Visualização e quantificação de interações endógenas intra-organelas em sítios de contato ER-mitocôndrias por ensaios de ligadura de proximidade

Resumo

A necessidade de novas abordagens para o estudo dos sítios de contato com membranas (SCM) tem crescido devido ao crescente interesse no estudo dessas estruturas celulares e seus componentes. Aqui, apresentamos um protocolo que integra tecnologias de microscopia previamente disponíveis para identificar e quantificar complexos proteicos intra-organelas e interorganelas que residem em SCGs.

Resumo

Sítios de contato com a membrana (MCSs) são áreas de proximidade da membrana que permitem e regulam a troca dinâmica de diversas biomoléculas (isto é, cálcio e lipídios) entre as organelas justapostas sem envolver a fusão da membrana. Os SCG são essenciais para a homeostase celular, e suas funções são asseguradas pelos componentes residentes, que muitas vezes existem como complexos proteicos multiméricos. Os SCMs frequentemente envolvem o retículo endoplasmático (RE), um importante local de síntese lipídica e armazenamento celular de cálcio, e são particularmente importantes para organelas, como as mitocôndrias, que são excluídas das vias clássicas de transporte vesicular. Nos últimos anos, os SCG entre o RE e as mitocôndrias têm sido extensivamente estudados, pois suas funções impactam fortemente o metabolismo celular/bioenergética. Várias proteínas começaram a ser identificadas nesses sítios de contato, incluindo cabos de membrana, canais de cálcio e proteínas de transferência de lipídios, levantando a necessidade de novas metodologias e abordagens técnicas para estudar esses componentes da MCS. Aqui, descrevemos um protocolo que consiste em abordagens técnicas combinadas, que incluem ensaio de ligadura de proximidade (PLA), coloração mitocondrial e segmentação de imagem 3D, que permite a detecção de proteínas fisicamente próximas (>40 nm) entre si e que residem na mesma membrana em MCSs de mitocôndrias de RE. Por exemplo, usamos duas proteínas de transferência lipídica ancoradas em RE, ORP5 e ORP8, que já demonstraram interagir e se localizar em MCSs de membrana plasmática de RE e ER-membrana plasmática. Ao associar o PLA ORP5-ORP8 com a análise de software de imagem celular, foi possível estimar a distância do complexo ORP5-ORP8 da superfície mitocondrial e determinar que cerca de 50% da interação ORP5-ORP8 PLA ocorre em subdomínios de RE próximos às mitocôndrias.

Introdução

A comunicação interorganela é uma característica definidora das células eucarióticas. Uma maneira pela qual as organelas se comunicam é formando sítios de contato com a membrana (MCSs), que são oposições de membrana próximas entre duas organelas que são mantidas por proteínas estruturais e funcionais, como amarrações, proteínas de transferência de lipídios e canais de cálcio¹. Os SCGs podem ser estabelecidos entre organelas semelhantes ou diferentes e medeiam a troca de componentes celulares, o que é importante para a manutenção da homeostase celular. Até o momento, vários SCMs foram identificados, incluindo retículo endoplasmático (RE)-mitocôndrias, RE-membrana plasmática (PM) e contatos RE-gotículas lipídicas (DL)¹. Dentre elas, as formadas entre o RE e as mitocôndrias (MERCSs) estão entre as mais estudadas, pois estão envolvidas na regulação de diversas funções celulares, incluindo a homeostase lipídica e do^cálcio2. Como as mitocôndrias são amplamente excluídas das vias de transporte vesicular clássicas, elas dependem do MERCS e de seus constituintes moleculares para importar lipídios chave ou precursores lipídicos do RE. O transporte não vesicular desses lipídios através dos MERCSs garante a manutenção da composição lipídica mitocondrial adequada, bem como sua integridade funcional e estrutural³.

