Análisis del efecto del estrés salino compuesto en la germinación de semillas y análisis de tolerancia a la sal de la pimienta (Capsicum annuum L.)

Resumen

El siguiente documento presenta un protocolo para medir la germinación de semillas, el crecimiento de las plántulas y los índices fisiológicos de dos variedades de pimiento con diferencias de tolerancia a la salinidad en respuesta a seis concentraciones mixtas de sal. Este protocolo se puede utilizar para evaluar la tolerancia a la sal de las variedades de pimienta.

Resumen

Para determinar la tolerancia a la sal y el mecanismo fisiológico de la pimienta (Capsicum annuum L.) en la etapa de germinación, se emplean como materiales de estudio las variedades Hongtianhu 101 y Xinxiang 8, que tienen grandes diferencias en la tolerancia a la sal. Se utilizan seis concentraciones mixtas de sal de 0, 3, 5, 10, 15 y 20 g/L derivadas utilizando proporciones molares iguales de Na2 CO 3, NaHCO₃, NaCl, CaCl 2, MgCl₂, MgSO ₄ y_Na2SO4. Para determinar sus efectos, se miden los índices relacionados de germinación de semillas, crecimiento de plántulas y fisiología, y la tolerancia a la sal se evalúa exhaustivamente utilizando el análisis de la función de membresía. Los resultados muestran que a medida que aumenta la concentración de sal mixta, el potencial de germinación, el índice de germinación, la tasa de germinación, el índice de vigor de germinación de la semilla, la longitud de la raíz y el peso fresco de la raíz de los dos cultivares disminuyen significativamente, mientras que la tasa relativa de sal aumenta gradualmente. La longitud del hipocótilo y el peso fresco sobre el suelo aumentan primero y luego disminuyen, mientras que la actividad de malondialdehído (MDA), prolina (Pro), catalasa (CAT), peroxidasa (POD) y superóxido dismutasa (SOD) disminuyen y luego aumentan. El potencial de germinación, el índice de germinación, la tasa de germinación, el índice de vigor de germinación de la semilla, la longitud de la raíz, el peso fresco de la raíz, el contenido de MDA y Pro, y la actividad CAT de las semillas Hongtianhu 101 son más altos que los de Xinxiang 8 para todas las concentraciones de sal empleadas aquí. Sin embargo, la longitud del hipocótilo, el peso fresco sobre el suelo y la tasa relativa de sal son más bajos en Hongtianhu 101 que en Xinxiang 8. La evaluación exhaustiva de la tolerancia a la sal revela que los valores ponderados totales de los dos índices de función de membresía aumentan primero y luego disminuyen a medida que aumenta la concentración de sal mixta. En comparación con 5 g / L, que tiene el valor de función de membresía más alto, el índice bajo concentraciones de sal de 3 g / L, 10 g / L y 15 g / L disminuye en 4.7% -11.1%, 25.3% -28.3% y 41.4% -45.1%, respectivamente. Este estudio proporciona orientación teórica para el mejoramiento de variedades de pimiento tolerantes a la sal y un análisis de los mecanismos fisiológicos involucrados en la tolerancia a la sal y el cultivo tolerante a la sal.

Introducción

La salinidad es un factor limitante importante para la productividad de los cultivos en todo el mundo¹. En la actualidad, casi el 19,5% de las tierras de regadío del mundo y el 2,1% de las tierras secas están afectadas por la salinidad, y aproximadamente el 1% de las tierras agrícolas degeneran en tierras salinas-alcalinas cada año. Para 2050, se espera que el 50% de la tierra cultivable se vea afectada por la salinización ^2,3. Además de los factores naturales, como la erosión natural de las rocas y el agua de lluvia salada cerca o alrededor de la costa, la rápida evaporación de la superficie, las bajas precipitaciones y los métodos de gestión agrícola irrazonables han exacerbado el proceso de salinización del suelo. La salinización del suelo inhibe el crecimiento de las raíces de las plantas y reduce la absorción y el transporte de agua y nutrientes desde las raíces de las plantas hasta las hojas. Esta inhibición resulta en escasez fisiológica de agua, desequilibrios nutricionales y toxicidad iónica, lo que conduce a una reducción de la productividad de los cultivos y una pérdida completa del rendimiento de los cultivos. La salinización de las tierras cultivadas se está convirtiendo gradualmente en uno de los factores de estrés abiótico más críticos que afectan la producción mundial de alimentos agrícolas⁴. El estrés salino reduce la tierra cultivable disponible para la agricultura, lo que puede dar lugar a un desequilibrio significativo entre la oferta y la demanda de futuros productos agrícolas. Por lo tanto, explorar los efectos de la salinización del suelo en el crecimiento de los cultivos y los mecanismos fisiológicos y bioquímicos es propicio para el mejoramiento de variedades tolerantes a la sal, la utilización sostenible del suelo salino y la inocuidad de los productos agrícolas.

