Analyse des Einflusses von zusammengesetztem Salzstress auf die Samenkeimung und Salztoleranzanalyse von Pfeffer (Capsicum annuum L.)

Zusammenfassung

Das folgende Papier stellt ein Protokoll zur Messung der Samenkeimung, des Keimlingswachstums und der physiologischen Indizes von zwei Paprikasorten mit Salztoleranzunterschieden als Reaktion auf sechs gemischte Salzkonzentrationen vor. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Salztoleranz von Paprikasorten zu bewerten.

Zusammenfassung

Um die Salztoleranz und den physiologischen Mechanismus von Pfeffer (Capsicum annuum L.) im Keimstadium zu bestimmen, werden die Sorten Hongtianhu 101 und Xinxiang 8, die große Unterschiede in der Salztoleranz aufweisen, als Untersuchungsmaterial verwendet. Es werden sechs Mischsalzkonzentrationen von 0, 3, 5, 10, 15 und 20 g/L verwendet, die unter Verwendung gleicher molarer Verhältnisse vonNa2CO3, NaHCO3, NaCl, CaCl2,_MgCl2, MgSO4 und _Na2SO4 abgeleitet wurden. Um ihre Auswirkungen zu bestimmen, werden die zugehörigen Indizes der Samenkeimung, des Keimlingswachstums und der Physiologie gemessen, und die Salztoleranz wird mit Hilfe der Mitgliedschaftsfunktionsanalyse umfassend bewertet. Die Ergebnisse zeigen, dass mit zunehmender Mischsalzkonzentration das Keimpotenzial, der Keimindex, die Keimrate, der Keimungsindex der Samen, die Wurzellänge und das Frischgewicht der beiden Sorten signifikant abnehmen, während die relative Salzrate allmählich zunimmt. Die Hypokotyllänge und das oberirdische Frischgewicht nehmen zuerst zu und nehmen dann ab, während die Aktivität von Malondialdehyd (MDA), Prolin (Pro), Katalase (CAT), Peroxidase (POD) und Superoxiddismutase (SOD) abnimmt und dann zunimmt. Das Keimpotenzial, der Keimindex, die Keimrate, der Keimungsindex der Samen, die Wurzellänge, das Frischgewicht der Wurzel, der MDA- und Pro-Gehalt und die CAT-Aktivität der Hongtianhu 101-Samen sind für alle hier verwendeten Salzkonzentrationen höher als die von Xinxiang 8. Allerdings sind die Hypokotyllänge, das oberirdische Frischgewicht und der relative Salzgehalt in Hongtianhu 101 niedriger als in Xinxiang 8. Die umfassende Auswertung der Salztoleranz zeigt, dass die gewichteten Gesamtwerte der beiden Mitgliedschaftsfunktionsindizes mit zunehmender Mischsalzkonzentration zunächst ansteigen und dann abnehmen. Im Vergleich zu 5 g/L, das den höchsten Mitgliedschaftsfunktionswert aufweist, sinkt der Index bei Salzkonzentrationen von 3 g/L, 10 g/L und 15 g/L um 4,7%-11,1%, 25,3%-28,3% bzw. 41,4%-45,1%. Diese Studie liefert eine theoretische Anleitung für die Züchtung salztoleranter Pfeffersorten und eine Analyse der physiologischen Mechanismen, die bei der Salztoleranz und dem salztoleranten Anbau eine Rolle spielen.

