ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Özet

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Özet

Membran temas bölgeleri (MCS'ler), membran füzyonunu içermeden yan yana getirilmiş organeller arasında çeşitli biyomoleküllerin (yani kalsiyum ve lipitler) dinamik değişimine izin veren ve düzenleyen yakın membran yakınlığı alanlarıdır. MCS'ler hücresel homeostaz için gereklidir ve işlevleri, genellikle multimerik protein kompleksleri olarak bulunan yerleşik bileşenler tarafından sağlanır. MCS'ler genellikle lipid sentezi ve hücresel kalsiyum depolamanın önemli bir bölgesi olan endoplazmik retikulumu (ER) içerir ve klasik veziküler taşıma yollarından dışlanan mitokondri gibi organeller için özellikle önemlidir. Son yıllarda, ER ve mitokondri arasındaki MCS'ler, işlevleri hücresel metabolizmayı/biyoenerjetik değerleri güçlü bir şekilde etkilediği için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu temas bölgelerinde membran bağları, kalsiyum kanalları ve lipid transfer proteinleri dahil olmak üzere çeşitli proteinler tanımlanmaya başlanmıştır, bu nedenle bu MCS bileşenlerini incelemek için yeni metodolojilere ve teknik yaklaşımlara olan ihtiyacı artırmaktadır. Burada, birbirine fiziksel olarak yakın (>40 nm) olan ve ER-mitokondri MCS'lerinde aynı zarda bulunan proteinlerin saptanmasına izin veren, yakınlık ligasyon testi (PLA), mitokondri boyama ve 3D görüntüleme segmentasyonunu içeren birleşik teknik yaklaşımlardan oluşan bir protokolü açıklıyoruz. Örneğin, daha önce ER-mitokondri ve ER-plazma membranı MCS'lerinde etkileşime girdiği ve lokalize olduğu gösterilen iki ER'ye bağlı lipid transfer proteini, ORP5 ve ORP8 kullandık. ORP5-ORP8 PLA'yı hücre görüntüleme yazılımı analizi ile ilişkilendirerek, ORP5-ORP8 kompleksinin mitokondriyal yüzeyden uzaklığını tahmin etmek ve ORP5-ORP8 PLA etkileşiminin yaklaşık% 50'sinin mitokondriye yakın ER alt alanlarında meydana geldiğini belirlemek mümkün olmuştur.

Giriş

Organeller arası iletişim, ökaryotik hücrelerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Organellerin iletişim kurmasının bir yolu, bağlar, lipid transfer proteinleri ve kalsiyum kanalları gibi yapısal ve fonksiyonel proteinler tarafından korunan iki organel arasındaki yakın zar karşıtlıkları olan zar temas bölgeleri (MCS'ler) oluşturmaktır¹. MCS'ler benzer veya farklı organeller arasında kurulabilir ve hücresel homeostazı korumak için önemli olan hücresel bileşenlerin değişimine aracılık ederler. Bugüne kadar, endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri, ER-plazma membranı (PM) ve ER-lipid damlacık (LD) kontakları¹ dahil olmak üzere çeşitli MCS tanımlanmıştır. Bunlar arasında, ER ve mitokondri (MERCS'ler) arasında oluşanlar, lipid ve kalsiyum homeostazı² dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynadıkları için en çok çalışılanlar arasındadır. Mitokondri, klasik veziküler taşıma yollarından büyük ölçüde dışlandığından, ER'den anahtar lipitleri veya lipid öncüllerini ithal etmek için MERCS'ye ve moleküler bileşenlerine güvenirler. Bu lipitlerin MERCS'ler arasında veziküler olmayan taşınması, uygun mitokondriyal lipid bileşiminin yanı sıra fonksiyonel ve yapısal bütünlüklerinin korunmasını sağlar³.