La pimienta (Capsicum annuum L.) se siembra en todo el mundo debido a su alto valor nutricional y medicinal. Por ejemplo, la capsaicina es un alcaloide responsable del sabor picante de la pimienta. La capsaicina se puede utilizar para aliviar el dolor, pérdida de peso, mejorar los sistemas cardiovascular, gastrointestinal y respiratorio, y en varias otras aplicaciones⁵. La pimienta también es rica en sustancias bioactivas, especialmente diferentes compuestos antioxidantes (carotenoides, fenólicos y flavonoides) y vitamina C⁶. Actualmente, se informa que la pimienta es el cultivo de hortalizas con el área de cultivo más grande en China, con un área de siembra anual de más de 1.5 x 10⁶ ha, lo que representa el 8% -10% del área total de siembra de hortalizas en China. La industria de la pimienta se ha convertido en una de las industrias vegetales más grandes de China y tiene el valor de producción más alto⁷. Sin embargo, el cultivo de pimiento a menudo está sujeto a una variedad de tensiones biológicas (plagas y hongos) y abióticas, especialmente estrés salino, que tiene un impacto negativo directo en la germinación, el crecimiento y el desarrollo de las semillas, lo que resulta en la reducción del rendimiento y la calidad de la fruta de pimienta⁸.

La germinación de las semillas es la primera etapa de interacción entre las plantas y el medio ambiente. La germinación de las semillas es altamente sensible a las fluctuaciones en los medios circundantes, especialmente al estrés salino del suelo, que puede ejercer efectos invertidos sobre la fisiología y el metabolismo, y eventualmente alterar el crecimiento, desarrollo y morfogénesis normales de los cultivos⁹. En estudios anteriores, la germinación de las semillas de pimiento y el crecimiento de las plántulas bajo estrés salino se investigaron ampliamente; sin embargo, la mayoría de los estudios utilizaron NaCl como la única sal para la inducción de estrés^10,11,12. Sin embargo, el daño de la sal del suelo se debe principalmente a la toxicidad de Na+, Ca2+,^Mg2+, Cl-, CO^{3 2}-, y SO₄^2- ion generada por la disociación de sales de sodio, calcio y magnesio. Debido a la sinergia y el antagonismo entre los iones, los efectos de la mezcla de sal y sal simple en el crecimiento y desarrollo de los cultivos pueden ser muy diferentes. Sin embargo, las características correspondientes de la germinación de la semilla de pimienta y el crecimiento en sal mixta aún no están claras. Por lo tanto, dos variedades de pimiento con diferencias notables en la tolerancia a la sal se utilizan como materiales en este estudio. El análisis de los efectos de diferentes concentraciones de sal en la germinación de semillas de pimienta, el crecimiento y los índices fisiológicos y bioquímicos después de la mezcla equimolar de siete sales puede revelar el mecanismo de respuesta de la germinación de semillas de pimienta al estrés por salinidad. También puede proporcionar una base teórica para cultivar plántulas de pimiento fuertes, así como un cultivo de alto rendimiento y alta calidad en tierras cultivadas con solución salina.

