Visualisation et quantification des interactions endogènes intra-organites protéiques au niveau des sites de contact ER-mitochondries par des tests de ligature de proximité

Résumé

Le besoin de nouvelles approches pour étudier les sites de contact membranaire (MCS) s’est accru en raison de l’intérêt croissant pour l’étude de ces structures cellulaires et de leurs composants. Nous présentons ici un protocole qui intègre les technologies de microscopie précédemment disponibles pour identifier et quantifier les complexes protéiques intra-organites et inter-organites qui résident dans les MCS.

Résumé

Les sites de contact membranaire (MCS) sont des zones de proximité membranaire qui permettent et régulent l’échange dynamique de diverses biomolécules (c’est-à-dire le calcium et les lipides) entre les organites juxtaposés sans impliquer la fusion membranaire. Les MCS sont essentiels à l’homéostasie cellulaire, et leurs fonctions sont assurées par les composants résidents, qui existent souvent sous forme de complexes protéiques multimériques. Les MCS impliquent souvent le réticulum endoplasmique (RE), un site majeur de synthèse des lipides et de stockage cellulaire du calcium, et sont particulièrement importants pour les organites, tels que les mitochondries, qui sont exclus des voies de transport vésiculaires classiques. Au cours des dernières années, les MCS entre le RE et les mitochondries ont été largement étudiés, car leurs fonctions ont un impact important sur le métabolisme cellulaire/bioénergétique. Plusieurs protéines ont commencé à être identifiées sur ces sites de contact, notamment les attaches membranaires, les canaux calciques et les protéines de transfert de lipides, ce qui soulève le besoin de nouvelles méthodologies et approches techniques pour étudier ces composants MCS. Nous décrivons ici un protocole composé d’approches techniques combinées, qui incluent le test de ligature de proximité (PLA), la coloration des mitochondries et la segmentation par imagerie 3D, qui permet la détection de protéines physiquement proches (>40 nm) les unes des autres et qui résident sur la même membrane au niveau des MCS des mitochondries ER. Par exemple, nous avons utilisé deux protéines de transfert de lipides ancrées dans le RE, ORP5 et ORP8, dont il a déjà été démontré qu’elles interagissent et se localisent au niveau des mitochondries du RE et des MCS de la membrane plasmique du RE. En associant le PLA ORP5-ORP8 à l’analyse d’un logiciel d’imagerie cellulaire, il a été possible d’estimer la distance du complexe ORP5-ORP8 par rapport à la surface mitochondriale et de déterminer qu’environ 50% de l’interaction ORP5-ORP8 PLA se produit au niveau des sous-domaines ER à proximité des mitochondries.

Introduction

La communication inter-organites est une caractéristique déterminante des cellules eucaryotes. L’une des façons dont les organites communiquent est de former des sites de contact membranaire (MCS), qui sont des oppositions membranaires étroites entre deux organites qui sont maintenues par des protéines structurelles et fonctionnelles, telles que les attaches, les protéines de transfert de lipides et les canaux calciques¹. Les MCS peuvent être établis entre des organites similaires ou différents, et ils interviennent dans l’échange de composants cellulaires, ce qui est important pour maintenir l’homéostasie cellulaire. À ce jour, plusieurs MCS ont été identifiés, notamment les mitochondries du réticulum endoplasmique (RE), les contacts ER-membrane plasmique (PM) et les contacts ER-gouttelettes lipidiques (LD)¹. Parmi eux, ceux formés entre le RE et les mitochondries (MERCSs) sont parmi les plus étudiés car ils sont impliqués dans la régulation de plusieurs fonctions cellulaires, dont l’homéostasie lipidique et calcique². Comme les mitochondries sont largement exclues des voies de transport vésiculaires classiques, elles dépendent des MERCS et de leurs constituants moléculaires pour importer des lipides clés ou des précurseurs lipidiques du RE. Le transport non vésiculaire de ces lipides à travers les MERCS assure le maintien d’une bonne composition lipidique mitochondriale, ainsi que leur intégrité fonctionnelle et structurelle³.

