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要約

膜接触部位(MCS)を研究するための新しいアプローチの必要性は、これらの細胞構造とその構成要素の研究への関心の高まりにより高まっています。ここでは、MCSに存在するオルガネラ内およびオルガネラ間タンパク質複合体を同定および定量するために、以前に利用可能であった顕微鏡技術を統合したプロトコルを紹介します。

要約

膜接触部位(MCS)は、膜融合を伴うことなく、並置された細胞小器官間の多様な生体分子(すなわち、カルシウムおよび脂質)の動的交換を可能にし、調節する、膜が近接する領域である。MCSは細胞の恒常性維持に不可欠であり、その機能は多量体タンパク質複合体として存在することが多い常在成分によって保証されています。MCSは、脂質合成と細胞カルシウム貯蔵の主要な部位である小胞体(ER)に関与することが多く、古典的な小胞体輸送経路から除外されているミトコンドリアなどの細胞小器官にとって特に重要です。ここ数年、ERとミトコンドリアの間のMCSは、その機能が細胞の代謝/生体エネルギーに強く影響するため、広く研究されてきました。これらの接触部位では、膜テザー、カルシウムチャネル、脂質移動タンパク質など、いくつかのタンパク質が同定され始めており、これらのMCS成分を研究するための新しい方法論と技術的アプローチの必要性が高まっています。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)、ミトコンドリア染色、3Dイメージングセグメンテーションなど、互いに物理的に近く(>40 nm)、ER-ミトコンドリアMCSの同じ膜上に存在するタンパク質の検出を可能にする、組み合わせた技術的アプローチで構成されるプロトコルについて説明します。例えば、ERミトコンドリアと小胞体原形質膜MCSで相互作用し、局在することが以前に示されている2つのERアンカー脂質伝達タンパク質、ORP5とORP8を使用しました。ORP5-ORP8 PLAを細胞イメージングソフトウェア解析と関連付けることにより、ORP5-ORP8複合体のミトコンドリア表面からの距離を推定し、ORP5-ORP8 PLA相互作用の約50%がミトコンドリアに近接する小胞体サブドメインで発生していると判断することができました。

概要

オルガネラ間コミュニケーションは真核細胞の決定的な特徴です。オルガネラが通信する1つの方法は、テザー、脂質移動タンパク質、カルシウムチャネルなどの構造的および機能的タンパク質によって維持される2つのオルガネラ間の密接な膜対抗である膜接触部位(MCS)を形成することです1。MCSは、類似または異なる細胞小器官間で確立することができ、それらは細胞の恒常性を維持するために重要な細胞成分の交換を媒介する。現在までに、小胞体(ER)-ミトコンドリア、小胞体-原形質膜(PM)、および小胞体-脂肪滴(LD)接触を含むいくつかのMCSが同定されています1。その中で、ERとミトコンドリアの間に形成されるもの(MERCS)は、脂質やカルシウムの恒常性を含むいくつかの細胞機能の調節に関与しているため、最も研究されています2。ミトコンドリアは古典的な小胞輸送経路からほとんど除外されているため、ERから主要な脂質または脂質前駆体を輸入するために、MERCSとその分子成分に依存しています。MERCSを介したこれらの脂質の非小胞輸送は、適切なミトコンドリア脂質組成の維持、ならびにそれらの機能的および構造的完全性を保証します3。

さまざまな細胞機能へのMCSの重要な関与を考えると、それらの分子成分のより深い理解を提供することへの関心は、ここ数年で大幅に増加しています。MCSに関する知識を深めるために、いくつかのタイプのイメージングベースのアプローチが使用されてきました。その中でも、蛍光プローブベースの近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、内因性レベル4でオルガネラ間タンパク質間相互作用(検出範囲40 nm)を検出することにより、MCSの存在量の指標として広く使用されています。例えば、MERCSは、VDAC1-IP3R、GRP75-IP3R、CypD-IP3、およびPTPIP51-VAPB 5,6,7,8を含むいくつかのミトコンドリア-ERタンパク質ペア間のPLAを使用して視覚化および定量化されています。この技術は、MCS 5,7,9,10,11に存在するオルガネラ間タンパク質間相互作用の検出と定量に使用されていますが、ほとんどの研究ではPLAとオルガネラ染色が組み合わされていませんでした。その結果、PLA相互作用と関連するオルガネラとの近接性の測定を可能にする定量的方法はまだ開発されていません。したがって、これまでのところ、ERタンパク質の場合、他の細胞小器官と接触している膜サブドメイン内でのそれらの相互作用は、広く分布したERネットワーク内でのそれらの相互作用と区別されていませんでした。