Dado o envolvimento crucial dos MCSs em várias funções celulares, o interesse em fornecer uma compreensão mais profunda de seus componentes moleculares tem aumentado muito nos últimos anos. Vários tipos de abordagens baseadas em imagem têm sido usados para avançar o conhecimento sobre os SCGs. Dentre eles, o ensaio de ligadura de proximidade (PLA) baseado em sonda de fluorescência tem sido amplamente utilizado como um indicador da abundância de MCSs por meio da detecção de interações proteína-proteína interorganela (em uma faixa de detecção de 40 nm) em níveis endógenos⁴. Por exemplo, MERCSs foram visualizados e quantificados usando PLA entre vários pares de proteínas mitocondria-RE, incluindo VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 e PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Embora essa tecnologia tenha sido utilizada para detectar e quantificar interações proteína-proteína interorganelas presentes no ACM 5,7,9,10,11^, a maioria dos estudos não combinou PLA com coloração de organela. Consequentemente, um método quantitativo que permita medir a proximidade entre as interações do PLA e organelas associadas ainda não foi desenvolvido. Assim, até o momento, no caso das proteínas de RE, sua interação dentro de subdomínios de membrana em contato com outras organelas não foi distinguida de sua interação dentro da rede de RE amplamente distribuída.

Aqui, descrevemos um protocolo para detectar interações de PLA entre proteínas que residem na membrana da mesma organela e analisar sua proximidade com a membrana da organela parceira no MCS. Esse protocolo foi desenvolvido com base em duas premissas: 1) estudos prévios mostrando que, em condições de superexpressão, as proteínas de transferência lipídica ORP5 e ORP8 co-localizam e interagem em ER-mitocôndrias e ER-PM MCSs 12,13,14,15 e que ORP5 localiza-se em contatos ER-LD ^16,17; 2) tecnologias existentes, incluindo PLA, microscopia confocal, marcação de organelas e análise de imagens 3D.

