通过邻近连接测定可视化和定量ER-线粒体接触部位的内源性细胞器内蛋白相互作用

摘要

由于对这些细胞结构及其组分的研究兴趣日益浓厚，对研究膜接触位点（MCS）的新方法的需求也在增长。在这里，我们提出了一种协议，该协议集成了以前可用的显微镜技术，以识别和量化驻留在MCS中的细胞器内和细胞器间蛋白质复合物。

摘要

膜接触位点（MCS）是膜紧密接近的区域，允许并调节并列细胞器之间不同生物分子（即钙和脂质）的动态交换，而不涉及膜融合。MCS对于细胞稳态至关重要，其功能由常驻成分确保，常驻成分通常以多聚体蛋白质复合物的形式存在。MCS通常涉及内质网（ER），这是脂质合成和细胞钙储存的主要部位，对于细胞器（例如线粒体）尤其重要，这些细胞器被排除在经典囊泡运输途径之外。在过去的几年中，ER和线粒体之间的MCS已经被广泛研究，因为它们的功能强烈影响细胞代谢/生物能量学。在这些接触位点已经开始鉴定几种蛋白质，包括膜系、钙通道和脂质转移蛋白，因此提出了研究这些 MCS 组分的新方法和技术方法的需求。在这里，我们描述了一种由组合技术方法组成的协议，包括邻近连接测定（PLA），线粒体染色和3D成像分割，允许检测物理上彼此接近（>40nm）并且位于ER-线粒体MCS的同一膜上的蛋白质。例如，我们使用了两种ER锚定的脂质转移蛋白ORP5和ORP8，它们先前已被证明在ER-线粒体和ER-质膜MCS中相互作用和定位。通过将ORP5-ORP8 PLA与细胞成像软件分析相关联，可以估计ORP5-ORP8复合物与线粒体表面的距离，并确定约50%的ORP5-ORP8 PLA相互作用发生在靠近线粒体的ER亚域。

引言

细胞间通讯是真核细胞的一个决定性特征。细胞器交流的一种方式是形成膜接触位点（MCS），这是两个细胞器之间的紧密膜对立，由结构和功能蛋白（如系绳、脂质转移蛋白和^钙通道）维持1。MCS可以在相似或不同的细胞器之间建立，它们介导细胞成分的交换，这对于维持细胞稳态很重要。迄今为止，已经鉴定了几种 MCS，包括内质网 （ER）-线粒体、ER-质膜 （PM） 和 ER-脂质液滴 （LD） 接触¹。其中，ER和线粒体（MERCSs）之间形成的那些是研究最多的，因为它们参与调节多种细胞功能，包括脂质和钙稳态²。由于线粒体在很大程度上被排除在经典的囊泡运输途径之外，它们依靠MERCS及其分子成分从ER导入关键脂质或脂质前体。这些脂质在MERCS中的非囊泡运输确保了维持适当的线粒体脂质组成，以及它们的功能和^{结构完整性3}。

鉴于MCS在各种细胞功能中的关键参与，在过去几年中，对更深入地了解其分子成分的兴趣大大增加。已经使用了几种基于成像的方法来提高对MCS的了解。其中，基于荧光探针的邻近连接测定法（PLA）已被广泛用作MCS丰度的指标，通过在内源水平⁴下检测细胞器间蛋白质-蛋白质相互作用（在40nm的检测范围内）。例如，MERCS已经通过使用几个线粒体-ER蛋白对之间的PLA进行可视化和定量，包括VDAC1-IP3R，GRP75-IP3R，CypD-IP3和PTPIP51-VAPB 5,6,7,8。尽管该技术已被用于检测和量化MCS 5,7,9,10,11中存在的细胞器间蛋白质 - 蛋白质相互作用^，但大多数研究并未将PLA与细胞器染色相结合。因此，尚未开发出一种定量方法，可以测量PLA相互作用与相关细胞器之间的接近度。因此，到目前为止，在ER蛋白的情况下，它们在与其他细胞器接触的膜亚域内的相互作用尚未与它们在广泛分布的ER网络中的相互作用区分开来。

在这里，我们描述了一种方案，用于检测驻留在同一细胞器膜中的蛋白质之间的PLA相互作用，并分析它们与MCS中伴侣细胞器的膜的接近程度。该协议是基于两个前提开发的:1）先前的研究表明，在过表达条件下，ER脂质转移蛋白ORP5和ORP8在ER-线粒体和ER-PM MCSs 12,13,14,15上共定位和相互作用，ORP5定位在ER-LD接触^16,17;2）现有技术，包括PLA，共聚焦显微镜，细胞器标记和3D成像分析。