ここでは、同じオルガネラの膜に存在するタンパク質間のPLA相互作用を検出し、MCSでパートナーオルガネラの膜への近接を分析するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、2つの前提に基づいて開発されました:1)過剰発現条件下で、ER脂質転移タンパク質ORP5およびORP8がER-ミトコンドリアおよびER-PM MCSで共局在および相互作用することを示す以前の研究12,13,14,15およびORP5がER-LD接触で局在すること16,17;2)PLA、共焦点顕微鏡、オルガネラ標識、3Dイメージング分析などの既存技術。

プロトコル

1.ミトコンドリア染色および近接ライゲーションアッセイ(PLA)

  1. プレート 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa細胞を、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%非必須アミノ酸を5%CO2を含む37°Cで添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で維持し、手順当日に75%〜90%の細胞コンフルエントを可能にする希釈で、1.5ウェルプレート中の1.5mmガラスカバーガラスに入れます。
    注:HeLa細胞は、ミトコンドリア染色およびPLAの前に、siRNA処理および/またはDNAプラスミドトランスフェクションなどの追加の処理に提出することができます。
  2. ミトコンドリア染色
    1. 細胞を37°Cで予め温めた無血清培地で一度洗浄する。 細胞を予め温めた無血清培地で、5%CO2で37°Cで10分間インキュベートします。
    2. あらかじめ温めた無血清培地で1 μMの赤色ミトコンドリアマーカーを調製します。
    3. 細胞を500 μLのミトコンドリアマーカー溶液とともに、5%CO2を含む37°Cで30分間インキュベートします。ミトコンドリアマーカー治療およびプロトコルの次のステップの間、カバーガラス上の細胞を可能な限り光から保護してください。
    4. インキュベーション後、予め温めた無血清培地で1倍、1倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2倍細胞を洗浄します。固定前の長い洗浄ステップはミトコンドリアの形態に影響を与える可能性があるため、できるだけ早くこのステップを実行してください。
    5. カバーガラスから1x PBSを取り出し、調製したばかりの4%PFA(1x PBS中)で化学フードの下で室温(暗所)で30分間インキュベートして細胞を固定します。500 μLの1x PBSで3回2分間洗浄します(使い捨てピペットまたはポンプに接続された真空システムを使用)。
    6. 1x PBSを取り外し、カバーガラスを500 μLの50mM NH4Clとともに室温(暗所)で15分間インキュベートします。真空システムを使用して、500 μLの1x PSBで1回2分間洗浄します。
    7. ORP5-ORP8 PLAの場合はブロッキングバッファー1(BB1、1%BSA、1x PBS溶液中の0.1%サポニン)で3回2分間、ORP8-PTPIP51 PLAの場合はブロッキングバッファー2(BB2、2%BSA、0.1%正常ヤギ血清、1x PBS中0.1サポニン)で2分間洗浄します。
    8. カバーガラスを24ウェルプレートから湿度チャンバーに移します。カバーガラスをチャンバーに移した後、乾燥を避けるために100 μLのBB(使用する抗体のペアに応じてBB1またはBB2)を追加します。
      注意: 光から保護された湿度チャンバーは、ペトリ皿(プラスチックまたはガラス)をアルミホイルで包み、ペトリ皿の周囲に湿ったペーパータオルを数枚追加することで簡単かつ迅速に取得できます。
  3. 近接ライゲーションアッセイ(PLA)
    注意: PLAプロトコルは、わずかな変更を加えて製造元の指示に従います。
    1. 一次抗体インキュベーション
      1. 一次抗体作業溶液を調製します。BB1でウサギ抗ORP5(1:150)とマウス抗ORP8(1:200)、BB2でマウス抗ORP8(1:200)とウサギ抗PTPIP51(1:200)、BB1でウサギ抗ORP5(1:150)とマウス抗PTPIP51(1:200)を希釈します。カバーガラスごとに(少なくとも)40 μLの一次抗体溶液を調製します(例:ウサギ抗ORP50.27 μL、マウス抗ORP80.2 μL、BB139.53 μL)。
      2. 真空システムを使用して前回の洗浄(ステップ1.2.8)からBBを取り出し、カバーガラスに40 μLの一次抗体溶液を追加します。光から保護された湿度チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。
    2. 真空システムを使用して、カバーガラスを対応するBB100 μLで5分間3回洗浄します。
    3. PLAプローブインキュベーション
      1. PLAプローブの作業溶液を準備します。ウサギプラス(1:5)とマウスマイナス(1:5)PLAプローブをBBで希釈し、混合します。カバーガラスごとに、(少なくとも)40 μLのPLAプローブ溶液を調製します(例:8 μLのウサギプラスPLAプローブ、8 μLのマウスマイナスPLAプローブ、24 μLのBB)。使用前に、PLAプローブ溶液を室温で20分間放置してください。
      2. 真空システムを使用して(ステップ1.3.2から)カバーガラスからBBを取り外し、カバーガラスに40μLのPLAプローブ溶液を追加します。光から保護された湿度チャンバー内で37°Cで1時間インキュベートします。
    4. カバーガラスを室温で100 μLの1x洗浄バッファーA中で2回5分間洗浄します。
    5. 結紮
      1. 5倍ライゲーションバッファーを超純水で1:5に希釈して混合します。各カバーガラスについて、(少なくとも)40 μLのライゲーション溶液(8 μLの5xライゲーションバッファー、31 μLの超純水)を準備します。
      2. リガーゼ(1 U/μL、PLAキットに付属)を、前のステップで調製した1xライゲーションバッファーに1:40の希釈率で加え、混合します。
      3. 真空システムを使用してカバーガラスから1x洗浄バッファーAを取り出し(ステップ1.3.4から)、カバーガラスに40 μLのリガーゼ溶液を加え、光から保護された湿度チャンバー内で37°Cで30分間インキュベートします。
    6. カバーガラスを100 μLの1x洗浄バッファーA中で、真空システムを使用して室温で2回2分間洗浄します。
    7. 重合
      1. 5倍増幅バッファーを超純水で1:5に希釈し、混合します。カバーガラスごとに、(少なくとも)40 μLの増幅溶液(8 μLの5倍増幅バッファー、31.5 μLの超純水)を準備します。
      2. ポリメラーゼ(10 U/μL、PLAキットに付属)を前のステップで調製した1x重合バッファーに1:80の希釈で加え、混合します。
      3. 真空システムを使用してカバーガラスから1x洗浄バッファーAを取り出し(ステップ1.3.6から)、カバーガラスに40 μLのポリメラーゼ溶液を加え、光から保護された湿度チャンバー内で37°Cで1時間40分間インキュベートします。
    8. カバーガラスからポリメラーゼ溶液を取り除き、光から保護された湿度チャンバー内の室温で、100 μLの1x洗浄バッファーBで2回10分間洗浄します。
    9. カバーガラスを100 μLの0.001x洗浄バッファーB中で、光から保護された湿度チャンバー内で室温で1分間1回洗浄します。
    10. DAPI(濃度1.6〜0.4 μg/mL)を含む封入剤を使用して、顕微鏡検査用のスライドガラスにカバースリップを取り付けます。マニキュアで密封します。