Protocolo

1. Coloração mitocondrial e ensaio de ligadura de proximidade (PLA)

1. Placa 0,5 x 10 5-2 x 10 5 células HeLa, mantidas em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com¹⁰% de SFB, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de aminoácidos não essenciais a 37 °C com 5% de CO₂, em lamínulas de vidro de 13 mm em placas de^1,5 em 24 poços em uma diluição que permite 75%-90% de confluência celular no dia do procedimento.
   NOTA: É importante ressaltar que as células HeLa podem ser submetidas a tratamentos adicionais, como tratamento com siRNA e/ou transfecção de DNA plasmidial, antes da coloração mitocondrial e PLA.
2. Coloração mitocondrial
   1. Lavar as células uma vez em meio sem soro pré-aquecido a 37 °C. Incubar as células com meio pré-aquecido sem soro por 10 min a 37 °C com 5% de CO₂.
   2. Preparar 1 μM de marcador mitocondrial vermelho em meio pré-aquecido sem soro.
   3. Incubar as células com 500 μL de solução marcadora mitocondrial durante 30 min a 37 °C com CO₂ a 5%. Durante o tratamento com marcadores mitocondriais e as etapas seguintes do protocolo, mantenha as células em lamínulas protegidas da luz o máximo possível.
   4. Após a incubação, lavar as células 1x em meio pré-aquecido sem soro e 2x em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Execute esta etapa o mais rápido possível, pois longos passos de lavagem antes da fixação podem afetar a morfologia mitocondrial.
   5. Retire o 1x PBS das lamínulas e fixe as células incubando-as em PFA 4% recém-preparado (em 1x PBS) por 30 min à temperatura ambiente (no escuro) sob o capô químico. Lave 3x por 2 min em 500 μL de 1x PBS (usando pipetas descartáveis ou um sistema de vácuo conectado a uma bomba).
   6. Remova o PBS 1x e incube as lamínulas com 500 μL de 50mM NH₄Cl por 15 min à temperatura ambiente (no escuro). Lave 1x por 2 min em 500 μL de 1x PSB usando um sistema de vácuo.
   7. Lavar 3x por 2 min em 500 μL do tampão de bloqueio 1 (BB1, 1% BSA, 0,1% saponina em 1x PBS) para o PLA ORP5-ORP8 ou tampão de bloqueio 2 (BB2, 2% BSA, 0,1% de soro normal de cabra, 0,1 saponina em 1x PBS) para o ORP8-PTPIP51 PLA.
   8. Transfira as lamínulas da placa de 24 poços para uma câmara de umidade. Após transferir as lamínulas para a câmara, adicionar 100 μL de BB (BB1 ou BB2, de acordo com os pares de anticorpos utilizados) para evitar o ressecamento.
      NOTA: Uma câmara de umidade protegida da luz pode ser fácil e rapidamente obtida envolvendo uma placa de Petri (plástico ou vidro) em papel alumínio e adicionando alguns pedaços de papel toalha molhado na periferia da placa de Petri.
3. Ensaio de ligadura de proximidade (PLA)
   NOTA: O protocolo PLA segue as instruções do fabricante com pequenas modificações.
   1. Incubação primária de anticorpos
      1. Prepare a solução primária de trabalho de anticorpos. Diluir coelho anti-ORP5 (1:150) mais camundongo anti-ORP8 (1:200) em BB1, camundongo anti-ORP8 (1:200) mais coelho anti-PTPIP51 (1:200) em BB2, e coelho anti-ORP5 (1:150) mais camundongo anti-PTPIP51 (1:200) em BB1. Preparar (pelo menos) 40 μL de solução de anticorpos primários por lamínula (por exemplo, 0,27 μL de coelho anti-ORP5, 0,2 μL de camundongo anti-ORP8, 39,53 μL de BB1).
      2. Retirar o BB da lavagem anterior (passo 1.2.8) utilizando um sistema de vácuo e adicionar 40 μL de solução de anticorpos primários às lamínulas. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara de humidade protegida da luz.
   2. Lave as lamínulas 3x por 5 min com 100 μL do BB correspondente usando o sistema de vácuo.
   3. Incubação da sonda PLA
      1. Prepare a solução de trabalho das sondas PLA. Diluir as sondas PLA de coelho PLUS (1:5) e MINUS (1:5) em BB e misturar. Para cada lamínula, prepare (pelo menos) 40 μL de solução de sonda PLA (por exemplo, 8 μL de sonda PLUS PLA de coelho, 8 μL de sonda MENOS PLA de ratinho, 24 μL de BB). Deixe a solução da sonda PLA descansar por 20 minutos à temperatura ambiente antes do uso.
      2. Retire o BB das lamínulas (do passo 1.3.2) utilizando um sistema de vácuo e adicione 40 μL de solução de sonda PLA às lamínulas. Incubar durante 1 h a 37°C numa câmara de humidade protegida da luz.
   4. Lave as lamínulas 2x durante 5 minutos em 100 μL de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente.
   5. Ligadura
      1. Diluir o tampão de ligadura de 5x a 1:5 em água ultrapura e misturar. Para cada lamínula, preparar (pelo menos) 40 μL de solução de ligadura (8 μL de tampão de ligadura 5x, 31 μL de água ultrapura).
      2. Adicionar a ligase (1 U/μL, fornecida no kit PLA) a 1x tampão de ligadura preparado na etapa anterior na diluição de 1:40 e misturar.
      3. Retirar 1x tampão de lavagem A das lamínulas (do passo 1.3.4) utilizando um sistema de vácuo, adicionar 40 μL de solução de ligase às lamínulas e incubar durante 30 minutos a 37 °C numa câmara de humidade protegida da luz.
   6. Lave as lamínulas 2x por 2 min em 100 μL de 1x tampão de lavagem A à temperatura ambiente usando o sistema de vácuo.
   7. Polimerização
      1. Diluir o tampão de amplificação 1:5 de 5x em água ultrapura e misturar. Para cada lamínula, preparar (pelo menos) 40 μL de solução de amplificação (8 μL de tampão de amplificação 5x, 31,5 μL de água ultrapura).
      2. Adicione a polimerase (10 U/μL, fornecida no kit PLA) ao tampão de polimerização 1x preparado na etapa anterior na diluição de 1:80 e misture.
      3. Retirar 1x tampão de lavagem A das lamínulas (do passo 1.3.6) utilizando um sistema de vácuo, adicionar 40 μL de solução de polimerase às lamínulas e incubar durante 1 h 40 min a 37 °C numa câmara de humidade protegida da luz.
   8. Remova a solução de polimerase das lamínulas e lave 2x por 10 min em 100 μL de 1x tampão de lavagem B à temperatura ambiente em uma câmara de umidade protegida da luz.
   9. Lave as lamínulas 1x por 1 min em 100 μL de 0,001x tampão de lavagem B à temperatura ambiente em uma câmara de umidade protegida da luz.
   10. Monte as lamínulas em lâminas de vidro para microscopia usando meio de montagem com DAPI (concentração entre 1,6-0,4 μg/mL). Selo com esmalte.

