蒸馏水中，并让它们浸泡24小时。用蒸馏水冲洗种子几次并干燥以备进一步使用。
   注意:不同作物的种子浸泡时间可能会有所不同。

3. 种子萌发和幼苗生长

1. 制备六种浓度的混合盐:0（对照）、3、5、10、15 和 20 g/L。 使用电导率仪测量盐溶液的电导率;溶液电导率EC值分别为0.092、3.05、4.73、8.33、11.53和15.22 ms/cm。
2. 对于种子制备，将40个辣椒种子均匀地放入带有两层滤纸的培养皿中。准备种子进行六次实验处理，并重复每次处理五次。
3. 对于种子发芽，向培养皿中加入适量的六种混合盐浓度，以确保滤纸保持湿润。将种子放入28°C和80%空气湿度的空气培养箱中，以便在黑暗中发芽。
4. 种子发芽后，让幼苗在播种后在培养箱中的光照（光照强度约为450勒克斯;光照周期为12/12小时）下继续生长14天。幼苗生长阶段的温度和湿度必须与发芽阶段的温度和湿度相同。
5. 每12小时补充培养皿中的溶液以保留湿润的滤纸，并每24小时用相应浓度的混合盐溶液完全洗涤滤纸，以保持培养皿中恒定的混合盐浓度。
   注意:添加到湿种子中的盐溶液量可以根据种子发芽和生长阶段进行调整。有许多方法可用于保持培养皿中盐溶液的恒定浓度。除了本实验中描述的方法外，还可以使用按重量添加蒸馏水的策略。

4. 指标的测量和计算

1. 种子发芽指数的测定
   1. 播种后每天确定发芽率，胚根破种皮达到种子直径长度的一半作为发芽标记。
   2. 使用以下公式计算发芽率、发芽潜力、相对盐率、发芽指数和种子萌发活力指数:
      发芽率（%）=（播种后第7天的正常发芽种子数/测试种子数）×100
      发芽潜力（%）=（播种后第3天的正常发芽种子数/测试种子数）×100
      相对盐率（%）=（对照发芽率-处理发芽率）/对照发芽率×100
      使用播种后第7天的种子发芽率计算
      发芽指数 （GI） = ∑ [Gt/dt]
      其中Gt是指播种后一段时间（t）的种子发芽数，Dt是指相应的发芽天数
      种子萌发活力指数（VI）=GI x S
      其中 S 是根长度
2. 幼苗生长指数的测定
   1. 在播种后第14天，从每个培养皿中随机选择10个代表性幼苗，并测量根长和下胚轴长度。
   2. 用刀将辣椒幼苗分成两部分:胚根和地上部分。擦拭幼苗上的水分，并分别称量幼苗以确定新鲜重量。
3. 确定辣椒中的抗氧化酶活性、丙二醛 （MDA） 水平和脯氨酸 （Pro） 含量，如下所示。
   1. 为了保存辣椒幼苗，请在播种后第14天从每次处理中选择具有代表性的全辣椒幼苗（约24.0克）。除去地表水后，立即将幼苗在液氮中冷冻1分钟，并将其储存在超低温（-80°C）的冰箱中。
      注意:超低温冰箱中储存的辣椒苗样品数量应足够，以防某些指标需要重新测试。
   2. 从收集的每次处理中取出约1.0g幼苗样品，一式三份。将幼苗样品放入离心管中，加入液氮，用研磨棒研磨样品，以确定幼苗的生理指标。确定的指标和测量方案如下所示。
   3. 使用市售试剂盒（基于分光光度法）测定每个因子的幼苗保护酶活性（过氧化物酶 [POD]、过氧化氢酶 [CAT]、超氧化物歧化酶 [SOD]）、丙二醛 （MDA） 和脯氨酸 （Pro） 含量¹⁴.
      注意:早期的观察表明，15和20 g / L混合盐浓度之间的盐胁迫没有差异。因此，仅测量五种盐浓度（0、3、5、10 和 15 g/L）。
4. 使用隶属函数法对耐盐性进行综合评估
   注:隶属函数采用模糊数学方法，将定性评价转换为定量评价¹⁵，评价受盐害影响的各种生理指标。
   1. 使用以下公式计算隶属函数的值，公式由刘周斌等人¹⁵:
      Ri = （Xi - Xmin）/（Xmax - Xmin）
      如果性状与耐盐性呈负相关，则使用以下方法计算逆隶属函数:
      Ri = 1 - （Xi - Xmin）/（Xmax - Xmin）
      累加每个生理指标的隶属值，其中Xi是某个性状的测量值，Xmax和Xmin分别是Xi的最大值和最小值，Ri是该性状的隶属值。
   2. 包括以下相关指标:种子萌发特性（萌发潜力、萌发率、萌发指数、种子萌发活力指数）、幼苗萌发期生长特性（根长、下胚轴长、根鲜重和地上鲜重）、MDA、Pro和保护酶活性（CAT、POD、SOD）用于隶属函数值计算。隶属函数值是从每个指标中获取的。
5. 使用电子表格和 SPSS 软件（版本 22.0）分析和处理测试数据，并应用最小显著差异 （LSD） 方法进行多重比较以识别显著差异。利用Pearson相关性分析研究复合盐胁迫下辣椒种子萌发与幼苗生理指标的相关性。

结果

种子萌发特性
随着混合盐浓度的增加，红天湖101和新乡8的发芽势和发芽指数显著降低。两个品种的盐浓度从0-3 g/L急剧下降，盐浓度从3-20 g/L缓慢而稳定地下降（图1A，B）。随着混合盐浓度的增加，两个品种的发芽率逐渐降低，而品种的相对盐率逐渐增加。在3-15 g/L盐浓度下，发芽率和相对盐率无显著差异。然而，在所有其他盐浓度下，差异是显?...

讨论

该研究方法包括影响实验结果准确性的四个关键步骤。首先，由于高盐浓度溶液中溶质含量增加导致混合盐溶解不良，以及氯化钙等试剂在水中更难溶解的溶解度低，因此称量的试剂必须在研钵中充分研磨。此外，在确定容量之前，必须 通过超声波溶解 试剂。其次，每次必须完全摇动配置的盐溶液，并将其添加到培养皿中以供使用。第三，培养皿加入盐溶液后必须保留合适的水层，每个?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Centrifugal machine	Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China	TGL-16M
Centrifuge tube	None	None
Conductivity meter	Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China	DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box	Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China	PSX-280H
Digital display vernier caliper	Deli Group Co., Ltd.,China	DL90150
Electronic balance	Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China	ME802E/02
Filter paper	Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China	GB/T1914-2017
Grinding rod	None	None
Hongtianhu  101	Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China	11933955/100147K1-137
Ice machine	Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China	IM150G
Liquid nitrogen	None	None
Magnesium chloride	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Magnesium sulfate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Petri dish	Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China	I-000163
Pocket knife	None	None
Potassium permanganate (KMnO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Pure water equipment	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China	UPT-I-20T
Sodium bicarbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium carbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium chloride	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium sulfate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Test kit	Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China	Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China	760CRT
Xinxiang 8	Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China	GPD Pepper 2017(360013)