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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Der Bedarf an neuen Ansätzen zur Untersuchung von Membrankontaktstellen (MCS) ist aufgrund des zunehmenden Interesses an der Untersuchung dieser zellulären Strukturen und ihrer Komponenten gestiegen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das bisher verfügbare Mikroskopietechnologien integriert, um intra- und interorganelle Proteinkomplexe, die sich an MCS befinden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Membrankontaktstellen (MCS) sind Bereiche mit enger Membrannähe, die den dynamischen Austausch verschiedener Biomoleküle (d. h. Kalzium und Lipide) zwischen den nebeneinander liegenden Organellen ermöglichen und regulieren, ohne dass eine Membranfusion erforderlich ist. MCS sind essentiell für die zelluläre Homöostase, und ihre Funktionen werden durch die residenten Komponenten sichergestellt, die oft als multimere Proteinkomplexe vorliegen. MCS betreffen häufig das endoplasmatische Retikulum (ER), einen wichtigen Ort der Lipidsynthese und der zellulären Kalziumspeicherung, und sind besonders wichtig für Organellen wie die Mitochondrien, die von den klassischen vesikulären Transportwegen ausgeschlossen sind. In den letzten Jahren wurden MCS zwischen dem ER und den Mitochondrien ausgiebig untersucht, da ihre Funktionen den zellulären Stoffwechsel/die Bioenergetik stark beeinflussen. An diesen Kontaktstellen wurden mehrere Proteine identifiziert, darunter Membrankabel, Kalziumkanäle und Lipidtransferproteine, was den Bedarf an neuen Methoden und technischen Ansätzen zur Untersuchung dieser MCS-Komponenten erhöht. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das aus kombinierten technischen Ansätzen besteht, die Proximity-Ligations-Assay (PLA), Mitochondrien-Färbung und 3D-Imaging-Segmentierung umfassen, die den Nachweis von Proteinen ermöglicht, die physikalisch nahe beieinander (>40 nm) sind und sich auf derselben Membran an ER-Mitochondrien-MCS befinden. Zum Beispiel haben wir zwei ER-verankerte Lipidtransferproteine, ORP5 und ORP8, verwendet, von denen bereits gezeigt wurde, dass sie an ER-Mitochondrien und ER-Plasmamembran-MCS interagieren und lokalisieren. Durch die Assoziation des ORP5-ORP8 PLA mit der Analyse der Zellbildgebungssoftware war es möglich, den Abstand des ORP5-ORP8-Komplexes von der mitochondrialen Oberfläche abzuschätzen und festzustellen, dass etwa 50% der ORP5-ORP8 PLA-Interaktion an ER-Subdomänen in unmittelbarer Nähe der Mitochondrien stattfindet.

Einleitung

Die Kommunikation zwischen den Organellen ist ein wesentliches Merkmal eukaryotischer Zellen. Eine Art und Weise, wie Organellen kommunizieren, ist die Bildung von Membrankontaktstellen (MCSs), bei denen es sich um enge Membranoppositionen zwischen zwei Organellen handelt, die durch strukturelle und funktionelle Proteine wie Haltegurte, Lipidtransferproteine und Kalziumkanäle aufrechterhalten werden1. MCS können zwischen ähnlichen oder unterschiedlichen Organellen etabliert werden und vermitteln den Austausch zellulärer Komponenten, was für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase wichtig ist. Bisher wurden mehrere MCS identifiziert, darunter endoplasmatische Retikula (ER)-Mitochondrien, ER-Plasmamembran (PM) und ER-Lipidtröpfchen (LD)-Kontakte1. Unter ihnen gehören diejenigen, die zwischen dem ER und den Mitochondrien (MERCS) gebildet werden, zu den am besten untersuchten, da sie an der Regulierung mehrerer zellulärer Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Lipid- und Kalziumhomöostase2. Da Mitochondrien von den klassischen vesikulären Transportwegen weitgehend ausgeschlossen sind, sind sie auf MERCS und ihre molekularen Bestandteile angewiesen, um Schlüssellipide oder Lipidvorläufer aus dem ER zu importieren. Der nicht-vesikuläre Transport dieser Lipide durch MERCS gewährleistet die Aufrechterhaltung der korrekten Zusammensetzung der mitochondrialen Lipide sowie ihrer funktionellen und strukturellen Integrität3.