研究方案

1. 线粒体染色和邻近连接试验 （PLA）

1. 板 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa 细胞，维持在 Dulbecco 的改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，补充有 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% 非必需氨基酸，在 37 °C 和 5% CO₂ 下，在 13 mm 玻璃盖玻片中，在^1.5 英寸 24 孔板中以稀释度允许 75%-90% 细胞汇合在手术当天。
   注意:值得注意的是，在线粒体染色和PLA之前，HeLa细胞可以提交其他处理，例如siRNA处理和/或DNA质粒转染。
2. 线粒体染色
   1. 在37°C预热的无血清培养基中洗涤细胞一次。 用预热的无血清培养基在37°C和5%CO₂孵育细胞10分钟。
   2. 在预热的无血清培养基中制备1μM红色线粒体标记物。
   3. 用500μL线粒体标记溶液在37°C下用5%CO₂孵育细胞30分钟。在线粒体标志物治疗和协议的后续步骤中，尽可能将盖玻片上的细胞保持在避光处。
   4. 孵育后，在预热的无血清培养基中洗涤细胞1x，在1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤细胞2x。尽快执行此步骤，因为固定前的长时间洗涤步骤可能会影响线粒体形态。
   5. 从盖玻片中取出1x PBS，并通过在化学罩下的室温（在黑暗中）在新鲜制备的4%PFA（在1x PBS）中孵育30分钟来固定细胞。在 500 μL 1x PBS 中洗涤 3 次 2 分钟（使用一次性移液管或连接到泵的真空系统）。
   6. 取出 1x PBS，并将盖玻片与 500 μL 50mM NH₄Cl 在室温下（在黑暗中）孵育 15 分钟。使用真空系统在 500 μL 的 1x PSB 中洗涤 1 次 2 分钟。
   7. 在 ORP5-ORP8 PLA 的 500 μL 封闭缓冲液 1（BB1、1% BSA、1x PBS 中的 0.1% 皂苷）中洗涤 3 次 2 分钟，或用于 ORP8-PTPIP51 PLA 的封闭缓冲液 2（BB2、2% BSA、0.1% 正常山羊血清、0.1 皂苷在 1x PBS 中）。
   8. 将盖玻片从24孔板转移到湿度室中。将盖玻片转移到腔室后，加入 100 μL BB（BB1 或 BB2，根据使用的抗体对）以避免干燥。
      注意:通过将培养皿（塑料或玻璃）包裹在铝箔中并在培养皿的外围添加一些湿纸巾，可以轻松快速地获得避光的湿度室。
3. 邻近连接测定 （PLA）
   注:PLA 协议遵循制造商的说明，稍作修改。
   1. 一抗孵育
      1. 制备一抗工作溶液。在BB1中稀释兔抗ORP5（1:150）加小鼠抗ORP8（1:200），在BB2中稀释小鼠抗ORP8（1:200）加兔抗PTPIP51（1:200），在BB1中稀释兔抗ORP5（1:150）加小鼠抗PTPIP51（1:200）。每个盖玻片制备（至少）40 μL 一抗溶液（例如，0.27 μL 兔抗 ORP5、0.2 μL 小鼠抗 ORP8、39.53 μL BB1）。
      2. 使用真空系统从上次洗涤（步骤1.2.8）中取出BB，并向盖玻片中加入40μL一抗溶液。在室温下在避光的湿度室中孵育1小时。
   2. 使用真空系统用 100 μL 相应的 BB 洗涤盖玻片 3 次 5 分钟。
   3. 聚乳酸探针孵化
      1. 准备PLA探头工作溶液。在BB中稀释兔加（1:5）和小鼠减（1:5）PLA探针，并混合。对于每个盖玻片，准备（至少）40 μL PLA 探针溶液（例如，8 μL 兔 PLUS PLA 探针、8 μL 小鼠减去 PLA 探针、24 μL BB）。使用前，让PLA探针溶液在室温下静置20分钟。
      2. 使用真空系统从盖玻片（从步骤1.3.2）中取出BB，并向盖玻片中加入40μLPLA探针溶液。在避光的湿度室中于37°C孵育1小时。
   4. 在室温下在 100 μL 1x 洗涤缓冲液 A 中洗涤盖玻片 2 次 5 分钟。
   5. 结扎
      1. 在超纯水中将5x连接缓冲液稀释至1:5并混合。对于每个盖玻片，准备（至少）40 μL 连接溶液（8 μL 5x 连接缓冲液，31 μL 超纯水）。
      2. 将连接酶（1 U/μL，在PLA试剂盒中提供）以1:40的稀释度加入上一步制备的1x连接缓冲液中，并混合。
      3. 使用真空系统从盖玻片（从步骤1.3.4）中取出1x洗涤缓冲液A，向盖玻片中加入40μL连接酶溶液，并在37°C下在避光的湿度室中孵育30分钟。
   6. 使用真空系统在室温下在 100 μL 1x 洗涤缓冲液 A 中洗涤盖玻片 2 次 2 分钟。
   7. 聚合
      1. 在超纯水中以1:5的比例稀释5倍扩增缓冲液，并混合。对于每个盖玻片，准备（至少）40 μL 扩增溶液（8 μL 5x 扩增缓冲液，31.5 μL 超纯水）。
      2. 将聚合酶（10 U/μL，在PLA试剂盒中提供）以1:80的稀释度加入上一步制备的1x聚合缓冲液中，并混合。
      3. 使用真空系统从盖玻片（从步骤1.3.6）中取出1x洗涤缓冲液A，向盖玻片中加入40μL聚合酶溶液，并在37°C下在避光的湿度室中孵育1小时40分钟。
   8. 从盖玻片中取出聚合酶溶液，并在室温下在避光的湿度室中在 100 μL 的 1x 洗涤缓冲液 B 中洗涤 2 次 10 分钟。
   9. 在室温下在避光的湿度室中，在 100 μL 的 0.001x 洗涤缓冲液 B 中洗涤盖玻片 1 次 1 分钟。
   10. 使用具有DAPI（浓度在1.6-0.4μg/ mL之间）的封片剂将盖玻片安装在载玻片上进行显微镜检查。用指甲油密封。

