Analyse de l’effet du stress salin composé sur la germination des graines et analyse de la tolérance au sel du poivre (Capsicum annuum L.)

Résumé

L’article ci-dessous présente un protocole pour mesurer la germination des graines, la croissance des semis et les indices physiologiques de deux variétés de poivre présentant des différences de tolérance à la salinité en réponse à six concentrations de sel mélangé. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer la tolérance au sel des variétés de poivre.

Résumé

Pour déterminer la tolérance au sel et le mécanisme physiologique du poivre (Capsicum annuum L.) au stade de la germination, les variétés Hongtianhu 101 et Xinxiang 8, qui présentent de grandes différences de tolérance au sel, sont utilisées comme matériel d’étude. Six concentrations de sels mixtes de 0, 3, 5, 10, 15 et 20 g/L calculées en utilisant des rapports molaires égaux de Na 2 CO 3, NaHCO₃, NaCl, CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 et Na ₂ SO₄ sont utilisées. Pour déterminer leurs effets, les indices connexes de germination des graines, de croissance des plantules et de physiologie sont mesurés, et la tolérance au sel est évaluée de manière exhaustive à l’aide de l’analyse de la fonction d’appartenance. Les résultats montrent qu’à mesure que la concentration de sel mélangé augmente, le potentiel de germination, l’indice de germination, le taux de germination, l’indice de vigueur de germination des graines, la longueur des racines et le poids frais des racines des deux cultivars diminuent considérablement, tandis que le taux relatif de sel augmente progressivement. La longueur de l’hypocotyle et le poids frais au-dessus du sol augmentent d’abord, puis diminuent, tandis que l’activité du malondialdéhyde (MDA), de la proline (Pro), de la catalase (CAT), de la peroxydase (POD) et de la superoxyde dismutase (SOD) diminue puis augmente. Le potentiel de germination, l’indice de germination, le taux de germination, l’indice de vigueur de germination des graines, la longueur des racines, le poids frais des racines, la teneur en MDA et Pro et l’activité CAT des graines Hongtianhu 101 sont plus élevés que ceux de Xinxiang 8 pour toutes les concentrations de sel utilisées ici. Cependant, la longueur de l’hypocotyle, le poids frais au-dessus du sol et le taux relatif de sel sont plus faibles dans Hongtianhu 101 que dans Xinxiang 8. L’évaluation complète de la tolérance au sel révèle que les valeurs pondérées totales des deux indices de fonction d’appartenance augmentent d’abord, puis diminuent à mesure que la concentration de sel mélangé augmente. Comparativement à 5 g/L, qui a la valeur de fonction d’appartenance la plus élevée, l’indice sous des concentrations de sel de 3 g/L, 10 g/L et 15 g/L diminue de 4,7 % à 11,1 %, de 25,3 % à 28,3 % et de 41,4 % à 45,1 %, respectivement. Cette étude fournit des conseils théoriques pour la sélection de variétés de poivre tolérantes au sel et une analyse des mécanismes physiologiques impliqués dans la tolérance au sel et la culture tolérante au sel.

Introduction

La salinité est un facteur limitant majeur pour la productivité des cultures dans le monde¹. À l’heure actuelle, près de 19,5% des terres irriguées et 2,1% des terres sèches du monde sont affectées par la salinité, et environ 1% des terres agricoles dégénèrent en terres salines-alcalines chaque année. D’ici 2050, 50 % des terres arables devraient être affectées par la salinisation ^2,3. En plus des facteurs naturels, tels que l’altération naturelle des roches et l’eau de pluie salée près ou autour de la côte, l’évaporation rapide de la surface, les faibles précipitations et les méthodes de gestion agricole déraisonnables ont exacerbé le processus de salinisation des sols. La salinisation du sol inhibe la croissance des racines des plantes et réduit l’absorption et le transport de l’eau et des nutriments des racines des plantes aux feuilles. Cette inhibition entraîne des pénuries d’eau physiologiques, des déséquilibres nutritionnels et une toxicité ionique, ce qui entraîne une réduction de la productivité des cultures et une perte complète du rendement des cultures. La salinisation des terres cultivées devient progressivement l’un des facteurs de stress abiotiques les plus critiques affectant la production alimentaire agricole mondiale⁴. Le stress lié au sel réduit les terres arables disponibles pour l’agriculture, ce qui peut entraîner un déséquilibre important entre l’offre et la demande de produits agricoles futurs. Par conséquent, l’exploration des effets de la salinisation des sols sur la croissance des cultures et les mécanismes physiologiques et biochimiques est propice à la sélection de variétés tolérantes au sel, à l’utilisation durable des sols salins et à la sécurité des produits agricoles.