Angesichts der entscheidenden Beteiligung von MCS an verschiedenen zellulären Funktionen hat das Interesse an einem tieferen Verständnis ihrer molekularen Bestandteile in den letzten Jahren stark zugenommen. Verschiedene Arten von bildgebenden Ansätzen wurden verwendet, um das Wissen über MCS zu erweitern. Unter ihnen wurde der Fluoreszenzsonden-basierte Proximity-Ligation-Assay (PLA) häufig als Indikator für die Häufigkeit von MCS verwendet, indem er interorganelle Protein-Protein-Wechselwirkungen (in einem Nachweisbereich von 40 nm) auf endogenen Ebenen nachweist4. Zum Beispiel wurden MERCS visualisiert und quantifiziert, indem PLA zwischen mehreren Mitochondrien-ER-Proteinpaaren verwendet wurde, darunter VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 und PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Obwohl diese Technologie verwendet wurde, um interorganelle Protein-Protein-Wechselwirkungen zu erkennen und zu quantifizieren, die am MCSvorhanden sind 5,7,9,10,11, kombinierten die meisten Studien PLA nicht mit Organellenfärbung. Folglich wurde noch keine quantitative Methode entwickelt, die es ermöglicht, die Nähe zwischen PLA-Wechselwirkungen und assoziierten Organellen zu messen. Bisher wurde daher im Falle von ER-Proteinen ihre Interaktion innerhalb von Membransubdomänen in Kontakt mit anderen Organellen nicht von ihrer Interaktion innerhalb des weit verteilten ER-Netzwerks unterschieden.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis von PLA-Wechselwirkungen zwischen Proteinen, die sich in der Membran derselben Organelle befinden, und um ihre Nähe zur Membran der Partnerorganelle am MCS zu analysieren. Dieses Protokoll wurde auf der Grundlage von zwei Prämissen entwickelt: 1) frühere Studien, die zeigen, dass unter Überexpressionsbedingungen die ER-Lipidtransferproteine ORP5 und ORP8 an ER-Mitochondrien und ER-PM MCS 12,13,14,15 kolokalisieren und interagieren und dass ORP5 an ER-LD-Kontakten lokalisiert16,17; 2) bestehende Technologien, einschließlich PLA, konfokale Mikroskopie, Organellenmarkierung und 3D-Bildgebungsanalyse.