Compte tenu de l’implication cruciale des MCS dans diverses fonctions cellulaires, l’intérêt pour une compréhension plus approfondie de leurs composants moléculaires a considérablement augmenté au cours des dernières années. Plusieurs types d’approches basées sur l’imagerie ont été utilisés pour faire progresser les connaissances sur les MCS. Parmi eux, le test de ligature de proximité (PLA) basé sur une sonde de fluorescence a été largement utilisé comme indicateur de l’abondance des MCS en détectant les interactions protéine-protéine inter-organites (dans une plage de détection de 40 nm) à des niveaux endogènes⁴. Par exemple, les MERCS ont été visualisés et quantifiés en utilisant le PLA entre plusieurs paires de protéines mitochondries-RE, notamment VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 et PTPIP51-VAPB 5,6,7,8. Bien que cette technologie ait été utilisée pour détecter et quantifier les interactions protéine-protéine inter-organites présentes au MCS 5,7,9,10,11^, la plupart des études n’ont pas combiné le PLA avec la coloration des organites. Par conséquent, une méthode quantitative permettant de mesurer la proximité entre les interactions PLA et les organites associés n’a pas encore été développée. Ainsi, jusqu’à présent, dans le cas des protéines RE, leur interaction au sein des sous-domaines membranaires en contact avec d’autres organites n’a pas été distinguée de leur interaction au sein du réseau RE largement distribué.

Nous décrivons ici un protocole permettant de détecter les interactions PLA entre les protéines qui résident dans la membrane d’un même organite et d’analyser leur proximité avec la membrane de l’organite partenaire au niveau du MCS. Ce protocole a été développé sur la base de deux prémisses : 1) des études antérieures montrant que, dans des conditions de surexpression, les protéines de transfert de lipides ER ORP5 et ORP8 co-localisent et interagissent au niveau des mitochondries ER-et des MCS ER-PM 12,13,14,15 et que ORP5 se localise aux contacts ER-LD ^16,17 ; 2) les technologies existantes, y compris le PLA, la microscopie confocale, le marquage des organites et l’analyse par imagerie 3D.