Le poivre (Capsicum annuum L.) est planté dans le monde entier en raison de sa haute valeur nutritionnelle et médicinale. Par exemple, la capsaïcine est un alcaloïde responsable de la saveur épicée du poivre. La capsaïcine peut être utilisée pour soulager la douleur, perdre du poids, améliorer les systèmes cardiovasculaire, gastro-intestinal et respiratoire, et dans plusieurs autres applications⁵. Le poivre est également riche en substances bioactives, en particulier différents composés antioxydants (caroténoïdes, phénoliques et flavonoïdes) et en vitamine C⁶. Actuellement, le poivre serait la culture légumière ayant la plus grande superficie de culture en Chine, avec une superficie de plantation annuelle de plus de 1,5 x 10⁶ ha, représentant ainsi 8% à 10% de la superficie totale de plantation de légumes en Chine. L’industrie du poivre est devenue l’une des plus grandes industries maraîchères de Chine et a la valeur de production la plus élevée⁷. Cependant, la culture du poivre est souvent soumise à une variété de stress biologiques (ravageurs et champignons) et abiotiques, en particulier le stress salin, qui a un impact négatif direct sur la germination, la croissance et le développement des graines, entraînant une réduction du rendement et de la qualité des fruits du poivre⁸.

La germination des graines est la première étape de l’interaction entre les plantes et l’environnement. La germination des graines est très sensible aux fluctuations du milieu environnant, en particulier au stress lié au sel du sol, qui peut exercer des effets inversés sur la physiologie et le métabolisme, et éventuellement perturber la croissance, le développement et la morphogenèse normaux des cultures⁹. Dans des études antérieures, la germination des graines de poivron et la croissance des plantules sous stress salin ont fait l’objet d’études approfondies; cependant, la plupart des études ont utilisé le NaCl comme seul sel pour l’induction du stress^10,11,12. Cependant, les dommages causés par les sels du sol sont principalement dus à la toxicité des ions Na+, Ca 2⁺, Mg²⁺, Cl-, CO₃ 2- et SO₄^2- générée par la dissociation des sels de sodium, de calcium et de magnésium. En raison de la synergie et de l’antagonisme entre les ions, les effets du sel mélangé et du sel unique sur la croissance et le développement des cultures peuvent être très différents. Cependant, les caractéristiques correspondantes de la germination des graines de poivre et de la croissance dans le sel mélangé ne sont pas encore claires. Par conséquent, deux variétés de poivre présentant des différences remarquables de tolérance au sel sont utilisées comme matériaux dans cette étude. L’analyse des effets de différentes concentrations de sel sur la germination, la croissance et les indices physiologiques et biochimiques des graines de poivre après mélange équimolaire de sept sels peut révéler le mécanisme de réponse de la germination des graines de poivron au stress salin. Il peut également fournir une base théorique pour la culture de plants de poivre forts, ainsi que pour une culture à haut rendement et de haute qualité dans des terres cultivées salines.

Protocole

NOTE: Nous présentons ici un protocole pour évaluer les caractéristiques de réponse et les mécanismes internes de la germination des graines de poivron et de la croissance des plantules sous différents stress de sel mixte, qui peut servir de méthode de référence pour l’évaluation de la tolérance au sel des graines.

1. Préparation expérimentale

1. Préparer les semences de culture pour les cultivars-Hongtianhu 101 avec une forte tolérance au sel et Xinxiang 8 avec une faible tolérance.
2. Préparer la solution de KMnO₄ à 0,2 % comme réactif de désinfection des semences. Pesez d’abord 4,0 g de KMnO₄, puis ajoutez 2 000 mL d’eau distillée.
   NOTE: Le permanganate de potassium est généralement instable en raison de sa forte oxydation; En conséquence, il est préparé immédiatement avant utilisation.
3. Préparer les sels mélangés en utilisant sept sels, y compris le carbonate de sodium, le bicarbonate de sodium, le chlorure de sodium, le chlorure de calcium, le chlorure de magnésium, le sulfate de magnésium et le sulfate^{de sodium 13}. Ajoutez la même quantité molaire de chacun, qui représentent successivement respectivement 14,8 %, 11,7 %, 8,2 %, 15,5 %, 13,3 %, 16,7 % et 19,8 % du rapport massique total des sels mélangés.
4. Préparez des boîtes de Petri (à usage unique) et du papier filtre (papier filtre qualitatif à vitesse moyenne), tous deux d’un diamètre de 9 cm.
   REMARQUE: Le matériau de la boîte de Petri peut être changé; toutefois, le diamètre de la boîte de Petri et du papier filtre doit être le même.