2. 图像采集

1. 观察PLA结果，并使用随附的软件使用荧光共聚焦显微镜和63倍油浸物镜获取图像。
2. 使用 405 nm 半导体激光管或白光激光器设置荧光激发，并使用 GaAsP PMT 或混合检测器收集光谱窗口。在每个焦平面（跨越300nm）上，获取PLA（λex = 488 nm，λem = 505-560 nm）和线粒体（λex = 543 nm，λem = 606-670 nm）的荧光信号。

3. 线粒体相关PLA斑点的图像处理与评估

1. 使用图像分析软件处理共聚焦图像，该软件可在细胞组件之间生成距离图。按照以下步骤生成PLA斑点和线粒体网络的3D重建，并使用细胞成像软件访问它们之间的距离（图1）。
2. 安装3D距离图扩展
   1. 安装带有XT选项的细胞分析软件包和MATLAB软件，或者仅安装MATLAB编译器运行时（MRC），可以从网站上免费下载。
   2. 设置细胞分析软件以在启动 XTension 时启动 MATLAB，如下所示:从选项 Imaris （Mac OS X） 或 编辑 菜单 （Windows） 中，选择 首选项，切换到 自定义工具 面板，然后设置路径:
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe for Windows 或/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab for Mac OS X.
3. 将图像导入软件
   1. 将共聚焦堆栈图像转换为 .IMS文件，直接通过竞技场部分或使用允许批量转换的独立 文件转换器 。
   2. 导入后，检查图像是否保持正确校准。单击 >图像几何体的编辑图像属性>并检查体素大小在 X 和 Y 中是否与实际图像预期的像素大小相对应（请参阅采集软件中的图像校准），以及 Z 中的体素大小是否对应于显微镜用于生成 Z 堆栈的步骤。如果值不正确，请修改它们以确保在以下步骤中正确估计距离。
   3. 通过单击"显示调整">"显示调整"来调整菜单"显示调整"中不同通道的对比度。独立调整每个通道以优化每种颜色的显示。此步骤不会直接影响图像值，但对于设置精确阈值或检测弱物体至关重要。
   4. 通过使用选项编辑 >裁剪 3D 裁剪图像，将分析限制为单个单元格。要分析同一视野中的另一个单元格，请再次打开同一图像，然后以不同的方式裁剪。
4. ORP5-ORP8 斑点检测
   1. 通过单击添加新点选项来检测在ORP5和ORP8相互作用位置生成的PLA信号，该选项将创建一组新对象并打开 点 检测向导。
   2. 选择应执行点检测的通道。
   3. 调整 估计XY直径 （如果对象大小不同，则必须调整范围），以帮助点检测算法找到感兴趣的对象。请注意，如果选择的值太高，附近的对象将融合。如果该值太小，则一个信号可能被视为多个对象，或者可能会检测到异常信号。
   4. 单击背景 减去 以在点检测之前删除图像背景，以增强感兴趣对象周围的局部对比度。
   5. 通过将质量（对象中心的强度）保留为阈值参数和软件自动阈值来调整点检测阈值，或稍微修改此值以检测所有对象。点检测完成后，保存检测参数，并重复使用它们来处理其他图像。
5. 线粒体网络检测
   1. 检测线粒体网络以生成表面渲染，方法是单击添加新 表面 以创建新对象，然后打开表面检测向导。
   2. 选取应在其上执行曲面创建的通道。
   3. 应用高斯滤镜以获得更平滑的表面，方法是单击" 平滑 "复选框并设置指示表面上可观察到的最小细节的阈值。
   4. 执行背景减法以增强局部对比度并帮助完成阈值步骤。
   5. 根据信号强度调整阈值以检测线粒体网络。如果难以正确设置阈值，建议返回上一步调整平滑度和背景减去。
   6. 如有必要，在表面上应用过滤器以去除阈值产生的小残留物。为此，请在分类表面窗口中选择体 素数 过滤器，并使用上限和下限阈值以仅保留感兴趣的对象。曲面创建结束后，保存创建参数，并重复使用它们来处理其他图像。
6. 生成线粒体周围的 3D 距离图
   1. 生成先前创建的线粒体表面之外的距离图，如下所示。在场景树框中选择线粒体表面。单击 图像处理>表面功能>距离变换。这将调用 Matlab XTension，要求用户选择是应该在对象表面外部还是内部计算地图。