Einleitung

Der Salzgehalt ist weltweit ein wichtiger limitierender Faktor für die Pflanzenproduktivität¹. Derzeit sind fast 19,5 % der bewässerten und 2,1 % der trockenen Flächen der Welt vom Salzgehalt betroffen, und etwa 1 % der landwirtschaftlichen Nutzfläche degeneriert jedes Jahr zu Salz-Alkali-Böden. Bis 2050 sollen 50 % der Ackerfläche von Versalzung betroffen sein ^2,3. Zusätzlich zu natürlichen Faktoren wie natürlicher Gesteinsverwitterung und salzigem Regenwasser in der Nähe oder in der Nähe der Küste haben eine schnelle Oberflächenverdunstung, geringe Niederschläge und unvernünftige landwirtschaftliche Bewirtschaftungsmethoden den Prozess der Bodenversalzung verschärft. Die Bodenversalzung hemmt das Wachstum der Pflanzenwurzeln und reduziert die Aufnahme und den Transport von Wasser und Nährstoffen von den Pflanzenwurzeln zu den Blättern. Diese Hemmung führt zu physiologischem Wassermangel, Ernährungsungleichgewichten und Ionentoxizität, was zu einer verminderten Pflanzenproduktivität und einem vollständigen Verlust des Ernteertrags führt. Die Versalzung von Kulturland wird allmählich zu einem der kritischsten abiotischen Stressfaktoren, die die globale landwirtschaftliche Nahrungsmittelproduktion beeinflussen⁴. Salzstress reduziert das für die Landwirtschaft verfügbare Ackerland, was zu einem erheblichen Ungleichgewicht zwischen Angebot und Nachfrage zukünftiger landwirtschaftlicher Produkte führen kann. Daher ist die Erforschung der Auswirkungen der Bodenversalzung auf das Pflanzenwachstum und physiologische und biochemische Mechanismen förderlich für die Züchtung salztoleranter Sorten, die nachhaltige Nutzung salzhaltiger Böden und die Sicherheit landwirtschaftlicher Produkte.

Pfeffer (Capsicum annuum L.) wird aufgrund seines hohen ernährungsphysiologischen und medizinischen Wertes weltweit angebaut. Zum Beispiel ist Capsaicin ein Alkaloid, das für den würzigen Geschmack von Pfeffer verantwortlich ist. Capsaicin kann zur Schmerzlinderung, Gewichtsabnahme, Verbesserung des Herz-Kreislauf-, Magen-Darm-Trakt- und Atmungssystems sowie in verschiedenen anderen Anwendungen verwendet werden⁵. Pfeffer ist auch reich an bioaktiven Substanzen, insbesondere verschiedenen antioxidativen Verbindungen (Carotinoide, Phenole und Flavonoide) und Vitamin C⁶. Derzeit wird berichtet, dass Pfeffer die Gemüsepflanze mit der größten Anbaufläche in China ist, mit einer jährlichen Pflanzfläche von mehr als 1,5 x 10⁶ ha, was 8% -10% der gesamten Gemüseanbaufläche in China ausmacht. Die Paprikaindustrie hat sich zu einer der größten Gemüseindustrien in China entwickelt und hat den höchsten Produktionswert⁷. Der Pfefferanbau ist jedoch häufig einer Vielzahl von biologischen (Schädlinge und Pilze) und abiotischen Belastungen ausgesetzt, insbesondere Salzstress, der sich direkt negativ auf die Keimung, das Wachstum und die Entwicklung der Samen auswirkt und zu einer Verringerung des Ertrages und der Qualität der Paprikafrüchte führt⁸.

Die Samenkeimung ist die erste Stufe der Interaktion zwischen Pflanzen und der Umwelt. Die Samenkeimung reagiert sehr empfindlich auf Schwankungen in den umgebenden Medien, insbesondere auf Bodensalzstress, der umgekehrte Auswirkungen auf die Physiologie und den Stoffwechsel haben und schließlich das normale Wachstum, die Entwicklung und die Morphogenese von Pflanzen stören kann⁹. In früheren Studien wurden die Keimung von Paprikasamen und das Wachstum von Keimlingen unter Salzstress ausführlich untersucht. Die meisten Studien verwendeten jedoch NaCl als einziges Salz für die Stressinduktion^10,11,12. Die Schädigung des Bodensalzes ist jedoch hauptsächlich auf die Toxizität von Na+, Ca2+,^Mg2+, Cl-,_CO32- und_{SO42-Ionen-Toxizität} zurückzuführen, die durch die Dissoziation von Natrium-, Calcium^- und Magnesiumsalzen erzeugt wird. Aufgrund der Synergie und des Antagonismus zwischen Ionen können die Auswirkungen von Mischsalz und Einfachsalz auf das Pflanzenwachstum und die Entwicklung sehr unterschiedlich sein. Die entsprechenden Eigenschaften der Keimung und des Wachstums von Pfeffersamen in Mischsalz sind jedoch noch unklar. Daher werden in dieser Studie zwei Paprikasorten mit bemerkenswerten Unterschieden in der Salztoleranz als Materialien verwendet. Die Analyse der Auswirkungen unterschiedlicher Salzkonzentrationen auf die Keimung, das Wachstum und die physiologischen und biochemischen Indizes von Pfeffersamen nach dem äquimolaren Mischen von sieben Salzen kann den Reaktionsmechanismus der Keimung von Pfeffersamen auf Salzgehaltsstress aufdecken. Es kann auch eine theoretische Grundlage für den Anbau von starken Paprika-Sämlingen sowie für einen ertragreichen und qualitativ hochwertigen Anbau auf salzhaltigem Anbau bieten.

