Análise do Efeito do Estresse Composto de Sal na Germinação de Sementes e Análise de Tolerância ao Sal de Pimenta (Capsicum annuum L.)

Resumo

O trabalho abaixo apresenta um protocolo para medir a germinação de sementes, o crescimento de plântulas e os índices fisiológicos de duas variedades de pimenta com diferenças de tolerância à salinidade em resposta a seis concentrações mistas de sal. Este protocolo pode ser usado para avaliar a tolerância ao sal de variedades de pimenta.

Resumo

Para determinar a tolerância ao sal e o mecanismo fisiológico da pimenta (Capsicum annuum L.) na fase de germinação, as variedades Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, que apresentam grandes diferenças na tolerância ao sal, são empregadas como materiais de estudo. São utilizadas seis concentrações mistas de sal de 0, 3, 5, 10, 15 e 20 g/L derivadas usando proporções molares iguais de Na 2 CO₃, NaHCO₃, NaCl, CaCl₂, MgCl 2_, MgSO 4 e Na₂ SO₄. Para determinar seus efeitos, os índices relacionados de germinação, crescimento de plântulas e fisiologia são medidos, e a tolerância ao sal é avaliada de forma abrangente usando a análise da função de associação. Os resultados mostram que, à medida que a concentração de sal misto aumenta, o potencial de germinação, o índice de germinação, a taxa de germinação, o índice de vigor germinativo das sementes, o comprimento da raiz e o peso fresco das duas cultivares diminuem significativamente, enquanto a taxa relativa de sal aumenta gradualmente. O comprimento do hipocótilo e o peso fresco acima do solo aumentam primeiro e depois diminuem, enquanto a atividade da malondialdeído (MDA), prolina (Pro), catalase (CAT), peroxidase (POD) e superóxido dismutase (SOD) diminuem e depois aumentam. O potencial de germinação, o índice de germinação, a taxa de germinação, o índice de vigor germinativo das sementes, o comprimento da raiz, o peso fresco da raiz, o teor de MDA e Pro e a atividade CAT das sementes de Hongtianhu 101 são superiores aos de Xinxiang 8 para todas as concentrações de sal aqui empregadas. No entanto, o comprimento do hipocótilo, o peso fresco acima do solo e a taxa relativa de sal são menores em Hongtianhu 101 do que em Xinxiang 8. A avaliação abrangente da tolerância ao sal revela que os valores ponderados totais dos dois índices de função de associação aumentam primeiro e depois diminuem à medida que a concentração mista de sal aumenta. Em comparação com 5 g/L, que tem o maior valor de função de associação, o índice sob concentrações de sal de 3 g/L, 10 g/L e 15 g/L diminui 4,7%-11,1%, 25,3%-28,3% e 41,4%-45,1%, respectivamente. Este estudo fornece orientação teórica para o melhoramento de variedades de pimenta tolerantes ao sal e uma análise dos mecanismos fisiológicos envolvidos na tolerância ao sal e no cultivo tolerante ao sal.

Introdução

A salinidade é um importante fator limitante para a produtividade das culturas em todo o mundo¹. Atualmente, quase 19,5% das terras irrigadas do mundo e 2,1% da terra seca são afetadas pela salinidade, e aproximadamente 1% das terras agrícolas degeneram em terras salinas-alcalinas a cada ano. Até 2050, espera-se que 50% das terras aráveis sejam afetadas pela salinização ^2,3. Além de fatores naturais, como o intemperismo natural das rochas e a água salgada da chuva perto ou ao redor da costa, a rápida evaporação da superfície, a baixa precipitação e os métodos de manejo agrícola irracionais exacerbaram o processo de salinização do solo. A salinização do solo inibe o crescimento das raízes das plantas e reduz a absorção e o transporte de água e nutrientes das raízes das plantas para as folhas. Essa inibição resulta em escassez fisiológica de água, desequilíbrios nutricionais e toxicidade de íons, o que leva à redução da produtividade das culturas e a uma perda completa do rendimento das culturas. A salinização das terras cultivadas está gradualmente se tornando um dos fatores de estresse abiótico mais críticos que afetam a produção global de alimentos agrícolas⁴. O estresse salino reduz as terras aráveis disponíveis para a agricultura, o que pode resultar em um desequilíbrio significativo entre a oferta e a demanda de futuros produtos agrícolas. Portanto, explorar os efeitos da salinização do solo no crescimento das culturas e nos mecanismos fisiológicos e bioquímicos é propício para a criação de variedades tolerantes ao sal, a utilização sustentável do solo salino e a segurança dos produtos agrícolas.