MCS'lerin çeşitli hücresel fonksiyonlara önemli katılımı göz önüne alındığında, moleküler bileşenlerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına olan ilgi son yıllarda büyük ölçüde artmıştır. MCS'ler hakkındaki bilgileri ilerletmek için çeşitli görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bunlar arasında, floresan prob tabanlı yakınlık ligasyon testi (PLA), endojen seviyelerde^organeller arası protein-protein etkileşimlerini (40 nm'lik bir tespit aralığında) tespit ederek MCS'lerin bolluğunun bir göstergesi olarak yaygın olarak kullanılmıştır 4. Örneğin, MERCS'ler, VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 ve PTPIP51-VAPB 5,6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli mitokondri-ER protein çiftleri arasında PLA kullanılarak görselleştirildi ve ölçüldü. Bu teknoloji, MCS 5,7,9,10,11'de bulunan organeller arası protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılmış olsa da^, çalışmaların çoğu PLA'yı organel boyama ile birleştirmemiştir. Sonuç olarak, PLA etkileşimleri ve ilişkili organeller arasındaki yakınlığın ölçülmesine izin veren nicel bir yöntem henüz geliştirilmemiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, ER proteinleri söz konusu olduğunda, diğer organellerle temas halinde olan zar alt alanları içindeki etkileşimleri, yaygın olarak dağılmış ER ağı içindeki etkileşimlerinden ayırt edilmemiştir.

Burada, aynı organelin zarında bulunan proteinler arasındaki PLA etkileşimlerini tespit etmek ve bunların MCS'deki ortak organelin zarına yakınlığını analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol iki öncül temelinde geliştirilmiştir: 1) aşırı ekspresyon koşullarında, ER lipid transfer proteinleri ORP5 ve ORP8'in ER-mitokondri ve ER-PM MCS'lerde 12,13,14,15 birlikte lokalize olduğunu ve etkileşime girdiğini ve ORP5'in ER-LD temaslarında^{lokalize olduğunu gösteren önceki çalışmalar 16,17}; 2) PLA, konfokal mikroskopi, organel etiketleme ve 3D görüntüleme analizi dahil olmak üzere mevcut teknolojiler.