Protocole

1. Coloration mitochondriale et test de ligature de proximité (PLA)

1. Plaque 0,5 x 10 5-2 x 10 5 cellules HeLa, maintenues dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % d’acides aminés non essentiels à 37 °C avec 5 % de CO₂, dans des lamelles de verre de 13 mm dans des plaques de^1,5 à 24 puits à une dilution qui permet une confluence cellulaire de 75 % à 90 % le jour de l’intervention.
   REMARQUE : Il convient de noter que les cellules HeLa peuvent être soumises à des traitements supplémentaires, tels que le traitement par siRNA et / ou la transfection de plasmides d’ADN, avant la coloration mitochondriale et le PLA.
2. Coloration mitochondriale
   1. Lavez les cellules une fois dans un milieu sans sérum préchauffé à 37 °C. Incuber les cellules avec un milieu sans sérum préchauffé pendant 10 min à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Préparer 1 μM de marqueur mitochondrial rouge dans un milieu préchauffé sans sérum.
   3. Incuber les cellules avec 500 μL de solution de marqueurs mitochondriaux pendant 30 min à 37 °C avec 5 % de CO₂. Pendant le traitement par marqueurs mitochondriaux et les étapes suivantes du protocole, gardez les cellules sur les lamelles protégées autant que possible de la lumière.
   4. Après l’incubation, laver les cellules 1x dans un milieu libre de sérum préchauffé et 2x dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Effectuez cette étape le plus rapidement possible car les longues étapes de lavage avant la fixation peuvent affecter la morphologie mitochondriale.
   5. Retirez le 1x PBS des lamelles, et fixez les cellules en les incubant dans du PFA à 4% fraîchement préparé (dans 1x PBS) pendant 30 min à température ambiante (dans l’obscurité) sous la hotte chimique. Laver 3x pendant 2 min dans 500 μL de 1x PBS (à l’aide de pipettes jetables ou d’un système d’aspiration relié à une pompe).
   6. Retirez le 1x PBS, et incubez les lamelles avec 500 μL de 50mM NH₄Cl pendant 15 min à température ambiante (dans l’obscurité). Laver 1x pendant 2 min dans 500 μL de 1x PSB à l’aide d’un système d’aspiration.
   7. Laver 3 fois pendant 2 min dans 500 μL de tampon bloquant 1 (BB1, 1 % BSA, 0,1 % de saponine dans 1 x PBS) pour le PLA ORP5-ORP8 ou tampon bloquant 2 (BB2, 2 % BSA, 0,1 % de sérum de chèvre normal, 0,1 % de saponine dans 1 PBS) pour le PLA ORP8-PTPIP51.
   8. Transférez les lamelles de la plaque à 24 puits dans une chambre d’humidité. Après avoir transféré les lamelles dans la chambre, ajoutez 100 μL de BB (BB1 ou BB2, selon les paires d’anticorps utilisées) pour éviter le dessèchement.
      REMARQUE : Une chambre d’humidité protégée de la lumière peut être obtenue facilement et rapidement en enveloppant une boîte de Pétri (plastique ou verre) dans du papier d’aluminium et en ajoutant quelques morceaux d’essuie-tout humide à la périphérie de la boîte de Pétri.
3. Test de ligature de proximité (PLA)
   REMARQUE : Le protocole PLA suit les instructions du fabricant avec de légères modifications.
   1. Incubation primaire d’anticorps
      1. Préparez la solution d’action de l’anticorps primaire. Diluer l’anti-ORP5 de lapin (1 :150) plus l’anti-ORP8 de souris (1 :200) dans BB1, l’anti-ORP8 de souris (1 :200) plus l’anti-PTPIP51 de lapin (1 :200) dans BB2, et l’anti-ORP5 de lapin (1 :150) plus l’anti-PTPIP51 de souris (1 :200) dans BB1. Préparer (au moins) 40 μL de solution d’anticorps primaires par lamelle (p. ex., 0,27 μL d’anti-ORP5 de lapin, 0,2 μL d’anti-ORP8 de souris, 39,53 μL de BB1).
      2. Retirez la bille du lavage précédent (étape 1.2.8) à l’aide d’un système d’aspiration et ajoutez 40 μL de solution d’anticorps primaires dans les lamelles. Incuber pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humide à l’abri de la lumière.
   2. Laver les lamelles 3 fois pendant 5 min avec 100 μL de la bille correspondante à l’aide du système d’aspiration.
   3. Incubation de sonde PLA
      1. Préparez la solution de travail des sondes PLA. Diluer les sondes PLA PLUS (1 :5) de lapin et MOINS (1 :5) de souris dans BB et mélanger. Pour chaque lamelle, préparer (au moins) 40 μL de solution de sonde PLA (p. ex., 8 μL de sonde PLUS PLA lapin, 8 μL de sonde MOINS PLA de souris, 24 μL de BB). Laisser reposer la solution de sonde PLA pendant 20 minutes à température ambiante avant utilisation.
      2. Retirez le boîtier de pédalier des lamelles (à partir de l’étape 1.3.2) à l’aide d’un système d’aspiration et ajoutez 40 μL de solution de sonde PLA aux lamelles. Incuber pendant 1 h à 37°C dans une chambre humide à l’abri de la lumière.
   4. Lavez les lamelles 2x pendant 5 min dans 100 μL de 1x tampon de lavage A à température ambiante.
   5. Ligature
      1. Diluer 5x tampon de ligature à 1 :5 dans de l’eau ultra-pure et mélanger. Pour chaque lamelle, préparer (au moins) 40 μL de solution de ligature (8 μL de tampon de ligature 5x, 31 μL d’eau ultra-pure).
      2. Ajouter la ligase (1 U/μL, fournie dans le kit PLA) à 1x tampon de ligature préparé à l’étape précédente à une dilution de 1 :40, et mélanger.
      3. Retirer 1x tampon de lavage A des lamelles (à partir de l’étape 1.3.4) à l’aide d’un système d’aspiration, ajouter 40 μL de solution de ligase dans les lamelles et incuber pendant 30 min à 37 °C dans une chambre humide à l’abri de la lumière.
   6. Laver les lamelles 2x pendant 2 min dans 100 μL de 1x tampon de lavage A à température ambiante à l’aide du système d’aspiration.
   7. Polymérisation
      1. Diluer 5x tampon d’amplification 1 :5 dans de l’eau ultra-pure et mélanger. Pour chaque lamelle, préparez (au moins) 40 μL de solution d’amplification (8 μL de tampon d’amplification 5x, 31,5 μL d’eau ultra-pure).
      2. Ajouter la polymérase (10 U/μL, fournie dans le kit PLA) au tampon de polymérisation 1x préparé à l’étape précédente à une dilution de 1 :80, et mélanger.
      3. Retirer 1x tampon de lavage A des lamelles (à partir de l’étape 1.3.6) à l’aide d’un système sous vide, ajouter 40 μL de solution de polymérase dans les lamelles et incuber pendant 1 h 40 min à 37 °C dans une chambre humide à l’abri de la lumière.
   8. Retirer la solution de polymérase des lamelles et laver 2x pendant 10 min dans 100 μL de 1x tampon de lavage B à température ambiante dans une chambre humide à l’abri de la lumière.
   9. Laver les lamelles 1x pendant 1 min dans 100 μL de tampon de lavage 0,001x B à température ambiante dans une chambre humide à l’abri de la lumière.
   10. Montez les lamelles sur des lames de verre pour la microscopie à l’aide d’un milieu de montage avec DAPI (concentration comprise entre 1,6 et 0,4 μg/mL). Sceller avec du vernis à ongles.