Protokoll

HINWEIS: Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Reaktionseigenschaften und internen Mechanismen der Keimung von Pfeffersamen und des Keimlingswachstums unter verschiedenen Mischsalzbelastungen vor, das als Referenzmethode für die Bewertung der Samensalztoleranz dienen kann.

1. Experimentelle Vorbereitung

1. Bereiten Sie Saatgut für Sorten vor - Hongtianhu 101 mit starker Salztoleranz und Xinxiang 8 mit geringer Toleranz.
2. Bereiten Sie 0,2% ige KMnO4-Lösung als Saatgutdesinfektionsreagenz vor. Wiegen Sie zuerst 4,0 g KMnO₄ und fügen Sie dann 2.000 ml destilliertes Wasser hinzu.
   HINWEIS: Kaliumpermanganat ist aufgrund seiner starken Oxidation in der Regel instabil; Dementsprechend wird es unmittelbar vor der Verwendung zubereitet.
3. Bereiten Sie die gemischten Salze mit sieben Salzen vor, einschließlich Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat und Natriumsulfat¹³. Man fügt die gleiche Molmenge von jedem hinzu, die nacheinander 14,8 %, 11,7 %, 8,2 %, 15,5 %, 13,3 %, 16,7 % bzw. 19,8 % des Gesamtmassenverhältnisses der Mischsalze ausmacht.
4. Bereiten Sie Petrischalen (Einmalgebrauch) und Filterpapier (qualitatives Filterpapier mittlerer Geschwindigkeit) vor, beide mit einem Durchmesser von 9 cm.
   HINWEIS: Das Material der Petrischale kann gewechselt werden; Der Durchmesser der Petrischale und des Filterpapiers muss jedoch gleich sein.

2. Einweichen der Samen und Vorbereitung auf die Keimung

1. Wählen Sie für die Saatgutoptimierung Paprikasamen mit gleichbleibender Größe und vollen Partikeln aus jeder Sorte mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 4,2 mm bzw. 3,7 mm für Hongtianhu 101 und Xinxiang 8 Samen. Berechnen Sie die Gesamtzahl der ausgewählten Seeds entsprechend der Testarbeitsauslastung.
2. Zur Saatgutdesinfektion ausgewählte Paprikasamen 15 min in 0,2% KMnO4-Lösung einweichen und anschließend fünfmal mit destilliertem Wasser abspülen.
3. Zum Einweichen der Samen die sterilisierten Samen in destilliertes Wasser geben und 24 Stunden einweichen lassen. Spülen Sie die Samen mehrmals mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie zur weiteren Verwendung ab.
   HINWEIS: Die Einweichzeit von Samen für verschiedene Kulturen kann variieren.

3. Samenkeimung und Keimlingswachstum

1. Bereiten Sie sechs Konzentrationen der Mischsalze vor: 0 (Kontrolle), 3, 5, 10, 15 und 20 g/L. Messen Sie die Leitfähigkeit der Salzlösung mit einem Leitfähigkeitsmessgerät. Die EC-Werte für die Leitfähigkeit der Lösung betragen 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 bzw. 15,22 ms/cm.
2. Für die Saatgutzubereitung 40 Paprikasamen gleichmäßig in eine Petrischale mit zwei Schichten Filterpapier geben. Bereiten Sie die Samen für sechs experimentelle Behandlungen vor und wiederholen Sie jede Behandlung fünfmal.
3. Für die Samenkeimung geben Sie eine geeignete Menge der sechs gemischten Salzkonzentrationen in die Petrischale, um sicherzustellen, dass das Filterpapier feucht bleibt. Legen Sie die Samen in einen Luftinkubator bei 28 °C und 80% Luftfeuchtigkeit für die Keimung im Dunkeln.
4. Lassen Sie die Sämlinge nach der Samenkeimung 14 Tage nach der Aussaat im Brutschrank 14 Tage lang im Brutschrank weiter wachsen (Lichtintensität ca. 450 Lux; Lichtzyklus 12/12h). Die Temperatur und Luftfeuchtigkeit in der Wachstumsphase des Keimlings muss die gleiche sein wie in der Keimungsphase.
5. Füllen Sie die Lösung in der Kulturschale alle 12 h auf, um ein feuchtes Filterpapier zu erhalten, und waschen Sie das Filterpapier alle 24 h vollständig mit der entsprechenden Konzentration der gemischten Salzlösung, um eine konstante Mischsalzkonzentration in der Petrischale zu erhalten.
   HINWEIS: Die Menge an Salzlösung, die den nassen Samen zugesetzt wird, kann je nach Keimungs- und Wachstumsstadien der Samen angepasst werden. Es gibt viele Methoden, um eine konstante Konzentration von Salzlösungen in Kulturschalen aufrechtzuerhalten. Zusätzlich zu den in diesem Experiment beschriebenen Methoden kann die Strategie der Zugabe von destilliertem Wasser nach Gewicht verwendet werden.