Protokoll

1. Mitochondriale Färbung und Proximity-Ligations-Assay (PLA)

  1. Platte 0,5 x 10 5-2 x 105 HeLa-Zellen, aufbewahrt in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren bei 37 °C mit 5 % CO2, in 13-mm-Glasdeckgläsern in 1,5-in-24-Well-Platten in einer Verdünnung, die am Tag des Eingriffs eine Zellkonfluenz von 75 % bis 90 % ermöglicht.
    HINWEIS: Zu beachten ist, dass HeLa-Zellen vor der mitochondrialen Färbung und PLA zusätzlichen Behandlungen unterzogen werden können, wie z. B. einer siRNA-Behandlung und/oder einer DNA-Plasmidtransfektion.
  2. Mitochondriale Färbung
    1. Waschen Sie die Zellen einmal in einem serumfreien, bei 37 °C vorgewärmten Medium. Die Zellen werden mit vorgewärmtem serumfreiem Medium für 10 min bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubiert.
    2. Bereiten Sie 1 μM roten mitochondrialen Marker in einem vorgewärmten serumfreien Medium vor.
    3. Die Zellen werden mit 500 μl mitochondrialer Markerlösung für 30 min bei 37 °C mit 5 %CO2 inkubiert. Bewahren Sie die Zellen während der Behandlung mit mitochondrialen Markern und den folgenden Schritten des Protokolls so gut wie möglich auf Deckgläsern vor Licht geschützt auf.
    4. Nach der Inkubation waschen Sie die Zellen 1x in vorgewärmtem serumfreiem Medium und 2x in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Führen Sie diesen Schritt so schnell wie möglich durch, da lange Waschschritte vor der Fixierung die mitochondriale Morphologie beeinträchtigen können.
    5. Entfernen Sie das 1x PBS aus den Deckgläsern und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in frisch zubereitetem 4% PFA (in 1x PBS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur (im Dunkeln) unter der chemischen Haube inkubieren. 3x für 2 min in 500 μl 1x PBS waschen (mit Einwegpipetten oder einem an eine Pumpe angeschlossenen Vakuumsystem).
    6. Entfernen Sie das 1x PBS und inkubieren Sie die Deckgläser mit 500 μl 50 mM NH4Cl für 15 Minuten bei Raumtemperatur (im Dunkeln). 1x 2 min in 500 μl 1x PSB mit einem Vakuumsystem waschen.
    7. 3x für 2 min in 500 μl Blockierungspuffer 1 (BB1, 1 % BSA, 0,1 % Saponin in 1x PBS) für das ORP5-ORP8 PLA oder Blockierungspuffer 2 (BB2, 2 % BSA, 0,1 % normales Ziegenserum, 0,1 Saponin in 1x PBS) für das ORP8-PTPIP51 PLA waschen.
    8. Übertragen Sie die Deckgläser von der 24-Well-Platte in eine Feuchtigkeitskammer. Nachdem Sie die Deckgläser in die Kammer gegeben haben, fügen Sie 100 μl BB (BB1 oder BB2, je nach verwendetem Antikörperpaar) hinzu, um Trockenheit zu vermeiden.
      HINWEIS: Eine lichtgeschützte Feuchtigkeitskammer kann einfach und schnell erreicht werden, indem eine Petrischale (Kunststoff oder Glas) in Aluminiumfolie eingewickelt und einige Stücke nasses Papiertuch in den Rand der Petrischale gelegt werden.
  3. Proximity-Ligations-Assay (PLA)
    HINWEIS: Das PLA-Protokoll folgt den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen.
    1. Inkubation von Primärantikörpern
      1. Bereiten Sie die primäre Antikörper-Arbeitslösung vor. Verdünnung von Kaninchen-Anti-ORP5 (1:150) plus Maus-Anti-ORP8 (1:200) in BB1, Maus-Anti-ORP8 (1:200) plus Kaninchen-Anti-PTPIP51 (1:200) in BB2 und Kaninchen-Anti-ORP5 (1:150) plus Maus-Anti-PTPIP51 (1:200) in BB1. Bereiten Sie (mindestens) 40 μl Primärantikörperlösung pro Deckglas vor (z. B. 0,27 μl Kaninchen-Anti-ORP5, 0,2 μl Maus-Anti-ORP8, 39,53 μl BB1).
      2. Entfernen Sie das BB aus der vorherigen Wäsche (Schritt 1.2.8) mit einem Vakuumsystem und geben Sie 40 μl Primärantikörperlösung in die Deckgläser. 1 Stunde bei Raumtemperatur in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
    2. Deckgläser 3x für 5 min mit 100 μL des entsprechenden BB im Vakuumsystem waschen.
    3. Inkubation der PLA-Sonde
      1. Bereiten Sie die Arbeitslösung der PLA-Sonden vor. Kaninchen PLUS (1:5) und Maus MINUS (1:5) PLA-Sonden in BB verdünnen und mischen. Bereiten Sie für jedes Deckglas (mindestens) 40 μl PLA-Sondenlösung vor (z. B. 8 μl Kaninchen-PLUS-PLA-Sonde, 8 μl Maus-MINUS-PLA-Sonde, 24 μl BB). Lassen Sie die PLA-Sondenlösung vor Gebrauch 20 Minuten bei Raumtemperatur einwirken.
      2. Entfernen Sie das BB mit einem Vakuumsystem aus den Deckgläsern (aus Schritt 1.3.2) und geben Sie 40 μl PLA-Sondenlösung in die Deckgläser. 1 Stunde bei 37°C in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
    4. Waschen Sie die Deckgläser 2x für 5 min in 100 μl 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur.
    5. Gebundenheit
      1. 5x Ligationspuffer auf 1:5 in Reinstwasser verdünnen und mischen. Bereiten Sie für jedes Deckglas (mindestens) 40 μl Ligationslösung vor (8 μl 5x Ligationspuffer, 31 μl Reinstwasser).
      2. Geben Sie die Ligase (1 U/μl, im PLA-Kit enthalten) zu 1x Ligationspuffer, der im vorherigen Schritt in einer Verdünnung von 1:40 hergestellt wurde, und mischen Sie.
      3. 1x Waschpuffer A aus den Deckgläsern (aus Schritt 1.3.4) mit einem Vakuumsystem entfernen, 40 μl Ligaselösung in die Deckgläser geben und 30 min bei 37 °C in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
    6. Waschen Sie die Deckgläser 2x für 2 min in 100 μl 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur mit dem Vakuumsystem.
    7. Polymerisation
      1. 5x Amplifikationspuffer 1:5 in Reinstwasser verdünnen und mischen. Bereiten Sie für jedes Deckglas (mindestens) 40 μl Amplifikationslösung vor (8 μl 5-facher Amplifikationspuffer, 31,5 μl Reinstwasser).
      2. Die Polymerase (10 U/μl, im PLA-Kit enthalten) zu dem im vorherigen Schritt hergestellten 1-fachen Polymerisationspuffer in einer Verdünnung von 1:80 zugeben und mischen.
      3. 1x Waschpuffer A aus den Deckgläsern (aus Schritt 1.3.6) mit einem Vakuumsystem entfernen, 40 μl Polymeraselösung in die Deckgläser geben und 1 h 40 min bei 37 °C in einer lichtgeschützten Feuchtekammer inkubieren.
    8. Die Polymeraselösung aus den Deckgläsern entfernen und 2 x für 10 Minuten in 100 μl 1x Waschpuffer B bei Raumtemperatur in einer lichtgeschützten Feuchtigkeitskammer waschen.
    9. Waschen Sie die Deckgläser 1x für 1 min in 100 μl von 0,001x Waschpuffer B bei Raumtemperatur in einer lichtgeschützten Feuchtigkeitskammer.
    10. Montieren Sie die Deckgläser auf Objektträger für die Mikroskopie mit Eindeckmedium mit DAPI (Konzentration zwischen 1,6-0,4 μg/ml). Mit Nagellack versiegeln.