2. 画像取得

  1. PLAの結果を観察し、付属のソフトウェアを使用して63倍の油浸対物レンズを備えた蛍光共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。
  2. 405 nmレーザーダイオードまたは白色光レーザーを使用して蛍光励起を設定し、GaAsP PMTまたはハイブリッド検出器でスペクトルウィンドウを収集します。各焦点面(300 nmに及ぶ)で、PLA(λex = 488 nm、λem = 505-560 nm)およびミトコンドリア(λex = 543 nm、λem = 606-670 nm)の蛍光シグナルを取得します。

3. ミトコンドリアに関連するPLAスポットの画像処理と評価

  1. 細胞コンポーネント間の距離マップを生成する画像分析用のソフトウェアを使用して、共焦点画像を処理します。以下の手順に従って、PLAスポットとミトコンドリアネットワークの3D再構成を生成し、細胞イメージングソフトウェアを使用してそれらの間の距離にアクセスします(図1)。
  2. 3D距離マップ拡張機能のインストール
    1. XTオプション付きの細胞解析ソフトウェアパッケージとMATLABソフトウェアの両方をインストールするか、Webサイトから自由にダウンロードできるMATLABコンパイラランタイム(MRC)のみをインストールします。
    2. XTension の起動時に MATLAB を起動するように細胞解析ソフトウェアを次のように設定します: Imaris (Mac OS X) または [編集] メニュー (Windows) オプションから [環境設定] を選択し、[カスタム ツール] パネルに変更して、パスを設定します。
      C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe for Windows または/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab for Mac OS X.
  3. 画像をソフトウェアにインポートする
    1. 共焦点スタック画像を .IMSファイルを、アリーナセクションから直接、またはバッチ変換を可能にするスタンドアロン ファイルコンバーター を使用します。
    2. インポート後、画像が適切にキャリブレーションされていることを確認してください。[ 画像プロパティ>画像ジオメトリ>編集]をクリックし、ボクセルサイズがXとYで実際の画像に期待されるピクセルサイズに対応していること(取得ソフトウェアの画像キャリブレーションを参照)、ZのボクセルサイズがZスタックを生成するために顕微鏡によって適用されたステップに対応していることを確認します。値が正しくない場合は、次の手順で距離が正しく推定されるように変更します。
    3. メニューの [ディスプレイ調整 ]でさまざまなチャンネルのコントラストを調整する には、[編集]>[ディスプレイ調整の表示]をクリックします。 各チャンネルを個別に調整して、各色の表示を最適化します。この手順は画像値に直接影響しませんが、正確なしきい値を設定したり、弱いオブジェクトを検出したりするには不可欠です。
    4. [編集] オプション > [3D を切り抜く] オプションを使用して画像をトリミングし、分析を 1 つのセルに制限します。同じ視野内の別のセルを分析するには、同じ画像をもう一度開き、別の画像を切り抜きます。
  4. ORP5-ORP8スポット検出
    1. ORP5とORP8の相互作用の場所で生成されたPLA信号を検出するには、[新しいスポット の追加] オプションをクリックして、新しいオブジェクトのセットを作成し、スポット検出ウィザードを開きます。
    2. スポット検出を実行するチャネルを選択します。
    3. 推定XY直径を調整して(オブジェクトサイズが異なる場合は範囲を調整する必要があります)、スポット検出アルゴリズムが目的のオブジェクトを見つけやすくします。選択した値が高すぎると、近くのオブジェクトが融合することに注意してください。値が小さすぎると、1つの信号が複数の物体と見なされたり、異常な信号が検出されたりする場合があります。