4. Messung und Berechnung von Indikatoren

1. Bestimmung der Saatgutkeimindizes
   1. Bestimmen Sie die Keimrate täglich nach der Aussaat, wobei die radikelbrechende Samenschale als Keimmarker die Hälfte der Samendurchmesserlänge erreicht.
   2. Berechnen Sie die Keimrate, das Keimpotenzial, die relative Salzrate, den Keimindex und den Keimkraftindex der Samen mit den folgenden Formeln:
      Keimrate (%) = (Anzahl der normal gekeimten Samen am 7. Tag nach der Aussaat/Anzahl der getesteten Samen) × 100
      Keimpotenzial (%) = (Anzahl der normal gekeimten Samen am Tag 3 nach der Aussaat/Anzahl der getesteten Samen) × 100
      Relative Salzrate (%) = (Kontrollkeimrate - Behandlungskeimrate)/Kontrollkeimrate × 100
      berechnet anhand der Keimrate des Saatguts am Tag 7 nach der Aussaat
      Keimindex (GI) = ∑ [Gt/Dt]
      wobei Gt sich auf die Keimzahl der Samen zu einem Zeitpunkt (t) nach der Aussaat und Dt auf die entsprechenden Keimtage bezieht
      Keimkraftindex der Samen (VI) = GI x S
      wobei S die Wurzellänge ist
2. Bestimmung des Keimlingswachstumsindex
   1. Wählen Sie am 14. Tag nach der Aussaat nach dem Zufallsprinzip 10 repräsentative Sämlinge aus jeder Petrischale aus und messen Sie die Wurzellänge und die Hypokotyllänge.
   2. Verwenden Sie ein Messer, um die Paprika-Sämlinge in zwei Teile zu teilen: Radikel und oberirdische Teile. Entfernen Sie das Wasser von den Sämlingen durch Abwischen und wiegen Sie die Sämlinge separat, um das Frischgewicht zu bestimmen.
3. Bestimmen Sie die antioxidative Enzymaktivität, den Malondialdehydgehalt (MDA) und den Prolingehalt (Pro) im Pfeffer wie folgt.
   1. Um die Paprika-Sämlinge zu konservieren, wählen Sie am 14. Tag nach der Aussaat repräsentative ganze Paprika-Sämlinge (ca. 24,0 g) aus jeder Behandlung aus. Nach dem Entfernen des Oberflächenwassers die Sämlinge sofort für 1 Minute in flüssigem Stickstoff einfrieren und im Kühlschrank bei extrem niedriger Temperatur (-80 ° C) aufbewahren.
      HINWEIS: Die Anzahl der Paprika-Sämlinge, die im Ultratiefkühlschrank gelagert werden, sollte ausreichend sein, falls einige Indikatoren erneut getestet werden müssen.
   2. Entnehmen Sie ca. 1,0 g Keimlingsprobe aus jeder Behandlung, die in dreifacher Ausführung gesammelt wird. Legen Sie die Keimlingsprobe in ein Zentrifugenröhrchen, fügen Sie flüssigen Stickstoff hinzu und mahlen Sie die Probe mit einem Mahlstab, um die physiologischen Indizes der Sämlinge zu bestimmen. Die ermittelten Indizes und das Messschema sind unten dargestellt.
   3. Bestimmung der Keimlingsschutzenzymaktivität (Peroxidase [POD], Katalase [CAT], Superoxiddismutase [SOD]), Malondialdehyd (MDA) und Prolin (Pro) unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (auf Spektrophotometrie-Basis) für jeden Faktor¹⁴.
      ANMERKUNG: Frühere Beobachtungen ergaben keinen Unterschied in der Salzbelastung zwischen den 15 und 20 g/L Mischsalzkonzentrationen. Daher werden nur fünf Salzkonzentrationen (0, 3, 5, 10 und 15 g/L) gemessen.
4. Umfassende Bewertung der Salztoleranz mit Hilfe der Mitgliedschaftsfunktionsmethode
   HINWEIS: Die Mitgliedschaftsfunktion verwendet eine Fuzzy-Mathematik-Methode, die die qualitative Bewertung in eine quantitative Bewertung¹⁵ umwandelt, um eine Vielzahl von physiologischen Indizes zu bewerten, die von Salzschäden betroffen sind.
   1. Berechnen Sie den Wert der Mitgliedschaftsfunktion mit der folgenden Formel von Zhoubin Liu et ^al.15:
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Wenn ein Merkmal negativ mit der Salztoleranz korreliert, berechnen Sie die inverse Zugehörigkeitsfunktion mit:
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Kumulieren Sie die Mitgliedschaftswerte jedes physiologischen Indexes, wobei Xi der gemessene Wert eines bestimmten Merkmals ist, Xmax und Xmin die Maximal- bzw. Minimalwerte für Xi und Ri der Mitgliedschaftswert dieses Merkmals ist.
   2. Fügen Sie die folgenden relevanten Indikatoren hinzu: Saatgutkeimungsmerkmale (Keimungspotenzial, Keimrate, Keimindex und Samenkeimkraftindex), Keimlingswachstumsmerkmale im Keimungsstadium (Wurzellänge, Hypokotyllänge, Wurzelfrischgewicht und Frischgewicht oberirdisch), MDA, Pro und schützende Enzymaktivität (CAT, POD, SOD) für die Berechnung des Mitgliedschaftsfunktionswerts. Die Werte der Mitgliedschaftsfunktion werden von jedem Indikator abgerufen.
5. Verwenden Sie Tabellenkalkulation und SPSS-Software (Version 22.0), um die Testdaten zu analysieren und zu verarbeiten, und wenden Sie die Methode des geringsten signifikanten Unterschieds (LSD) für Mehrfachvergleiche an, um signifikante Unterschiede zu identifizieren. Verwenden Sie die Korrelationsanalyse von Pearson, um die Korrelation zwischen der Samenkeimung und den physiologischen Indizes der Sämlinge von Pfeffer unter zusammengesetztem Salzstress zu untersuchen.