A pimenta (Capsicum annuum L.) é plantada em todo o mundo devido ao seu alto valor nutricional e medicinal. Por exemplo, a capsaicina é um alcaloide responsável pelo sabor picante da pimenta. A capsaicina pode ser usada para alívio da dor, perda de peso, melhora dos sistemas cardiovascular, gastrointestinal e respiratório, e em várias outras aplicações⁵. A pimenta também é rica em substâncias bioativas, especialmente diferentes compostos antioxidantes (carotenoides, fenólicos e flavonoides) e vitamina C⁶. Atualmente, a pimenta é relatada como a cultura vegetal com a maior área de cultivo na China, com uma área de plantio anual de mais de 1,5 x 10⁶ ha, representando assim 8% a 10% da área total de plantio de vegetais na China. A indústria da pimenta tornou-se uma das maiores indústrias vegetais da China e tem o maior valor de produção⁷. No entanto, o cultivo de pimenta é frequentemente submetido a uma variedade de estresses biológicos (pragas e fungos) e abióticos, especialmente o estresse salino, que tem um impacto negativo direto na germinação, crescimento e desenvolvimento das sementes, resultando na redução da produtividade e qualidade dos frutos de pimenta⁸.

A germinação de sementes é o primeiro estágio de interação entre as plantas e o meio ambiente. A germinação de sementes é altamente sensível a flutuações no meio circundante, especialmente ao estresse salino do solo, que pode exercer efeitos reversos sobre a fisiologia e o metabolismo e, eventualmente, perturbar o crescimento, o desenvolvimento e a morfogênese normais das culturas⁹. Em estudos anteriores, a germinação de sementes de pimenta e o crescimento de plântulas sob estresse salino foram extensivamente investigados; no entanto, a maioria dos estudos utilizou o NaCl como único sal para indução de estresse^10,11,12. No entanto, os danos ao sal no solo são devidos principalmente à toxicidade de íons Na⁺, Ca 2+, Mg²⁺, Cl-, CO₃ 2-, e SO₄^2- gerada pela dissociação de sais de sódio^{, cálcio} e magnésio. Devido à sinergia e antagonismo entre íons, os efeitos do sal misto e do sal único no crescimento e desenvolvimento das culturas podem ser bastante diferentes. No entanto, as características correspondentes da germinação e crescimento de sementes de pimenta em sal misto ainda não estão claras. Portanto, duas variedades de pimenta com diferenças notáveis na tolerância ao sal são utilizadas como materiais neste estudo. A análise dos efeitos de diferentes concentrações de sal na germinação, crescimento e índices fisiológicos e bioquímicos de sementes de pimenta após a mistura equimolar de sete sais pode revelar o mecanismo de resposta da germinação de sementes de pimenta ao estresse salino. Também pode fornecer uma base teórica para o cultivo de mudas de pimenta fortes, bem como o cultivo de alto rendimento e alta qualidade em terras cultivadas com solução salina.

Protocolo

NOTA: Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar as características de resposta e os mecanismos internos de germinação de sementes de pimenta e crescimento de plântulas sob diferentes tensões mistas de sal, que pode servir como método de referência para avaliação da tolerância ao sal de sementes.

1. Preparação experimental

1. Preparar sementes de culturas para cultivares-Hongtianhu 101 com forte tolerância ao sal e Xinxiang 8 com baixa tolerância.
2. Preparar a solução de KMnO₄ a 0,2% como reagente de desinfecção de sementes. Primeiro, pese 4,0 g de KMnO₄ e, em seguida, adicione 2.000 mL de água destilada.
   NOTA: O permanganato de potássio é geralmente instável devido à sua forte oxidação; por conseguinte, é preparado imediatamente antes da utilização.
3. Preparar os sais mistos usando sete sais, incluindo carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e sulfato de sódio¹³. Adicione a mesma quantidade molar de cada um, que sucessivamente representam 14,8%, 11,7%, 8,2%, 15,5%, 13,3%, 16,7% e 19,8% da razão de massa total dos sais mistos, respectivamente.
4. Preparar placas de Petri (uso único) e papel filtro (papel filtro qualitativo de velocidade média), ambos com diâmetro de 9 cm.
   NOTA: O material da placa de Petri pode ser alterado; no entanto, o diâmetro da placa de Petri e do papel de filtro deve ser o mesmo.