Protocolo

NOTA: Aquí, presentamos un protocolo para evaluar las características de respuesta y los mecanismos internos de la germinación de semillas de pimiento y el crecimiento de plántulas bajo diferentes estreses de sal mixta, que puede servir como método de referencia para la evaluación de la tolerancia a la sal de semillas.

1. Preparación experimental

1. Prepare semillas de cultivo para cultivares: Hongtianhu 101 con fuerte tolerancia a la sal y Xinxiang 8 con baja tolerancia.
2. Preparar una solución de KMnO₄ al 0,2% como reactivo de desinfección de semillas. Primero, pesar 4.0 g de KMnO₄, y luego agregar 2,000 mL de agua destilada.
   NOTA: El permanganato de potasio suele ser inestable debido a su fuerte oxidación; En consecuencia, se prepara inmediatamente antes de su uso.
3. Prepare las sales mezcladas usando siete sales, incluyendo carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, sulfato de magnesio y sulfato de sodio¹³. Agregue la misma cantidad molar de cada uno, que sucesivamente representan 14.8%, 11.7%, 8.2%, 15.5%, 13.3%, 16.7% y 19.8% de la relación de masa total de las sales mixtas, respectivamente.
4. Preparar placas de Petri (de un solo uso) y papel de filtro (papel de filtro cualitativo de velocidad media), ambos con un diámetro de 9 cm.
   NOTA: El material de la placa de Petri se puede cambiar; sin embargo, el diámetro de la placa de Petri y el papel de filtro debe ser el mismo.

2. Remojo de semillas y preparación para la germinación

1. Para la optimización de semillas, seleccione semillas de pimiento con tamaño consistente y partículas completas de cada variedad, con un diámetro promedio de 4.2 mm y 3.7 mm para semillas Hongtianhu 101 y Xinxiang 8, respectivamente. Calcule el número total de semillas seleccionadas de acuerdo con la carga de trabajo de prueba.
2. Para la desinfección de semillas, remoje las semillas de pimiento seleccionadas en una solución KMnO₄ al 0,2% durante 15 minutos y luego enjuague cinco veces con agua destilada.
3. Para remojar las semillas, transfiera las semillas esterilizadas a agua destilada y déjelas en remojo durante 24 h. Enjuague las semillas varias veces con agua destilada y séquelas para su uso posterior.
   NOTA: El tiempo de remojo de las semillas para diferentes cultivos puede variar.

3. Germinación de semillas y crecimiento de plántulas

1. Prepare seis concentraciones de las sales mezcladas: 0 (control), 3, 5, 10, 15 y 20 g / L. Mida la conductividad de la solución salina usando un medidor de conductividad; los valores de EC de conductividad de la solución son 0.092, 3.05, 4.73, 8.33, 11.53 y 15.22 ms/cm, respectivamente.
2. Para la preparación de semillas, coloque uniformemente 40 semillas de pimiento en una placa de Petri con dos capas de papel de filtro. Prepare las semillas para seis tratamientos experimentales y repita cada tratamiento cinco veces.
3. Para la germinación de la semilla, agregue una cantidad adecuada de las seis concentraciones de sal mezcladas a la placa de Petri para asegurarse de que el papel de filtro se mantenga húmedo. Coloque las semillas en una incubadora de aire a 28 ° C y 80% de humedad del aire para la germinación en la oscuridad.
4. Después de la germinación de la semilla, permita que las plántulas continúen creciendo en luz (intensidad de luz de aproximadamente 450 Lux; ciclo de luz de 12/12h) en la incubadora durante 14 días después de la siembra. La temperatura y la humedad en la etapa de crecimiento de la plántula deben ser las mismas que las utilizadas en la etapa de germinación.
5. Reponga la solución en la placa de cultivo cada 12 h para retener un papel de filtro húmedo, y lave completamente el papel de filtro cada 24 h con la concentración correspondiente de la solución salina mezclada para mantener una concentración constante de sal mezclada en la placa de Petri.
   NOTA: La cantidad de solución salina añadida a las semillas húmedas se puede ajustar de acuerdo con las etapas de germinación y crecimiento de la semilla. Hay muchos métodos disponibles para mantener una concentración constante de soluciones salinas en platos de cultivo. Además de los métodos descritos en este experimento, se puede utilizar la estrategia de agregar agua destilada por peso.