Ergebnisse

Eigenschaften der Samenkeimung
Mit steigender Mischsalzkonzentration nimmt das Keimpotenzial und der Keimindex von Hongtianhu 101 und Xinxiang 8 signifikant ab. Beide Sorten weisen einen starken Rückgang der Salzkonzentrationen von 0-3 g/L und einen langsamen und stetigen Rückgang der Salzkonzentrationen von 3-20 g/L auf (Abbildung 1A, B). Die Keimrate der beiden Sorten nimmt allmählich ab, wenn die Mischsalzkonzentrationen steigen, und die relative Sa...

Diskussion

Diese Forschungsmethode besteht aus vier Hauptschritten, die sich auf die Genauigkeit der experimentellen Ergebnisse auswirken. Erstens müssen die gewogenen Reagenzien wegen der schlechten Auflösung von Mischsalzen, die durch den erhöhten Gehalt an gelösten Stoffen in Lösungen mit hoher Salzkonzentration verursacht wird, und der geringen Löslichkeit von Reagenzien wie Calciumchlorid, die in Wasser schwieriger löslich sind, vollständig in einem Mörser gemahlen werden. Außerdem müssen die Reagenzien über

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Centrifugal machine	Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China	TGL-16M
Centrifuge tube	None	None
Conductivity meter	Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China	DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box	Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China	PSX-280H
Digital display vernier caliper	Deli Group Co., Ltd.,China	DL90150
Electronic balance	Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China	ME802E/02
Filter paper	Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China	GB/T1914-2017
Grinding rod	None	None
Hongtianhu  101	Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China	11933955/100147K1-137
Ice machine	Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China	IM150G
Liquid nitrogen	None	None
Magnesium chloride	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Magnesium sulfate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Petri dish	Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China	I-000163
Pocket knife	None	None
Potassium permanganate (KMnO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Pure water equipment	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China	UPT-I-20T
Sodium bicarbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium carbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium chloride	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium sulfate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Test kit	Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China	Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China	760CRT
Xinxiang 8	Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China	GPD Pepper 2017(360013)