   2. 选择 "外表面对象 "以测量 PLA 光斑与线粒体表面之间的距离。生成后，距离图在显示调整面板中显示为新通道。在这个通道中，每个像素都有一个对应于到最近线粒体的距离的值。
7. 提取物体与最近线粒体的距离
   1. 要测量每个点到最近线粒体的距离，并识别和可视化最近的线粒体，请选择之前在场景树框中生成的点。
   2. 在统计信息和详细日志中，选择 "特定值 "（为每个点获取一个测量值）。选择 中心强度 Ch=X （X 对应于距离图通道的编号）。这将测量距离图中每个点中心的值，该值对应于其到最近线粒体的距离。
   3. 通过单击窗口左下角的软 盘 图标将数据导出为.csv文件。
   4. 要根据斑点到线粒体的距离提取斑点子群，请在场景树中选择斑点，然后单击 过滤器 选项卡。
   5. 在此窗口中，再次基于中心强度 Ch=X 添加新滤光片，并通过将下限阈值设置为 0 μm 和上限阈值设置为 0.380 μm 来提取距离线粒体小于 380 nm 的斑点。
      注意:380 nm 的阈值是根据 PLA 反应估计的，包括一抗和二抗 （30 nm） 加上 PLA 扩增信号 （350 nm） 半最大值全宽 （FWHM） 的一半之间的关联。
   6. 要聚焦所选光斑，例如，为其指定不同的颜色，请按 "将所选内容复制到新色点 "按钮执行复制步骤。

结果

使用上述方案，我们检测了两种ER锚定脂质转移蛋白ORP5和ORP8的相互作用位点，并评估了它们在与其他细胞器（特别是线粒体）接触的ER膜亚域中的发生。为此，用红色线粒体标记物染色HeLa细胞中的线粒体网络，并使用一抗抗ORP5和抗ORP8固定后检测ORP5-ORP8 PLA绿色斑点，其特异性先前通过免疫荧光¹⁵进行测试。共聚焦图像显示，HeLa细胞中的内源性ORP5-ORP8 PLA相互作用发生在网状ER，皮...

讨论

该协议旨在识别和量化MCS的细胞器间蛋白PLA相互作用，特别是在MERCS。该方案的新颖之处在于它将PLA与多个细胞器的标记，共聚焦显微镜和3D图像分析相结合，以定位和量化位于同一膜中的两种蛋白质之间的PLA相互作用，在这种情况下，在ER膜内与线粒体膜（MAM）或同时与MAM和LD非常接近。该协议可用作验证可能定位于特定MERCS的蛋白质的工具，但也可用于其他MCS。

自2006年开发...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)	Gibco	14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)	VWR	21236.291
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos red MitoTracker	Invitrogen	M7512	red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates	Merck	CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	51985026	serum free medium
Imaris software v 9.3	Bitplane	N/A	cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10	VWR	390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)	Knittel Glass
mouse anti-ORP8	Santa Cruz	134409
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
rabbit anti-ORP5	Sigma	HAP038712
Saponin	Sigma	84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free	Invitrogen	10977-035