Protokol

1. Mitokondriyal boyama ve yakınlık ligasyon testi (PLA)

1. Plaka 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa hücreleri, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) %10 FBS, %1 penisilin / streptomisin ve %1 esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 ° C'de% 5 CO₂ ile,% 75 -% 90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede^1.5 içinde 24 oyuklu plakalarda, işlem gününde% 75-90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede.
   NOT: HeLa hücreleri, mitokondriyal boyama ve PLA'dan önce siRNA tedavisi ve/veya DNA plazmit transfeksiyonu gibi ek tedavilere tabi tutulabilir.
2. Mitokondriyal boyama
   1. Hücreleri bir kez 37 °C'de önceden ısıtılmış serumsuz ortamda yıkayın. Hücreleri önceden ısıtılmış serumsuz besiyeri ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 5 CO₂ ile inkübe edin.
   2. Önceden ısıtılmış serumsuz ortamda 1 μM kırmızı mitokondriyal işaretleyici hazırlayın.
   3. Hücreleri 500 μL mitokondriyal marker çözeltisi ile 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 30 dakika inkübe edin. Mitokondriyal belirteç tedavisi ve protokolün sonraki adımları sırasında, hücreleri mümkün olduğunca ışıktan koruyarak lameller üzerinde tutun.
   4. İnkübasyonun ardından, hücreleri önceden ısıtılmış serum serbest ortamda 1x ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın. Fiksasyondan önceki uzun yıkama adımları mitokondriyal morfolojiyi etkileyebileceğinden, bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
   5. 1x PBS'yi lamellerden çıkarın ve hücreleri, kimyasal kaputun altında oda sıcaklığında (karanlıkta) 30 dakika boyunca taze hazırlanmış %4 PFA'da (1x PBS'de) inkübe ederek sabitleyin. 3x'i 500 μL 1x PBS'de 2 dakika yıkayın (tek kullanımlık pipetler veya pompaya bağlı bir vakum sistemi kullanarak).
   6. 1x PBS'yi çıkarın ve lamelleri 500 μL 50mM NH₄Cl ile oda sıcaklığında (karanlıkta) 15 dakika inkübe edin. Bir vakum sistemi kullanarak 500 μL 1x PSB'de 1x'i 2 dakika boyunca yıkayın.
   7. ORP5-ORP8 PLA için 500 μL bloke edici tampon 1'de (BB1, %1 BSA, 1x PBS'de %0.1 saponin) veya ORP8-PTPIP51 PLA için bloke edici tampon 2'de (BB2, %2 BSA, %0.1 normal keçi serumu, 1x PBS'de 0.1 saponin) 3x'i 2 dakika yıkayın.
   8. Lamelleri 24 oyuklu plakadan bir nem odasına aktarın. Lamelleri hazneye aktardıktan sonra, kuruluğu önlemek için 100 μL BB (kullanılan antikor çiftlerine göre BB1 veya BB2) ekleyin.
      NOT: Işıktan korunan bir nem odası, bir Petri kabını (plastik veya cam) alüminyum folyoya sararak ve Petri kabının çevresine birkaç parça ıslak kağıt havlu ekleyerek kolay ve hızlı bir şekilde elde edilebilir.
3. Yakınlık ligasyon testi (PLA)
   NOT: PLA protokolü, küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarını takip eder.
   1. Primer antikor inkübasyonu