    4. [背景減算]をクリックして、スポット検出の前に画像の背景を削除し、関心のあるオブジェクトの周囲の局所的なコントラストを高めます。
    5. しきい値パラメーターとして品質(オブジェクト中心の強度)とソフトウェア自動しきい値を維持してスポット検出しきい値を調整するか、この値を少し変更してすべてのオブジェクトを検出します。スポット検出が終了したら、検出パラメータを保存し、他の画像の処理に再利用します。
  5. ミトコンドリアネットワーク検出
    1. ミトコンドリアネットワークを検出してサーフェスレンダリングを生成するには、[ 新しいサーフェスの追加 ]をクリックして新しいオブジェクトを作成し、サーフェス検出ウィザードを開きます。
    2. サーフェスの作成を実行するチャネルを選択します。
    3. ガウス フィルタを適用してより滑らかなサーフェスを得るには、[ スムーズ] チェック ボックスをオンにし、サーフェス上で観察可能な最小の詳細を示すしきい値を設定します。
    4. バックグラウンド減算を実行して、ローカルコントラストを強調し、しきい値ステップを支援します。
    5. 信号の強度に基づいてミトコンドリアネットワークを検出するようにしきい値を調整します。しきい値を適切に設定するのが難しい場合は、前の手順に戻って、滑らかさと背景の減算の程度を調整することをお勧めします。
    6. 必要に応じて、表面にフィルターを適用して、しきい値に起因する小さな残差を除去します。これを行うには、[サーフェスの分類] ウィンドウで [ ボクセルの数 ] フィルターを選択し、上限と下限のしきい値を試して、関心のあるオブジェクトのみを保持します。サーフェスの作成が終了したら、作成パラメータを保存し、他のイメージの処理に再利用します。
  6. ミトコンドリア周辺の3次元距離マップの生成
    1. 以下のようにして先に作成したミトコンドリア表面の外側の距離マップを生成する。シーンツリーボックスでミトコンドリア表面を選択します。[ 画像処理]をクリックします> サーフェス機能 > 距離変換.これにより、マップをオブジェクト サーフェスの外側で計算するか内側で計算するかを選択するように求める Matlab XTension が呼び出されます。
    2. [ 外側サーフェスオブジェクト ]を選択して、PLAスポットとミトコンドリアの表面の間の距離を測定します。生成されると、距離マップはディスプレイ調整パネルに新しいチャンネルとして表示されます。このチャネルでは、すべてのピクセルに最も近いミトコンドリアまでの距離に対応する値があります。
  7. 最も近いミトコンドリアからの物体の距離の抽出
    1. 各ポイントから最も近いミトコンドリアまでの距離を測定し、最も近いポイントを特定して視覚化するには、シーンツリーボックスで以前に生成されたスポットを選択します。
    2. 統計と詳細ログで、[ 特定の値 ] を選択します (スポットごとに 1 つの測定値を取得します)。 [中心強度 Ch=X ] を選択します (X は距離マップ チャンネルの番号に対応します)。これにより、距離マップ内の最も近いミトコンドリアまでの距離に対応する各スポット中心の値を測定します。
    3. ウィンドウの左下にある フロッピーディスク アイコンをクリックして、データを.csvファイルとしてエクスポートします。
    4. ミトコンドリアまでの距離に基づいてスポットの亜集団を抽出するには、シーン ツリーでスポットを選択し、[ フィルター] タブをクリックします。
    5. このウィンドウで、中心強度Ch=Xに基づく新しいフィルターをもう一度追加し、下限を0 μm、上限しきい値を0.380 μmに設定して、ミトコンドリアから380 nm未満のスポットを抽出します。
      注:380 nmの閾値は、一次抗体と二次抗体の会合(30 nm)にPLA増幅シグナルの半値幅(FWHM)の半分を加えたPLA反応に基づいて推定されました。
    6. 選択したスポットに焦点を合わせたり、たとえば明確な色を付けたりするには、[ 選択範囲を新しいスポットに 複製]ボタンを押して複製手順を実行します。