2. Acquisition d’images

1. Observez les résultats de la PLA et acquérez des images à l’aide de la microscopie confocale à fluorescence avec un objectif à immersion dans l’huile 63x à l’aide du logiciel d’accompagnement.
2. Réglez l’excitation de fluorescence à l’aide d’une diode laser de 405 nm ou d’un laser à lumière blanche, et collectez les fenêtres spectrales avec des PMT GaAsP ou des détecteurs hybrides. À chaque plan focal (couvrant 300 nm), acquérir les signaux de fluorescence pour PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) et les mitochondries (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm).

3. Traitement d’images et évaluation des taches PLA associées aux mitochondries

1. Traitez les images confocales à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images qui génère des cartes de distance entre les composants cellulaires. Suivez les étapes ci-dessous pour générer des reconstitutions 3D des taches PLA et du réseau mitochondrial et pour accéder à la distance entre eux à l’aide d’un logiciel d’imagerie cellulaire (Figure 1).
2. Installation de l’extension de la carte de distance 3D
   1. Installez à la fois le progiciel d’analyse cellulaire avec l’option XT et le logiciel MATLAB ou uniquement un runtime de compilateur MATLAB (MRC), qui peut être téléchargé gratuitement sur le site Web.
   2. Configurez le logiciel d’analyse de cellules pour qu’il démarre MATLAB lorsqu’une XTension est lancée comme suit : dans l’option Imaris (Mac OS X) ou le menu Edition (Windows), sélectionnez Préférences, accédez au panneau Outils personnalisés , puis définissez le chemin d’accès :
      C :\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB .exe pour Windows ou/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab pour Mac OS X.
3. Importer les images dans le logiciel
   1. Convertissez les images de la pile confocale en un fichier . IMS, soit directement via la section Arena, soit à l’aide du convertisseur de fichiers autonome qui permet la conversion par lots.
   2. Après l’importation, vérifiez que les images restent correctement calibrées. Cliquez sur Modifier > propriétés de l’image > Géométrie de l’image, et vérifiez que la taille du voxel correspond en X et Y à la taille de pixel attendue pour l’image réelle (voir calibrage de l’image dans le logiciel d’acquisition) et que la taille du voxel en Z correspond à l’étape appliquée par le microscope pour générer la pile Z. Si les valeurs ne sont pas correctes, modifiez-les pour assurer une estimation correcte des distances dans les étapes suivantes.
   3. Ajustez le contraste des différents canaux dans le menu Réglage de l’affichage en cliquant sur Modifier > Afficher le réglage de l’affichage. Ajustez chaque canal indépendamment pour optimiser l’affichage de chaque couleur. Cette étape n’affecte pas directement les valeurs de l’image mais est essentielle pour définir des seuils précis ou détecter des objets faibles.
   4. Limitez l’analyse à une seule cellule en recadrant l’image à l’aide des options Modifier > Recadrer 3D. Pour analyser une autre cellule dans le même champ de vision, ouvrez à nouveau la même image et recadrez-la différemment.
4. Détection ponctuelle ORP5-ORP8
   1. Détectez les signaux PLA générés à l’emplacement de l’interaction ORP5 et ORP8 en cliquant sur l’option Ajouter de nouveaux spots , ce qui crée un nouvel ensemble d’objets et ouvre l’assistant de détection spot.
   2. Sélectionnez le canal sur lequel la détection ponctuelle doit être effectuée.
   3. Ajustez le diamètre XY estimé (la plage doit être adaptée si la taille de l’objet diffère) pour aider l’algorithme de détection ponctuelle à trouver les objets d’intérêt. Notez que si la valeur choisie est trop élevée, les objets proches fusionneront. Si la valeur est trop petite, un signal peut être considéré comme plusieurs objets, ou des signaux aberrants peuvent être détectés.
   4. Cliquez sur Soustraction de l’arrière-plan pour supprimer l’arrière-plan de l’image avant la détection ponctuelle afin d’améliorer le contraste local autour des objets d’intérêt.