4. Medición y cálculo de indicadores

1. Determinación de los índices de germinación de las semillas
   1. Determine la tasa de germinación diaria después de la siembra, con la capa de semilla que rompe la radícula alcanzando la mitad de la longitud del diámetro de la semilla como marcador de germinación.
   2. Calcule la tasa de germinación, el potencial de germinación, la tasa relativa de sal, el índice de germinación y el índice de vigor de germinación de la semilla utilizando las siguientes fórmulas:
      Tasa de germinación (%) = (número de semillas germinadas normales el día 7 después de la siembra / número de semillas analizadas) × 100
      Potencial de germinación (%) = (número de semillas germinadas normales el día 3 después de la siembra/número de semillas analizadas) × 100
      Tasa relativa de sal (%) = (tasa de germinación de control - tasa de germinación del tratamiento)/tasa de germinación de control × 100
      calculado utilizando la tasa de germinación de la semilla en el día 7 después de la siembra
      Índice de germinación (IG) = ∑ [Gt/Dt]
      donde Gt se refiere al número de germinación de la semilla en un período de tiempo (t) después de la siembra y Dt se refiere a los días de germinación correspondientes
      Índice de vigor de germinación de semillas (VI) = GI x S
      donde S es la longitud de la raíz
2. Determinación del índice de crecimiento de plántulas.
   1. El día 14 después de la siembra, seleccione al azar 10 plántulas representativas de cada placa de Petri y mida la longitud de la raíz y la longitud del hipocótilo.
   2. Use un cuchillo para dividir las plántulas de pimiento en dos partes: radícula y partes sobre el suelo. Retire el agua de las plántulas limpiando y pese las plántulas por separado para determinar el peso fresco.
3. Determine la actividad de la enzima antioxidante, el nivel de malondialdehído (MDA) y el contenido de prolina (Pro) en la pimienta de la siguiente manera.
   1. Para preservar las plántulas de pimiento, seleccione plántulas de pimiento enteras representativas (aproximadamente 24.0 g) de cada tratamiento el día 14 después de la siembra. Después de eliminar el agua superficial, congele inmediatamente las plántulas en nitrógeno líquido durante 1 minuto y guárdelas en un refrigerador a una temperatura ultra baja (-80 ° C).
      NOTA: El número de muestras de plántulas de pimiento almacenadas en el refrigerador de temperatura ultra baja debería ser suficiente, en caso de que sea necesario volver a analizar algunos indicadores.
   2. Recuperar aproximadamente 1,0 g de muestra de plántula de cada tratamiento recogido por triplicado. Coloque la muestra de plántula en un tubo de centrífuga, agregue nitrógeno líquido y muele la muestra con una varilla de molienda para determinar los índices fisiológicos de las plántulas. Los índices determinados y el esquema de medición se muestran a continuación.
   3. Determine la actividad enzimática protectora de las plántulas (peroxidasa [POD], catalasa [CAT], superóxido dismutasa [SOD]), malondialdehído (MDA) y prolina (Pro) utilizando un kit disponible comercialmente (basado en espectrofotometría) para cada factor¹⁴.
      NOTA: Observaciones anteriores no revelaron diferencias en el estrés salino entre las concentraciones de sal mixta de 15 y 20 g/L. Como resultado, solo se miden cinco concentraciones de sal (0, 3, 5, 10 y 15 g / L).
4. Evaluación exhaustiva de la tolerancia a la sal utilizando el método de función de membresía
   NOTA: La función de membresía utiliza un método matemático difuso, que convierte la evaluación cualitativa en evaluación cuantitativa¹⁵, para evaluar una variedad de índices fisiológicos afectados por el daño de la sal.
   1. Calcule el valor de la función de pertenencia utilizando la siguiente fórmula de Zhoubin Liu et ^al.15:
      Ri = (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Si un rasgo se correlaciona negativamente con la tolerancia a la sal, calcule la función de pertenencia inversa usando:
      Ri = 1 - (Xi - Xmin)/(Xmax - Xmin)
      Acumule los valores de membresía de cada índice fisiológico, donde Xi es el valor medido de un determinado rasgo, Xmax y Xmin son los valores máximo y mínimo para Xi, respectivamente, y Ri es el valor de membresía de ese rasgo.
   2. Incluya los siguientes indicadores relevantes: características de germinación de la semilla (potencial de germinación, tasa de germinación, índice de germinación e índice de vigor de germinación de la semilla), características de crecimiento de las plántulas en la etapa de germinación (longitud de la raíz, longitud del hipocótilo, peso fresco de la raíz y peso fresco sobre el suelo), MDA, Pro y actividad enzimática protectora (CAT, POD, SOD) para el cálculo del valor de la función de membresía. Los valores de la función de pertenencia se obtienen de cada indicador.
5. Utilice hojas de cálculo y software SPSS (versión 22.0) para analizar y procesar los datos de prueba y aplicar el método de diferencia menos significativa (LSD) para comparaciones múltiples para identificar diferencias significativas. Utilice el análisis de correlación de Pearson para investigar la correlación entre la germinación de semillas y los índices fisiológicos de plántulas de pimienta bajo estrés salino compuesto.