      1. Birincil antikor çalışma solüsyonunu hazırlayın. BB1'de tavşan anti-ORP5 (1:150) artı fare anti-ORP8 (1:200), BB2'de fare anti-ORP8 (1:200) artı tavşan anti-PTPIP51 (1:200) ve BB1'de tavşan anti-ORP5 (1:150) artı fare anti-PTPIP51 (1:200) seyreltin. Lamel başına (en az) 40 μL primer antikor çözeltisi hazırlayın (ör., 0.27 μL tavşan anti-ORP5, 0.2 μL fare anti-ORP8, 39.53 μL BB1).
      2. BB'yi bir vakum sistemi kullanarak önceki yıkamadan (adım 1.2.8) çıkarın ve lamellere 40 μL primer antikor solüsyonu ekleyin. Işıktan korunan bir nem odasında oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   2. Vakum sistemini kullanarak lamelleri 3x 5 dakika boyunca 100 μL karşılık gelen BB ile yıkayın.
   3. PLA prob inkübasyonu
      1. PLA probları çalışma çözümünü hazırlayın. Tavşan ARTI (1:5) ve fare EKSİ (1:5) PLA problarını BB'de seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL PLA prob solüsyonu hazırlayın (örneğin, 8 μL tavşan ARTI PLA probu, 8 μL fare EKSİ PLA probu, 24 μL BB). Kullanmadan önce PLA prob solüsyonunun oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.
      2. Bir vakum sistemi kullanarak BB'yi lamellerden çıkarın (adım 1.3.2'den itibaren) ve lamellere 40 μL PLA prob çözeltisi ekleyin. Işıktan korunan bir nem odasında 37°C'de 1 saat inkübe edin.
   4. Lamelleri oda sıcaklığında 100 μL 1x yıkama tamponu A'da 2x 5 dakika yıkayın.
   5. Ligasyon
      1. 5x ligasyon tamponunu ultra saf suyla 1:5 oranında seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL ligasyon solüsyonu hazırlayın (8 μL 5x ligasyon tamponu, 31 μL ultra saf su).
      2. Ligaz'ı (PLA kitinde verilen 1 U/μL) önceki adımda 1:40 seyreltmede hazırlanan 1x ligasyon tamponuna ekleyin ve karıştırın.
      3. Bir vakum sistemi kullanarak lamellerden 1x yıkama tamponu A'yı çıkarın (adım 1.3.4'ten itibaren), lamellere 40 μL ligaz çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan bir nem odasında 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   6. Lamelleri 2x 2 dakika boyunca 100 μL 1x yıkama tamponu A'da oda sıcaklığında vakum sistemini kullanarak yıkayın.
   7. Polimerizasyon
      1. 5x amplifikasyon tamponunu ultra saf suyla 1:5 oranında seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL amplifikasyon solüsyonu (8 μL 5x amplifikasyon tamponu, 31.5 μL ultra saf su) hazırlayın.
      2. Polimerazı (PLA kitinde verilen 10 U/μL) önceki adımda 1:80 seyreltmede hazırlanan 1x polimerizasyon tamponuna ekleyin ve karıştırın.
      3. Bir vakum sistemi kullanarak lamellerden 1x yıkama tamponu A'yı çıkarın (adım 1.3.6'dan itibaren), lamellere 40 μL polimeraz çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan bir nem odasında 37 °C'de 1 saat 40 dakika inkübe edin.
   8. Polimeraz çözeltisini lamellerden çıkarın ve ışıktan korunan bir nem odasında oda sıcaklığında 100 μL 1x yıkama tamponu B'de 2x 10 dakika yıkayın.
   9. Lamelleri 1 x 1 dakika boyunca 100 μL 0.001x yıkama tamponu B içinde oda sıcaklığında ışıktan korunan bir nem odasında yıkayın.
   10. Lamelleri DAPI'li montaj ortamı (1.6-0.4 μg/mL arasındaki konsantrasyon) kullanarak mikroskopi için cam slaytlara monte edin. Oje ile kapatın.