2. Bildaufnahme

  1. Beobachten Sie die PLA-Ergebnisse und nehmen Sie Bilder mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie mit einem 63-fachen Ölimmersionsobjektiv mit der mitgelieferten Software auf.
  2. Stellen Sie die Fluoreszenzanregung mit einer 405-nm-Laserdiode oder einem Weißlichtlaser ein und erfassen Sie die Spektralfenster mit GaAsP-PMTs oder Hybriddetektoren. In jeder Brennebene (über 300 nm) werden die Fluoreszenzsignale für PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) und Mitochondrien (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm) erfasst.

3. Bildverarbeitung und Beurteilung von PLA-Flecken, die mit Mitochondrien assoziiert sind

  1. Verarbeiten Sie die konfokalen Bilder mit einer Software zur Bildanalyse, die Abstandskarten zwischen den zellulären Komponenten erstellt. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um 3D-Rekonstitutionen von PLA-Flecken und dem mitochondrialen Netzwerk zu erstellen und den Abstand zwischen ihnen mithilfe einer Zellbildgebungssoftware zu ermitteln (Abbildung 1).
  2. Installation der 3D-Entfernungskartenerweiterung
    1. Installieren Sie sowohl das Zellanalyse-Softwarepaket mit der XT-Option als auch die MATLAB-Software oder nur eine MATLAB-Compiler-Runtime (MRC), die kostenlos von der Website heruntergeladen werden kann.
    2. Richten Sie die Zellanalysesoftware so ein, dass MATLAB gestartet wird, wenn eine XTension gestartet wird, und zwar wie folgt: Wählen Sie in der Option Imaris (Mac OS X) bzw. im Menü " Bearbeiten " (Windows) die Option "Voreinstellungen", wechseln Sie zum Bedienfeld " Benutzerdefinierte Werkzeuge" und legen Sie dann den Pfad fest:
      C:\Programme\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe für Windows oder/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab für Mac OS X.
  3. Importieren Sie die Bilder in die Software
    1. Konvertieren Sie die konfokalen Stapelbilder in eine . IMS-Datei, entweder direkt über den Arena-Bereich oder mit dem eigenständigen Dateikonverter , der eine Batch-Konvertierung ermöglicht.
    2. Überprüfen Sie nach dem Import, ob die Bilder richtig kalibriert bleiben. Klicken Sie auf > Bildeigenschaften > Bildgeometrie bearbeiten und überprüfen Sie, ob die Voxelgröße in X und Y der für das eigentliche Bild erwarteten Pixelgröße entspricht (siehe Bildkalibrierung in der Erfassungssoftware) und ob die Voxelgröße in Z dem Schritt entspricht, den das Mikroskop zur Erzeugung des Z-Stapels anwendet. Wenn die Werte nicht korrekt sind, ändern Sie sie, um eine korrekte Schätzung der Entfernungen in den folgenden Schritten sicherzustellen.
    3. Passen Sie den Kontrast der verschiedenen Kanäle im Menü Display-Anpassung an, indem Sie auf Bearbeiten > Display-Justage anzeigen klicken. Passen Sie jeden Kanal unabhängig voneinander an, um die Anzeige der einzelnen Farben zu optimieren. Dieser Schritt wirkt sich nicht direkt auf die Bildwerte aus, ist aber unerlässlich, um präzise Schwellenwerte festzulegen oder schwache Objekte zu erkennen.
    4. Beschränken Sie die Analyse auf eine einzelne Zelle, indem Sie das Bild mit den Optionen Bearbeiten > 3D zuschneiden zuschneiden. Um eine andere Zelle im selben Sichtfeld zu analysieren, öffnen Sie dasselbe Bild erneut und schneiden Sie es anders zu.
  4. ORP5-ORP8 Spot-Detektion
    1. Erkennen Sie die PLA-Signale, die an der Stelle der ORP5- und ORP8-Interaktion erzeugt werden, indem Sie auf die Option Neue Spots hinzufügen klicken , wodurch ein neuer Satz von Objekten erstellt und der Spot-Erkennungsassistent geöffnet wird.
    2. Wählen Sie den Kanal aus, auf dem die Spot-Erkennung durchgeführt werden soll.
    3. Passen Sie den geschätzten XY-Durchmesser an (der Bereich muss angepasst werden, wenn die Objektgröße abweicht), damit der Spot-Erkennungsalgorithmus die gewünschten Objekte finden kann. Beachten Sie, dass bei einem zu hohen Wert die Objekte in der Nähe verschmelzen. Wenn der Wert zu klein ist, kann ein Signal als mehrere Objekte betrachtet werden, oder es können abweichende Signale erkannt werden.
    4. Klicken Sie auf Hintergrundsubtraktion , um den Bildhintergrund vor der Spot-Erkennung zu entfernen und den lokalen Kontrast um die interessierenden Objekte zu verstärken.