Resultados

Características de germinación de las semillas
A medida que aumenta la concentración de sal mixta, el potencial de germinación y el índice de germinación de Hongtianhu 101 y Xinxiang 8 disminuyen significativamente. Ambos cultivares tienen una fuerte disminución en las concentraciones de sal de 0-3 g / L, y una disminución lenta y constante para las concentraciones de sal de 3-20 g / L (Figura 1A, B). La tasa de germinación de las dos variedades ...

Discusión

Este método de investigación comprende cuatro pasos clave que afectan la precisión de los resultados experimentales. En primer lugar, debido a la mala disolución de sales mixtas causada por el aumento del contenido de solutos en soluciones de alta concentración de sal, y la baja solubilidad de reactivos como el cloruro de calcio, que son más difíciles de solubilizar en agua, los reactivos pesados deben ser completamente molidos en un mortero. Además, los reactivos deben disolverse a través de ondas ultr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcium chloride	Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Centrifugal machine	Shanghai Luxianyi Centrifuge Instrument Co., Ltd., China	TGL-16M
Centrifuge tube	None	None
Conductivity meter	Shanghai Instrument&Electronics Science Instrument Co., Ltd., China	DDSJ-308F
Constant temperature and humidity box	Ningbo Laifu Technology Co., Ltd.,China	PSX-280H
Digital display vernier caliper	Deli Group Co., Ltd.,China	DL90150
Electronic balance	Mettler Toledo Instruments (Shanghai) Co., Ltd.,China	ME802E/02
Filter paper	Hangzhou Fuyang North Wood Pulp and Paper Co., Ltd.,China	GB/T1914-2017
Grinding rod	None	None
Hongtianhu  101	Seminis Seed (Beijing) Co., Ltd.,China	11933955/100147K1-137
Ice machine	Shanghai Kehuai Instrument Co., Ltd., China	IM150G
Liquid nitrogen	None	None
Magnesium chloride	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Magnesium sulfate	Tianjin Kermel Chemical Reagent Co., Ltd.,China	Analytical reagent
Petri dish	Jiangsu Yizhe Teaching Instrument Co., Ltd.,China	I-000163
Pocket knife	None	None
Potassium permanganate (KMnO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Pure water equipment	Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.,China	UPT-I-20T
Sodium bicarbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium carbonate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium chloride	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Sodium sulfate	Xilong Scientific Co.,Ltd.,China	Analytical reagent
Test kit	Suzhou Keming, Biotechnology Co., Ltd, Suzhou.,China	Spectrophotometer method
Ultra-low temperature freezer	SANYO Techno Solution TottoriCo.,Ltd.	MDF-382
Ultraviolet visible spectrophotometer	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd., China	760CRT
Xinxiang 8	Jiangxi Nongwang High Tech Co., Ltd.,China	GPD Pepper 2017(360013)