2. Embebição de sementes e preparação para germinação

1. Para otimização de sementes, selecione sementes de pimenta com tamanho consistente e partículas cheias de cada variedade, com diâmetro médio de 4,2 mm e 3,7 mm para as sementes Hongtianhu 101 e Xinxiang 8, respectivamente. Calcule o número total de sementes selecionadas de acordo com a carga de trabalho de teste.
2. Para a desinfecção das sementes, mergulhe as sementes de pimenta selecionadas em solução de KMnO₄ a 0,2% por 15 min e depois enxágue cinco vezes com água destilada.
3. Para a imersão das sementes, transfira as sementes esterilizadas para água destilada e deixe-as de molho por 24 h. Lave as sementes várias vezes com água destilada e seque para uso posterior.
   NOTA: O tempo de imersão das sementes para diferentes culturas pode variar.

3. Germinação de sementes e crescimento de plântulas

1. Preparar seis concentrações dos sais mistos: 0 (controle), 3, 5, 10, 15 e 20 g/L. Medir a condutividade da solução salina usando um medidor de condutividade; os valores de condutividade EC da solução são 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 e 15,22 ms/cm, respectivamente.
2. Para a preparação de sementes, coloque uniformemente 40 sementes de pimenta em uma placa de Petri com duas camadas de papel de filtro. Preparar as sementes para seis tratamentos experimentais e repetir cada tratamento cinco vezes.
3. Para a germinação das sementes, adicione uma quantidade adequada das seis concentrações mistas de sal à placa de Petri para garantir que o papel de filtro seja mantido úmido. Colocar as sementes numa incubadora de ar a 28 °C e a 80% de humidade do ar para germinação no escuro.
4. Após a germinação das sementes, deixe que as plântulas continuem a crescer em luz (intensidade de luz de aproximadamente 450 Lux; ciclo de luz de 12/12h) na incubadora por 14 dias após a semeadura. A temperatura e a humidade na fase de crescimento das plântulas devem ser as mesmas que as utilizadas na fase de germinação.
5. Reabasteça a solução na placa de cultura a cada 12 h para reter um papel de filtro úmido e lave completamente o papel de filtro a cada 24 h com a concentração correspondente da solução salina mista para manter uma concentração constante de sal misto na placa de Petri.
   NOTA: A quantidade de solução salina adicionada às sementes úmidas pode ser ajustada de acordo com os estágios de germinação e crescimento das sementes. Muitos métodos estão disponíveis para manter uma concentração constante de soluções salinas em pratos de cultura. Além dos métodos descritos neste experimento, pode-se utilizar a estratégia de adição de água destilada por peso.