    5. Passen Sie den Schwellenwert für die Spot-Erkennung an, indem Sie die Qualität (Intensität in der Objektmitte) als Schwellenwertparameter und den automatischen Schwellenwert der Software beibehalten, oder ändern Sie diesen Wert geringfügig, um alle Objekte zu erkennen. Sobald die Spot-Erkennung abgeschlossen ist, speichern Sie die Erkennungsparameter und verwenden Sie sie wieder, um andere Bilder zu verarbeiten.
  5. Detektion mitochondrialer Netzwerke
    1. Erkennen Sie das mitochondriale Netzwerk, um ein Oberflächen-Rendering zu generieren, indem Sie auf Neue Oberflächen hinzufügen klicken, um ein neues Objekt zu erstellen, und öffnen Sie den Oberflächenerkennungsassistenten.
    2. Wählen Sie den Kanal aus, auf dem die Flächenerstellung durchgeführt werden soll.
    3. Wenden Sie einen Gauß-Filter an, um eine glattere Oberfläche zu erhalten, indem Sie auf das Markierungsfeld " Glätten" klicken und einen Schwellenwert festlegen, der die kleinsten auf der Oberfläche beobachtbaren Details angibt.
    4. Führen Sie eine Hintergrundsubtraktion durch, um die lokalen Kontraste zu verstärken und den Schwellenwertschritt zu unterstützen.
    5. Passen Sie den Schwellenwert an, um das mitochondriale Netzwerk basierend auf der Intensität des Signals zu erkennen. Wenn es schwierig ist, den Schwellenwert richtig einzustellen, wird empfohlen, zum vorherigen Schritt zurückzukehren, um den Grad der Glätte und der Hintergrundsubtraktion anzupassen.
    6. Wenden Sie bei Bedarf einen Filter auf die Oberfläche an, um kleine Rückstände zu entfernen, die sich aus dem Schwellenwert ergeben. Wählen Sie dazu den Filter Anzahl der Voxel im Fenster Oberfläche klassifizieren aus, und spielen Sie mit den oberen und unteren Schwellenwerten, um nur die Objekte von Interesse beizubehalten. Sobald die Oberflächenerstellung abgeschlossen ist, speichern Sie die Erstellungsparameter, und verwenden Sie sie wieder, um andere Bilder zu verarbeiten.
  6. Generierung der 3D-Entfernungskarte um die Mitochondrien
    1. Generieren Sie eine Entfernungskarte außerhalb der mitochondrialen Oberfläche, die Sie zuvor wie folgt erstellt haben. Wählen Sie die Mitochondrienoberfläche im Szenenbaumfeld aus. Klicken Sie auf Bildverarbeitung > Oberflächenfunktion > Abstandstransformation. Dadurch wird eine Matlab XTension aufgerufen, die den Benutzer auffordert, auszuwählen, ob die Karte außerhalb oder innerhalb der Objektoberfläche berechnet werden soll.
    2. Wählen Sie Objekt außerhalb der Oberfläche, um den Abstand zwischen den PLA-Flecken und der Oberfläche der Mitochondrien zu messen. Nach der Generierung wird die Entfernungskarte als neuer Kanal im Anzeigeanpassungsfenster angezeigt. In diesem Kanal hat jedes Pixel einen Wert, der dem Abstand zu den nächstgelegenen Mitochondrien entspricht.
  7. Extraktion der Entfernungen der Objekte vom nächstgelegenen Mitochondrium
    1. Um die Entfernung von jedem Punkt zum nächstgelegenen Mitochondrium zu messen und die nächstgelegenen Mitochondrien zu identifizieren und zu visualisieren, wählen Sie die zuvor generierten Punkte in der Szenenbaumbox aus.
    2. Wählen Sie in den Statistiken und im detaillierten Protokoll die Option Spezifische Werte aus (um eine Messung für jeden Spot zu erhalten). Wählen Sie Mittenintensität Ch=X (wobei X der Nummer des Entfernungs-Map-Kanals entspricht). Dadurch wird der Wert jedes Punktmittelpunkts gemessen, der seiner Entfernung zum nächstgelegenen Mitochondrium in der Entfernungskarte entspricht.
    3. Exportieren Sie die Daten als .csv-Datei, indem Sie auf das Diskettensymbol unten links im Fenster klicken.
    4. Um eine Subpopulation von Flecken basierend auf ihrer Entfernung zu den Mitochondrien zu extrahieren, wählen Sie die Flecken im Szenenbaum aus und klicken Sie auf die Registerkarte Filter.
    5. Fügen Sie in diesem Fenster einen neuen Filter hinzu, der wiederum auf der Zentrumsintensität Ch=X basiert, und extrahieren Sie die Flecken, die weniger als 380 nm von den Mitochondrien entfernt sind, indem Sie den unteren Schwellenwert auf 0 μm und den oberen Schwellenwert auf 0,380 μm setzen.
      HINWEIS: Der Schwellenwert von 380 nm wurde auf der Grundlage einer PLA-Reaktion geschätzt, die die Assoziation zwischen den primären und sekundären Antikörpern (30 nm) plus die Hälfte der vollen Breite bei halbem Maximum (FWHM) der PLA-Amplifikationssignale (350 nm) umfasst.
    6. Um sich auf die ausgewählten Spots zu konzentrieren und ihnen z. B. eine bestimmte Farbe zu geben, führen Sie einen Duplizierungsschritt durch, indem Sie auf die Schaltfläche "Auswahl auf neue Spots duplizieren " klicken.