2. Trempage des graines et préparation à la germination

1. Pour l’optimisation des semences, sélectionnez des graines de poivron de taille constante et de particules pleines de chaque variété, avec un diamètre moyen de 4,2 mm et 3,7 mm pour les graines Hongtianhu 101 et Xinxiang 8, respectivement. Calculez le nombre total de semences sélectionnées en fonction de la charge de travail du test.
2. Pour la désinfection des graines, faire tremper les graines de poivron sélectionnées dans une solution à 0,2 % de KMnO₄ pendant 15 minutes, puis rincer cinq fois à l’eau distillée.
3. Pour le trempage des graines, transférer les graines stérilisées dans de l’eau distillée et laisser tremper pendant 24 h. Rincer les graines plusieurs fois avec de l’eau distillée et sécher pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE: Le temps de trempage des semences pour différentes cultures peut varier.

3. Germination des graines et croissance des plantules

1. Préparer six concentrations des sels mélangés : 0 (témoin), 3, 5, 10, 15 et 20 g/L. Mesurer la conductivité de la solution saline à l’aide d’un conductimètre; les valeurs EC de conductivité de la solution sont respectivement de 0,092, 3,05, 4,73, 8,33, 11,53 et 15,22 ms/cm.
2. Pour la préparation des graines, placez uniformément 40 graines de poivron dans une boîte de Petri avec deux couches de papier filtre. Préparez les graines pour six traitements expérimentaux et répétez chaque traitement cinq fois.
3. Pour la germination des graines, ajoutez une quantité appropriée des six concentrations de sel mélangé à la boîte de Petri pour vous assurer que le papier filtre est maintenu humide. Placez les graines dans un incubateur à air à 28 °C et 80% d’humidité de l’air pour la germination dans l’obscurité.
4. Après la germination des graines, laissez les plantules continuer à pousser à la lumière (intensité lumineuse d’environ 450 Lux; cycle de lumière de 12/12h) dans l’incubateur pendant 14 jours après le semis. La température et l’humidité au stade de croissance des plantules doivent être les mêmes que celles utilisées au stade de la germination.
5. Reconstituer la solution dans la boîte de culture toutes les 12 heures pour retenir un papier filtre humide et laver complètement le papier filtre toutes les 24 heures avec la concentration correspondante de la solution saline mélangée pour maintenir une concentration constante de sel mélangé dans la boîte de Pétri.
   NOTE: La quantité de solution saline ajoutée aux graines humides peut être ajustée en fonction des stades de germination et de croissance des graines. De nombreuses méthodes sont disponibles pour maintenir une concentration constante de solutions salines dans les plats de culture. En plus des méthodes décrites dans cette expérience, la stratégie consistant à ajouter de l’eau distillée en poids peut être utilisée.