   5. Ajustez le seuil de détection spot en conservant la qualité (intensité au centre de l’objet) comme paramètre de seuil et le seuil automatique du logiciel, ou modifiez légèrement cette valeur pour détecter tous les objets. Une fois la détection ponctuelle terminée, enregistrez les paramètres de détection et réutilisez-les pour traiter d’autres images.
5. Détection du réseau mitochondrial
   1. Détectez le réseau mitochondrial pour générer un rendu de surface en cliquant sur Ajouter de nouvelles surfaces pour créer un nouvel objet, puis ouvrez l’assistant de détection de surface.
   2. Sélectionnez le canal sur lequel la création de la surface doit être effectuée.
   3. Appliquez un filtre gaussien pour obtenir une surface plus lisse en cochant la case Lissage et en définissant un seuil indiquant les plus petits détails observables sur la surface.
   4. Effectuez une soustraction d’arrière-plan pour améliorer les contrastes locaux et faciliter le pas de seuil.
   5. Ajustez le seuil de détection du réseau mitochondrial en fonction de l’intensité du signal. S’il est difficile de régler correctement le seuil, il est recommandé de revenir à l’étape précédente pour ajuster le degré de lissage et de soustraction de l’arrière-plan.
   6. Si nécessaire, appliquez un filtre sur la surface pour éliminer les petits résidus résultant du seuil. Pour ce faire, sélectionnez le filtre Nombre de voxels dans la fenêtre de classification de la surface et jouez avec les seuils supérieur et inférieur pour ne conserver que les objets d’intérêt. Une fois la création de la surface terminée, enregistrez les paramètres de création et réutilisez-les pour traiter d’autres images.
6. Génération de la carte de distance 3D autour des mitochondries
   1. Générez une carte de distance à l’extérieur de la surface mitochondriale précédemment créée comme suit. Sélectionnez la surface des mitochondries dans la zone de l’arborescence de la scène. Cliquez sur Traitement d’image > fonction Surfaces > Transformation de distance. Cela appellera une XTension Matlab qui demandera à l’utilisateur de choisir si la carte doit être calculée à l’extérieur ou à l’intérieur de la surface de l’objet.
   2. Sélectionnez Objet de surface extérieur pour mesurer la distance entre les taches PLA et la surface des mitochondries. Une fois générée, la carte de distance apparaît sous la forme d’un nouveau canal dans le panneau de réglage de l’affichage. Dans ce canal, chaque pixel a une valeur correspondant à la distance aux mitochondries les plus proches.
7. Extraction des distances des objets par rapport à la mitochondrie la plus proche
   1. Pour mesurer la distance entre chaque point et la mitochondrie la plus proche et pour identifier et visualiser les mitochondries les plus proches, sélectionnez les points précédemment générés dans la zone de l’arborescence de la scène.
   2. Dans les statistiques et le journal détaillé, sélectionnez Valeurs spécifiques (pour obtenir une mesure pour chaque spot). Sélectionnez Intensité centrale Ch=X (X correspondant au numéro du canal de la carte de distance). Cela mesurera la valeur de chaque centre de tache, qui correspond à sa distance à la mitochondrie la plus proche, dans la carte de distance.
   3. Exportez les données sous forme de fichier .csv en cliquant sur l’icône Disquette en bas à gauche de la fenêtre.
   4. Pour extraire une sous-population de taches en fonction de leur distance par rapport aux mitochondries, sélectionnez les taches dans l’arborescence de la scène, puis cliquez sur l’onglet Filtres .
   5. Dans cette fenêtre, ajoutez un nouveau filtre basé une fois de plus sur l’intensité centrale Ch=X, et extrayez les taches à moins de 380 nm des mitochondries en réglant le seuil inférieur à 0 μm et le seuil supérieur à 0,380 μm.
      NOTE : Le seuil de 380 nm a été estimé sur la base d’une réaction PLA incluant l’association entre les anticorps primaires et secondaires (30 nm) plus la moitié de la largeur totale à la moitié maximale (FWHM) des signaux d’amplification PLA (350 nm).
   6. Pour faire la mise au point sur les points sélectionnés et, par exemple, leur donner une couleur distincte, effectuez une étape de duplication en appuyant sur le bouton Dupliquer la sélection vers de nouveaux points .