Ergebnisse

Mit Hilfe des oben beschriebenen Protokolls detektierten wir die Interaktionsstellen von zwei ER-verankerten Lipidtransferproteinen, ORP5 und ORP8, und untersuchten ihr Vorkommen an ER-Membran-Subdomänen in Kontakt mit anderen Organellen, insbesondere mit den Mitochondrien. Dazu wurde das mitochondriale Netzwerk in HeLa-Zellen mit einem roten mitochondrialen Marker gefärbt, und ORP5-ORP8 PLA Green Spots wurden nach der Fixierung mit den primären Antikörpern Anti-ORP5 und Anti-ORP8 nachgewiesen, deren Spezifität zuvo...

Diskussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um interorganelle Protein-PLA-Interaktionen an MCSs, insbesondere an MERCS, zu identifizieren und zu quantifizieren. Die Neuheit des Protokolls besteht darin, dass es PLA mit der Markierung mehrerer Organellen, konfokaler Mikroskopie und 3D-Bildanalyse kombiniert, um PLA-Wechselwirkungen zwischen zwei Proteinen zu lokalisieren und zu quantifizieren, die sich in derselben Membran befinden, in diesem Fall innerhalb der ER-Membran in unmittelbarer Nähe der Membran der Mitochondrien (MAM) ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), dem ATIP-Avenir-Programm, der Fondation pour la Recherche Medicale (Nr. 206548) und der Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02/Saclay Plant Sciences).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)Gibco14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)VWR21236.291
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos red MitoTrackerInvitrogenM7512red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well PlatesMerckCLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green SigmaDUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI SigmaDUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS SigmaDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigmaDUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Gibco51985026serum free medium
Imaris software v 9.3BitplaneN/Acell imaging software
Incubator UINCU-line IL10VWR390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) Knittel Glass
mouse anti-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
rabbit anti-ORP5 SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase freeInvitrogen10977-035

Referenzen

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