4. Medição e cálculo de indicadores

1. Determinação dos índices de germinação das sementes
   1. Determinar a taxa de germinação diariamente após a semeadura, com a radícula quebrando o revestimento da semente atingindo metade do comprimento do diâmetro da semente como marcador de germinação.
   2. Calcule a taxa de germinação, o potencial de germinação, a taxa relativa de sal, o índice de germinação e o índice de vigor de germinação das sementes usando as seguintes fórmulas:
      Taxa de germinação (%) = (número de sementes germinadas normais no 7º dia após a semeadura/número de sementes testadas) × 100
      Potencial germinativo (%) = (número de sementes germinadas normais no 3º dia após a semeadura/número de sementes testadas) × 100
      Taxa relativa de sal (%) = (taxa de germinação de controle - taxa de germinação de tratamento)/taxa de germinação de controle × 100
      calculado utilizando a taxa de germinação das sementes no dia 7 após a semeadura
      Índice de germinação (IG) = ∑ [Gt/Dt]
      em que Gt refere-se ao número de germinação das sementes num período de tempo (t) após a sementeira e Dt refere-se aos dias de germinação correspondentes
      Índice de vigor germinativo de sementes (VI) = GI x S
      onde S é o comprimento da raiz
2. Determinação do índice de crescimento das plântulas
   1. No dia 14 após a semeadura, selecione aleatoriamente 10 mudas representativas de cada placa de Petri e meça o comprimento da raiz e o comprimento do hipocótilo.
   2. Use uma faca para dividir as mudas de pimenta em duas partes: radícula e partes acima do solo. Retire a água das mudas limpando e pese as mudas separadamente para determinar o peso fresco.
3. Determine a atividade da enzima antioxidante, o nível de malondialdeído (MDA) e o teor de prolina (Pro) na pimenta da seguinte forma.
   1. Para preservar as mudas de pimenta, selecione mudas de pimenta inteiras representativas (aproximadamente 24,0 g) de cada tratamento no dia 14 após a semeadura. Depois de remover a água superficial, congele imediatamente as mudas em nitrogênio líquido por 1 min e guarde-as em uma geladeira a uma temperatura ultrabaixa (-80 °C).
      NOTA: O número de amostras de mudas de pimenta armazenadas no refrigerador de temperatura ultrabaixa deve ser suficiente, caso alguns indicadores precisem ser testados novamente.
   2. Recuperar aproximadamente 1,0 g de amostra de plântulas de cada tratamento coletado em triplicado. Coloque a amostra de plântula em um tubo de centrífuga, adicione nitrogênio líquido e triture a amostra usando uma haste de moagem para determinar os índices fisiológicos das plântulas. Os índices determinados e o esquema de medição são mostrados abaixo.
   3. Determinar a atividade enzimática protetora das plântulas (peroxidase [POD], catalase [CAT], superóxido dismutase [SOD]), malondialdeído (MDA) e prolina (Pro) usando um kit comercialmente disponível (baseado em espectrofotometria) para cada fator¹⁴.
      NOTA: Observações anteriores não revelaram diferença no estresse salino entre as concentrações de sal misto de 15 e 20 g/L. Como resultado, apenas cinco concentrações de sal (0, 3, 5, 10 e 15 g / L) são medidas.
4. Avaliação abrangente da tolerância ao sal usando o método da função de associação
   NOTA: A função de associação utiliza um método matemático difuso, que converte a avaliação qualitativa em avaliação quantitativa¹⁵, para avaliar uma variedade de índices fisiológicos afetados pelo dano do sal.
   1. Calcule o valor da função de associação usando a seguinte fórmula de Zhoubin Liu et ^al.15:
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Se uma característica estiver negativamente correlacionada com a tolerância ao sal, calcule a função de associação inversa usando:
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Acumule os valores de associação de cada índice fisiológico, onde Xi é o valor medido de uma determinada característica, Xmax e Xmin são os valores máximo e mínimo para Xi, respectivamente, e Ri é o valor de associação dessa característica.
   2. Incluir os seguintes indicadores relevantes: características de germinação das sementes (potencial de germinação, taxa de germinação, índice de germinação e índice de vigor de germinação das sementes), características de crescimento das plântulas no estágio de germinação (comprimento da raiz, comprimento do hipocótilo, massa fresca da raiz e massa fresca acima do solo), MDA, Pro e atividade enzimática protetora (CAT, POD, SOD) para o cálculo do valor da função de associação. Os valores da função de associação são obtidos a partir de cada indicador.
5. Use planilha eletrônica e software SPSS (versão 22.0) para analisar e processar os dados de teste e aplicar o método de diferença menos significativa (LSD) para comparações múltiplas para identificar diferenças significativas. Use a análise de correlação de Pearson para investigar a correlação entre a germinação de sementes e os índices fisiológicos de plântulas de pimenta sob estresse salino composto.

Resultados

Características de germinação de sementes
À medida que a concentração de sal misto aumenta, o potencial de germinação e o índice de germinação de Hongtianhu 101 e Xinxiang 8 diminuem significativamente. Ambas as cultivares têm um declínio acentuado nas concentrações de sal de 0-3 g/L, e um declínio lento e constante para as concentrações de sal de 3-20 g/L (Figura 1A,B). A taxa de germinação das duas variedades diminui gradualmente à ...

Discussão

Este método de pesquisa compreende quatro etapas-chave que afetam a precisão dos resultados experimentais. Primeiro, devido à má dissolução de sais mistos causada pelo aumento do teor de soluto em soluções de alta concentração de sal e à baixa solubilidade de reagentes como o cloreto de cálcio, que são mais difíceis de solubilizar em água, os reagentes pesados devem ser totalmente moídos em uma argamassa. Além disso, os reagentes devem ser dissolvidos através de ondas ultra-sônicas antes de de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Centrifugal machine	Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China	TGL-16M
Centrifuge tube	None	None
Conductivity meter	Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China	DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box	Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China	PSX-280H
Digital display vernier caliper	Deli Group Co., Ltd.,China	DL90150
Electronic balance	Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China	ME802E/02
Filter paper	Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China	GB/T1914-2017
Grinding rod	None	None
Hongtianhu  101	Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China	11933955/100147K1-137
Ice machine	Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China	IM150G
Liquid nitrogen	None	None
Magnesium chloride	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Magnesium sulfate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Petri dish	Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China	I-000163
Pocket knife	None	None
Potassium permanganate (KMnO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Pure water equipment	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China	UPT-I-20T
Sodium bicarbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium carbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium chloride	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium sulfate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Test kit	Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China	Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China	760CRT
Xinxiang 8	Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China	GPD Pepper 2017(360013)