2. Aquisição de imagens

1. Observe os resultados do PLA e adquira imagens usando microscopia confocal de fluorescência com objetiva de imersão em óleo de 63x usando o software que o acompanha.
2. Ajuste a excitação de fluorescência usando um diodo laser de 405 nm ou um laser de luz branca e colete as janelas espectrais com PMTs GaAsP ou detectores híbridos. Em cada plano focal (abrangendo 300 nm), adquira os sinais de fluorescência para PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) e mitocôndrias (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Processamento de imagens e avaliação de manchas de PLA associadas a mitocôndrias

1. Processar as imagens confocais utilizando um software para análise de imagens que gera mapas de distância entre os componentes celulares. Siga os passos abaixo para gerar reconstituições 3D de pontos de PLA e da rede mitocondrial e acessar a distância entre eles usando um software de imagem celular (Figura 1).
2. Instalação da extensão do mapa de distância 3D
   1. Instale o pacote de software de análise de células com a opção XT e o software MATLAB ou apenas um tempo de execução do compilador MATLAB (MRC), que pode ser baixado gratuitamente do site.
   2. Configure o software de análise de células para iniciar o MATLAB quando um XTension for iniciado da seguinte maneira: na opção Imaris (Mac OS X) ou no menu Editar (Windows), selecione Preferências, mude para o painel Ferramentas personalizadas e defina o caminho:
      C:\Arquivos de Programas\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe para Windows ou/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab para Mac OS X.
3. Importar as imagens para o software
   1. Converter as imagens de pilha confocal em um arquivo . IMS, diretamente através da seção Arena ou usando o conversor de arquivos autônomo que permite a conversão em lote.
   2. Após a importação, verifique se as imagens permanecem devidamente calibradas. Clique em Editar > Propriedades da Imagem > Geometria da Imagem e verifique se o tamanho do voxel corresponde em X e Y ao tamanho do pixel esperado para a imagem real (veja calibração da imagem no software de aquisição) e se o tamanho do voxel em Z corresponde ao passo aplicado pelo microscópio para gerar a pilha Z. Se os valores não estiverem corretos, modifique-os para garantir uma estimativa correta das distâncias nas etapas a seguir.
   3. Ajuste o contraste dos diferentes canais no menu Ajuste de exibição clicando em Editar > Mostrar ajuste de exibição. Ajuste cada canal independentemente para otimizar a exibição de cada cor. Esta etapa não afeta diretamente os valores da imagem, mas é essencial para definir limites precisos ou detectar objetos fracos.
   4. Limite a análise a uma única célula cortando a imagem usando as opções Editar > Cortar 3D. Para analisar outra célula no mesmo campo de visão, abra a mesma imagem mais uma vez e corte-a de forma diferente.
4. Detecção de pontos ORP5-ORP8
   1. Detecte os sinais PLA gerados no local da interação ORP5 e ORP8 clicando na opção Adicionar novos pontos, que cria um novo conjunto de objetos e abre o assistente de detecção de pontos.
   2. Selecione o canal no qual a detecção de ponto deve ser executada.
   3. Ajuste o Diâmetro XY Estimado (o intervalo deve ser adaptado se o tamanho do objeto for diferente) para ajudar o algoritmo de detecção de ponto a encontrar os objetos de interesse. Observe que, se o valor escolhido for muito alto, os objetos próximos se fundirão. Se o valor for muito pequeno, um sinal pode ser considerado como vários objetos, ou sinais aberrantes podem ser detectados.
   4. Clique em Subtração de plano de fundo para remover o plano de fundo da imagem antes da detecção de pontos para melhorar o contraste local ao redor dos objetos de interesse.
   5. Ajuste o limite de detecção de ponto mantendo a qualidade (intensidade no centro do objeto) como o parâmetro de limite e o limite automático do software, ou modifique ligeiramente esse valor para detectar todos os objetos. Quando a detecção de ponto estiver concluída, salve os parâmetros de detecção e reutilize-os para processar outras imagens.
5. Detecção de redes mitocondriais
   1. Detecte a rede mitocondrial para gerar uma renderização de superfície clicando em Adicionar novas superfícies para criar um novo objeto e abra o assistente de detecção de superfície.
   2. Selecione o canal no qual a criação da superfície deve ser executada.
   3. Aplique um filtro gaussiano para obter uma superfície mais lisa clicando na caixa de seleção Liso e definindo um limite indicando os menores detalhes observáveis na superfície.
   4. Execute uma subtração em segundo plano para melhorar os contrastes locais e ajudar na etapa de limite.
   5. Ajuste o limiar para detectar a rede mitocondrial com base na intensidade do sinal. Se for difícil definir corretamente o limite, recomenda-se voltar à etapa anterior para ajustar o grau de suavidade e subtração de fundo.
   6. Se necessário, aplique um filtro na superfície para remover pequenos resíduos resultantes do limiar. Para fazer isso, selecione o filtro Número de Voxels na janela classificar superfície e jogue com os limites superior e inferior para manter apenas os objetos de interesse. Quando a criação da superfície terminar, salve os parâmetros de criação e reutilize-os para processar outras imagens.
6. Geração do mapa de distância 3D em torno das mitocôndrias
   1. Gere um mapa de distância fora da superfície mitocondrial previamente criado da seguinte forma. Selecione a superfície das mitocôndrias na caixa da árvore de cena. Clique em Processamento de imagem > função de superfícies > transformação de distância. Isso chamará um Matlab XTension que pede ao usuário para escolher se o mapa deve ser computado fora ou dentro da superfície do objeto.
   2. Selecione Objeto de superfície externa para medir a distância entre os pontos de PLA e a superfície da mitocôndria. Uma vez gerado, o mapa de distância aparece como um novo canal no painel de ajuste de exibição. Neste canal, cada pixel tem um valor correspondente à distância à mitocôndria mais próxima.
7. Extração das distâncias dos objetos da mitocôndria mais próxima
   1. Para medir a distância de cada ponto até as mitocôndrias mais próximas e identificar e visualizar as mais próximas, selecione os pontos gerados anteriormente na caixa da árvore de cena.
   2. Nas estatísticas e no log detalhado, selecione Valores Específicos (para obter uma medida para cada ponto). Selecione Center Intensity Ch=X (com X correspondente ao número do canal do mapa de distância). Isso medirá o valor de cada centro do ponto, que corresponde à sua distância até a mitocôndria mais próxima, no mapa de distância.
   3. Exporte os dados como um arquivo .csv clicando no ícone Disquete no canto inferior esquerdo da janela.
   4. Para extrair uma subpopulação de manchas com base em suas distâncias para as mitocôndrias, selecione os pontos na árvore de cenas e clique na guia Filtros .
   5. Nesta janela, adicione um novo filtro baseado mais uma vez no Centro de Intensidade Ch=X e extraia os pontos a menos de 380 nm de distância das mitocôndrias, definindo o limiar inferior para 0 μm e o limite superior para 0,380 μm.
      NOTA: O limiar de 380 nm foi estimado com base em uma reação de PLA incluindo a associação entre os anticorpos primários e secundários (30 nm) mais metade da largura total na metade máxima (FWHM) dos sinais de amplificação de PLA (350 nm).
   6. Para se concentrar nos pontos selecionados e, por exemplo, dar-lhes uma cor distinta, execute uma etapa de duplicação pressionando o botão Duplicar seleção para novos pontos .