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, nous avons détecté les sites d’interaction de deux protéines de transfert de lipides ancrées dans le RE, ORP5 et ORP8, et évalué leur présence au niveau des sous-domaines membranaires du RE en contact avec d’autres organites, en particulier avec les mitochondries. Pour cela, le réseau mitochondrial dans les cellules HeLa a été coloré avec un marqueur mitochondrial rouge, et des taches vertes ORP5-ORP8 PLA ont été détectées après fixation à l’aide des ant...

Discussion

Ce protocole a été conçu pour identifier et quantifier les interactions inter-organites entre les protéines PLA au niveau des MCS, en particulier au niveau des MERCS. La nouveauté du protocole est qu’il combine le PLA avec le marquage d’organites multiples, la microscopie confocale et l’analyse d’images 3D pour localiser et quantifier les interactions PLA entre deux protéines résidant dans la même membrane, dans ce cas au sein de la membrane du RE à proximité immédiate de la membrane des mitochondries ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)	Gibco	14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)	VWR	21236.291
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5	Agar Scientific	L46R13-15
CMXRos red MitoTracker	Invitrogen	M7512	red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-X	Leica	DMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well Plates	Merck	CLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green	Sigma	DUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma	DUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	51985026	serum free medium
Imaris software v 9.3	Bitplane	N/A	cell imaging software
Incubator UINCU-line IL10	VWR	390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“)	Knittel Glass
mouse anti-ORP8	Santa Cruz	134409
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
rabbit anti-ORP5	Sigma	HAP038712
Saponin	Sigma	84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase free	Invitrogen	10977-035