4. Mesure et calcul des indicateurs

1. Détermination des indices de germination des graines
   1. Déterminer le taux de germination quotidien après le semis, le tégument de rupture de la radicule atteignant la moitié de la longueur du diamètre de la graine comme marqueur de germination.
   2. Calculez le taux de germination, le potentiel de germination, le taux relatif de sel, l’indice de germination et l’indice de vigueur de germination des graines à l’aide des formules suivantes :
      Taux de germination (%) = (nombre de graines germées normales au jour 7 après le semis/nombre de graines testées) × 100
      Potentiel germinatif (%) = (nombre de graines germées normales au jour 3 après le semis/nombre de graines testées) × 100
      Taux relatif de sel (%) = (taux de germination témoin - taux de germination du traitement)/taux de germination témoin × 100
      calculé en utilisant le taux de germination des graines le jour 7 après le semis
      Indice de germination (IG) = ∑ [Gt/Dt]
      où Gt fait référence au nombre de germination des graines à une période de temps (t) après le semis et Dt se réfère aux jours de germination correspondants
      Indice de vigueur de germination des graines (VI) = IG x S
      où S est la longueur de la racine
2. Détermination de l’indice de croissance des plantules
   1. Le jour 14 après le semis, sélectionnez au hasard 10 plants représentatifs de chaque boîte de Petri et mesurez la longueur des racines et la longueur de l’hypocotyle.
   2. Utilisez un couteau pour diviser les plants de poivron en deux parties: radicule et parties aériennes. Retirez l’eau des semis en essuyant et pesez les plants séparément pour déterminer le poids frais.
3. Déterminez l’activité enzymatique antioxydante, le niveau de malondialdéhyde (MDA) et la teneur en proline (Pro) du poivre comme suit.
   1. Pour préserver les plants de poivrons, sélectionner des plants de poivron entier représentatifs (environ 24,0 g) de chaque traitement le jour 14 après le semis. Après avoir retiré l’eau de surface, congelez immédiatement les plantules dans de l’azote liquide pendant 1 min et conservez-les au réfrigérateur à une température ultra-basse (-80 °C).
      NOTE: Le nombre d’échantillons de plants de poivron stockés dans le réfrigérateur à ultra-basse température devrait être suffisant, au cas où certains indicateurs devraient être testés à nouveau.
   2. Prélever environ 1,0 g d’échantillon de plantules de chaque traitement prélevé en trois exemplaires. Placez l’échantillon de plantule dans un tube à centrifuger, ajoutez de l’azote liquide et broyez l’échantillon à l’aide d’une tige de broyage pour déterminer les indices physiologiques des plantules. Les indices déterminés et le schéma de mesure sont indiqués ci-dessous.
   3. Déterminer l’activité enzymatique protectrice des plantules (peroxydase [POD], catalase [CAT], superoxyde dismutase [SOD]), malondialdéhyde (MDA) et proline (Pro) à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce (basée sur la spectrophotométrie) pour chaque facteur¹⁴.
      REMARQUE : Les observations antérieures n’ont révélé aucune différence dans la contrainte saline entre les concentrations de sel mélangé de 15 et 20 g/L. Par conséquent, seulement cinq concentrations de sel (0, 3, 5, 10 et 15 g/L) sont mesurées.
4. Évaluation complète de la tolérance au sel à l’aide de la méthode de la fonction d’appartenance
   REMARQUE : La fonction d’appartenance utilise une méthode mathématique floue, qui convertit l’évaluation qualitative en évaluation quantitative¹⁵, pour évaluer une variété d’indices physiologiques affectés par les dommages causés par le sel.
   1. Calculez la valeur de la fonction d’appartenance à l’aide de la formule suivante de Zhoubin Liu et ^al.15 :
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Si un trait est négativement corrélé avec la tolérance au sel, calculez la fonction d’appartenance inverse en utilisant:
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Accumulez les valeurs d’appartenance de chaque indice physiologique, où Xi est la valeur mesurée d’un certain trait, Xmax et Xmin sont les valeurs maximale et minimale pour Xi, respectivement, et Ri est la valeur d’appartenance de ce trait.
   2. Inclure les indicateurs pertinents suivants : caractéristiques de germination des graines (potentiel de germination, taux de germination, indice de germination et indice de vigueur de germination des graines), caractéristiques de croissance des plantules au stade de la germination (longueur des racines, longueur de l’hypocotyle, poids frais des racines et poids frais au-dessus du sol), MDA, Pro et activité enzymatique protectrice (CAT, POD, SOD) pour le calcul de la valeur de la fonction d’adhésion. Les valeurs de la fonction d’appartenance sont obtenues à partir de chaque indicateur.
5. Utiliser un tableur et un logiciel SPSS (version 22.0) pour analyser et traiter les données d’essai et appliquer la méthode de la différence la moins significative (LSD) pour les comparaisons multiples afin d’identifier les différences significatives. Utilisez l’analyse de corrélation de Pearson pour étudier la corrélation entre la germination des graines et les indices physiologiques des semis de poivre sous stress salin composé.

Résultats

Caractéristiques de germination des graines
À mesure que la concentration de sel mélangé augmente, le potentiel de germination et l’indice de germination de Hongtianhu 101 et Xinxiang 8 diminuent considérablement. Les concentrations de sel des deux cultivars diminuent fortement de 0 à 3 g/L et diminuent lentement et régulièrement les concentrations de sel de 3 à 20 g/L (figure 1A,B). Le taux de germination des deux variétés diminue progressiv...

Discussion

Cette méthode de recherche comprend quatre étapes clés qui affectent la précision des résultats expérimentaux. Premièrement, en raison de la mauvaise dissolution des sels mélangés causée par l’augmentation de la teneur en soluté dans les solutions à forte concentration en sel, et de la faible solubilité des réactifs tels que le chlorure de calcium, qui sont plus difficiles à solubiliser dans l’eau, les réactifs pesés doivent être entièrement broyés dans un mortier. De plus, les réactifs doivent ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Centrifugal machine	Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China	TGL-16M
Centrifuge tube	None	None
Conductivity meter	Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China	DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box	Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China	PSX-280H
Digital display vernier caliper	Deli Group Co., Ltd.,China	DL90150
Electronic balance	Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China	ME802E/02
Filter paper	Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China	GB/T1914-2017
Grinding rod	None	None
Hongtianhu  101	Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China	11933955/100147K1-137
Ice machine	Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China	IM150G
Liquid nitrogen	None	None
Magnesium chloride	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Magnesium sulfate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Petri dish	Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China	I-000163
Pocket knife	None	None
Potassium permanganate (KMnO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Pure water equipment	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China	UPT-I-20T
Sodium bicarbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium carbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium chloride	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium sulfate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Test kit	Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China	Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China	760CRT
Xinxiang 8	Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China	GPD Pepper 2017(360013)