2. Görüntü edinme

1. PLA sonuçlarını gözlemleyin ve beraberindeki yazılımı kullanarak 63x yağa daldırma objektifi ile floresan konfokal mikroskopi kullanarak görüntüler elde edin.
2. 405 nm lazer diyot veya beyaz ışık lazeri kullanarak floresan uyarımını ayarlayın ve GaAsP PMT'ler veya hibrit dedektörlerle spektral pencereleri toplayın. Her odak düzleminde (300 nm'yi kapsayan), PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) ve mitokondri (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm) için floresan sinyallerini alın.

3. Mitokondri ile ilişkili PLA noktalarının görüntü işleme ve değerlendirilmesi

1. Hücresel bileşenler arasında mesafe haritaları oluşturan görüntü analizi için bir yazılım kullanarak konfokal görüntüleri işleyin. PLA noktalarının ve mitokondriyal ağın 3D sulandırmalarını oluşturmak ve hücre görüntüleme yazılımını kullanarak aralarındaki mesafeye erişmek için aşağıdaki adımları izleyin (Şekil 1).
2. 3D mesafe haritası uzantısının kurulumu
   1. Hem XT seçeneğiyle hem de MATLAB yazılımıyla hücre analizi yazılım paketini veya yalnızca web sitesinden ücretsiz olarak indirilebilen bir MATLAB derleyici çalışma zamanını (MRC) kurun.
   2. Hücre çözümleme yazılımını, bir XTension başlatıldığında MATLAB'ı başlatacak şekilde aşağıdaki gibi ayarlayın: Imaris (Mac OS X) veya Düzen menüsünden (Windows) Tercihler'i seçin, Özel Araçlar paneline geçin ve ardından yolu ayarlayın:
      Windows için C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe veya/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab Mac OS X için.
3. Görüntüleri yazılıma aktarın
   1. Konfokal yığın görüntülerini bir . IMS dosyasını, doğrudan Arena bölümü aracılığıyla veya toplu dönüştürmeye izin veren bağımsız Dosya Dönüştürücüyü kullanarak.
   2. İçe aktarma işleminden sonra, görüntülerin uygun şekilde kalibre edilip edilmediğini kontrol edin. Görüntü Geometrisi > Görüntü Özelliklerini Düzenle > tıklayın ve voksel boyutunun X ve Y cinsinden gerçek görüntü için beklenen piksel boyutuna karşılık gelip gelmediğini kontrol edin (edinme yazılımındaki görüntü kalibrasyonuna bakın) ve Z'deki voksel boyutunun Z yığınını oluşturmak için mikroskop tarafından uygulanan adıma karşılık geldiğini kontrol edin. Değerler doğru değilse, aşağıdaki adımlarda mesafelerin doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlamak için bunları değiştirin.
   3. Ekran Ayarı menüsündeki farklı kanalların kontrastını Düzenle > Ekran Ayarını Göster'e tıklayarak ayarlayın. Her rengin görüntüsünü optimize etmek için her kanalı bağımsız olarak ayarlayın. Bu adım, görüntü değerlerini doğrudan etkilemez, ancak kesin eşikler ayarlamak veya zayıf nesneleri tespit etmek için gereklidir.
   4. Düzenle > 3B Kırp seçeneklerini kullanarak görüntüyü kırparak analizi tek bir hücreyle sınırlayın. Aynı görüş alanındaki başka bir hücreyi analiz etmek için, aynı görüntüyü bir kez daha açın ve farklı şekilde kırpın.
4. ORP5-ORP8 nokta algılama
   1. ORP5 ve ORP8 etkileşiminin bulunduğu yerde üretilen PLA sinyallerini, yeni bir nesne kümesi oluşturan ve nokta algılama sihirbazını açan Yeni Noktalar Ekle seçeneğine tıklayarak tespit edin.
   2. Nokta algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin.
   3. Nokta algılama algoritmasının ilgilenilen nesneleri bulmasına yardımcı olmak için Tahmini XY Çapını ayarlayın (nesne boyutu farklıysa aralık uyarlanmalıdır). Seçilen değer çok yüksekse, yakındaki nesnelerin kaynaşacağını unutmayın. Değer çok küçükse, bir sinyal birden fazla nesne olarak kabul edilebilir veya anormal sinyaller algılanabilir.
   4. İlgilenilen nesnelerin etrafındaki yerel kontrastı artırmak için nokta algılamadan önce görüntü arka planını kaldırmak için Arka Plan Çıkarma'ya tıklayın.
   5. Kaliteyi (nesne merkezindeki yoğunluk) eşik parametresi ve yazılım otomatik eşiği olarak tutarak nokta algılama eşiğini ayarlayın veya tüm nesneleri algılamak için bu değeri biraz değiştirin. Nokta algılama bittiğinde, algılama parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın.
5. Mitokondriyal ağ tespiti
   1. Yeni bir nesne oluşturmak için Yeni Yüzeyler Ekle'ye tıklayarak bir yüzey oluşturma oluşturmak için mitokondriyal ağı tespit edin ve yüzey algılama sihirbazını açın.
   2. Yüzey oluşturma işleminin gerçekleştirileceği kanalı seçin.
   3. Daha pürüzsüz bir yüzey elde etmek için Düzgünleştir onay kutusunu tıklatarak ve yüzeyde gözlemlenebilen en küçük ayrıntıları gösteren bir eşik ayarlayarak bir Gauss filtresi uygulayın.
   4. Yerel kontrastları geliştirmek ve eşik adımına yardımcı olmak için bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin.