Resultados

Usando o protocolo descrito acima, detectamos os locais de interação de duas proteínas de transferência lipídica ancoradas em RE, ORP5 e ORP8, e avaliamos sua ocorrência em subdomínios da membrana de RE em contato com outras organelas, em particular, com as mitocôndrias. Para tanto, a rede mitocondrial em células HeLa foi corada com marcador mitocondrial vermelho, e manchas verdes de PLA ORP5-ORP8 foram detectadas após fixação com os anticorpos primários anti-ORP5 e anti-ORP8, cuja especificidade foi previam...

Discussão

Este protocolo foi projetado para identificar e quantificar interações inter-organelas de proteínas PLA em MCSs, em particular em MERCSs. A novidade do protocolo é que ele combina PLA com a marcação de múltiplas organelas, microscopia confocal e análise de imagens 3D para localizar e quantificar interações de PLA entre duas proteínas residentes na mesma membrana, neste caso dentro da membrana de RE em estreita proximidade com a membrana da mitocôndria (MAM) ou com o MAM e LDs simultaneamente. Este protocolo p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)	Gibco	14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)	VWR	21236.291
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos red MitoTracker	Invitrogen	M7512	red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates	Merck	CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	51985026	serum free medium
Imaris software v 9.3	Bitplane	N/A	cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10	VWR	390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)	Knittel Glass
mouse anti-ORP8	Santa Cruz	134409
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
rabbit anti-ORP5	Sigma	HAP038712
Saponin	Sigma	84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free	Invitrogen	10977-035