結果

上記のプロトコルを用いて、2つのERアンカー脂質転移タンパク質であるORP5とORP8の相互作用部位を検出し、他の細胞小器官、特にミトコンドリアと接触している小胞体膜サブドメインでの発生を評価しました。そのために、HeLa細胞のミトコンドリアネットワークを赤色のミトコンドリアマーカーで染色し、免疫蛍光法で特異性を試験した一次抗体抗ORP5および抗ORP8を用いて固定した後、ORP5-ORP...

ディスカッション

このプロトコルは、MCS、特にMERCSにおけるオルガネラ間タンパク質PLA相互作用を同定および定量するために設計されました。このプロトコルの目新しさは、PLAと複数の細胞小器官の標識、共焦点顕微鏡、および3D画像分析を組み合わせて、同じ膜(この場合はミトコンドリア膜(MAM)またはMAMとLDに近接するER膜内)に存在する2つのタンパク質間のPLA相互作用を局在化および定量化することです。こ...

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD)、ATIP-Avenir Program、Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548)、Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527)、I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope、ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging;ANR-11-IDEX-0003-02/サクレー植物科学)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X DPBS)Gibco14190-094
Ammonium chloride (NH4Cl)VWR21236.291
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA7906
Circular glass coverslips 13mm no. 1.5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos red MitoTrackerInvitrogenM7512red mitochondrial marker
Confocal inverted microscope SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar TC-Treated 24-Well PlatesMerckCLS3526
Duolink In Situ Detection Reagents Green SigmaDUO92002
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI SigmaDUO82040
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS SigmaDUO92004
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUSSigmaDUO92014
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Gibco51985026serum free medium
Imaris software v 9.3BitplaneN/Acell imaging software
Incubator UINCU-line IL10VWR390-0384
Microscope slide StarFrost (3“ x 1“) Knittel Glass
mouse anti-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
rabbit anti-ORP5 SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra Pure Distilled Water, DNase/RNase freeInvitrogen10977-035

参考文献

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