   5. Sinyalin yoğunluğuna göre mitokondriyal ağı tespit etmek için eşiği ayarlayın. Eşiği doğru bir şekilde ayarlamak zorsa, düzgünlük derecesini ve arka plan çıkarma derecesini ayarlamak için önceki adıma geri dönmeniz önerilir.
   6. Gerekirse, eşikten kaynaklanan küçük kalıntıları gidermek için yüzeye bir filtre uygulayın. Bunu yapmak için, yüzey sınıflandırma penceresinde Voksel Sayısı filtresini seçin ve yalnızca ilgilenilen nesneleri tutmak için üst ve alt eşiklerle oynayın. Yüzey oluşturma işlemi sona erdiğinde, oluşturma parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın.
6. Mitokondri etrafında 3 boyutlu mesafe haritasının oluşturulması
   1. Daha önce aşağıdaki gibi oluşturulan mitokondriyal yüzeyin dışında bir mesafe haritası oluşturun. Sahne ağacı kutusunda mitokondri yüzeyini seçin. Görüntü işleme > yüzeyler işlevi > mesafe dönüşümü üzerine tıklayın. Bu, kullanıcıdan haritanın nesne yüzeyinin dışında mı yoksa içinde mi hesaplanacağını seçmesini isteyen bir Matlab XTension'ı çağırır.
   2. PLA noktaları ile mitokondri yüzeyi arasındaki mesafeyi ölçmek için Dış Yüzey Nesnesi'ni seçin. Mesafe haritası oluşturulduktan sonra, ekran ayarlama panelinde yeni bir kanal olarak görünür. Bu kanalda, her pikselin en yakın mitokondriye olan mesafeye karşılık gelen bir değeri vardır.
7. Nesnelerin en yakın mitokondriden uzaklıklarının çıkarılması
   1. Her noktadan en yakın mitokondriye olan mesafeyi ölçmek ve en yakın olanları belirlemek ve görselleştirmek için, sahne ağacı kutusunda daha önce oluşturulmuş noktaları seçin.
   2. İstatistiklerde ve ayrıntılı günlükte, Belirli Değerler'i seçin (her nokta için bir ölçüm elde etmek için). Merkez Yoğunluğu Ch=X'i seçin (X, mesafe haritası kanalının numarasına karşılık gelir). Bu, mesafe haritasında en yakın mitokondriye olan mesafesine karşılık gelen her bir nokta merkezinin değerini ölçecektir.
   3. Pencerenin sol alt kısmındaki Disket simgesine tıklayarak verileri .csv dosyası olarak dışa aktarın.
   4. Mitokondriye olan mesafelerine göre bir nokta alt popülasyonu çıkarmak için sahne ağacındaki noktaları seçin ve Filtreler sekmesine tıklayın.
   5. Bu pencerede, bir kez daha Merkez Yoğunluğu Ch=X'e dayalı yeni bir filtre ekleyin ve alt eşiği 0 μm'ye ve üst eşiği 0,380 μm'ye ayarlayarak mitokondriden 380 nm'den daha az uzaklıktaki noktaları çıkarın.
      NOT: 380 nm'lik eşik, birincil ve ikincil antikorlar (30 nm) artı PLA amplifikasyon sinyallerinin (350 nm) yarısı maksimumda (FWHM) tam genişliğin yarısı arasındaki ilişkiyi içeren bir PLA reaksiyonuna dayalı olarak tahmin edilmiştir.
   6. Seçili noktalara odaklanmak ve örneğin onlara farklı bir renk vermek için, Seçimi Yeni Noktalara Çoğalt düğmesine basarak bir çoğaltma adımı gerçekleştirin.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, iki ER'ye bağlı lipid transfer proteininin, ORP5 ve ORP8'in etkileşim bölgelerini tespit ettik ve bunların diğer organellerle, özellikle mitokondri ile temas halinde olan ER membran alt alanlarındaki oluşumlarını değerlendirdik. Bunun için, HeLa hücrelerindeki mitokondriyal ağ kırmızı bir mitokondriyal işaretleyici ile boyandı ve özgüllüğü daha önce immünofloresan¹⁵ ile test edilen primer antikorlar anti-ORP5 ve anti-ORP8 kull...

Tartışmalar

Bu protokol, MCS'lerde, özellikle MERCS'lerde organeller arası protein PLA etkileşimlerini tanımlamak ve ölçmek için tasarlanmıştır. Protokolün yeniliği, aynı zarda bulunan iki protein arasındaki PLA etkileşimlerini lokalize etmek ve ölçmek için PLA'yı çoklu organellerin etiketlenmesi, konfokal mikroskopi ve 3D görüntü analizi ile birleştirmesidir, bu durumda ER zarı içinde mitokondri zarı (MAM) veya MAM ve LD'ler ile aynı anda. Bu protokol, belirli MERCS'lerde ve aynı zamanda diğer MCS'lerd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)	Gibco	14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)	VWR	21236.291
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos red MitoTracker	Invitrogen	M7512	red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates	Merck	CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	51985026	serum free medium
Imaris software v 9.3	Bitplane	N/A	cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10	VWR	390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)	Knittel Glass
mouse anti-ORP8	Santa Cruz	134409
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
rabbit anti-ORP5	Sigma	HAP038712
Saponin	Sigma	84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free	Invitrogen	10977-035