从豚鼠眼睛中分离视网膜色素上皮细胞

摘要

我们描述了一种从年轻色素豚鼠的眼睛中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简单有效的方法。该程序允许对分离的RPE进行后续分子生物学研究，包括基因表达分析。

摘要

该协议描述了从年轻色素豚鼠的眼睛中分离视网膜色素上皮（RPE）的细胞，以便在分子生物学研究中的潜在应用，包括基因表达分析。在眼睛生长调节和近视的背景下，RPE可能充当生长调节信号的细胞中继，因为它位于视网膜和眼睛的两壁（如脉络膜和巩膜）之间。虽然已经为小鸡和小鼠开发了分离RPE的方案，但这些方案已被证明不能直接转化为豚鼠，豚鼠已成为一种重要且广泛使用的哺乳动物近视模型。在这项研究中，分子生物学工具用于检查特定基因的表达，以确认样品没有来自邻近组织的污染。该方案的价值已经在暴露于近视诱导光学离焦的年轻色素豚鼠的 RPE 的 RNA-Seq 研究中得到证明。除了眼睛生长调节之外，该协议在视网膜疾病的研究中还有其他潜在的应用，包括近视性黄斑病变，这是近视失明的主要原因之一，其中与RPE有关。该技术的主要优点是相对简单，一旦完善，即可产生适合分子生物学研究（包括RNA分析）的高质量RPE样品。

引言

RPE包括位于神经视网膜和血管脉络膜之间的独特单层色素细胞，RPE在正常视网膜功能的发育和维持（包括光转导1^，2）方面具有公认的作用。最近，RPE在眼睛生长调节³中被赋予了额外的关键作用，因此，近视⁴的发展。该分配基于RPE的关键位置，位于视网膜和脉络膜之间，以及现在广泛接受的眼睛生长以及因此屈光不正^{在局部调节}5。RPE被认为作为信号中继起着关键作用，将视网膜（生长调节信号的假定来源）连接到脉络膜和巩膜，这是^{中继信号的两个}目标6，^7，8。

大多数近视的特征是轴向长度的增加不能被认为是良性的，涉及视网膜、脉络膜和/或巩膜的病理生理变化代表了不可避免的，现在公认的眼部过度伸长的后果^7，9。在这种情况下，RPE可能是最脆弱的，因为作为非有丝分裂组织，它只能通过单个细胞的拉伸和变薄来容纳膨胀的玻璃体室。虽然RPE在近视相关病变....

研究方案

本研究中使用的所有动物护理和治疗均符合ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。实验方案得到了加州大学伯克利分校动物护理和使用委员会的批准。

1.豚鼠眼摘除术

1. 用心内注射在麻醉下递送的戊巴比妥钠（5%异氟醚氧溶液）对豚鼠实施安乐死。
2. 借助镊子和剪刀将眼睛去核，并立即将它们转移到带有无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的10厘米培养皿中进行洗涤。将眼睛转移到新鲜的PBS溶液中。
   注意：建议使用每孔含有 4 mL 溶液的 6 孔板。

2.分离眼后眼杯和RPE/脉络膜/巩膜复合体

1. 在解剖显微镜的帮助下，使用18 G针在巩膜上做一个初始小切口，在角膜缘边界后约1.0毫米（即角膜和巩膜之间）（图1A）;然后用剪刀去除前段，包括角膜、虹膜、睫状体和晶状体。
2. 接下来，使用剩余的后眼节眼罩，将视网膜与 RPE/脉络膜/巩膜复合体分离;使用镊子首先抓住然后轻轻拉扯Zinn的带状体，然后逐渐剥离视网膜而不会碎裂（图1B）。
   注意：不得直接抓住视网膜，以避免视网膜破碎和视网膜组织分离不完全。显微镜的使用对于该解剖步骤至关重要。

结果

使用上述方案收集的RPE样品的分析显示保存良好的RNA（RIN >8.0，图2B），每只眼睛240.2 ng±35.1 ng（n = 8，NanoDrop，图2B）。 为了进一步评估分离的RPE样品的质量，特别是没有脉络膜和巩膜污染物，我们检查了RPE样品中每种组织的代表性基因的表达¹⁹。与脉络膜和巩膜中的Rpe65表达水平相比，RPE样品显示出Rpe65（RPE特异性基因）的表达.......

讨论

在本文中，我们描述了一种从年轻的色素有色豚鼠的眼睛中分离RPE的方法，适用于RPE基因表达分析。该协议的优点是它产生相对不受污染的高质量RPE样品，RNA适合RNA特异性分析，但相对简单有效。虽然在这里提供的示例中，RPE样本是从年轻（2周大）豚鼠的眼睛收集的，但该方案也已成功用于从老年（年轻成年）动物中收集RPE样本。

对于眼科手术或解剖经验很少的研究人员来?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe with Slip Tip	Bd Vacutainer Labware Medical	22-253-260
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile	pectrum Chemical Mfg. Corp	970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile	Thomas Scientific LLC	1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzer			automated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt Solutions	Gibco	10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm	Fine Science Tools, Inc.	11083-07
Dumont forceps no. 5	ROBOZ	RS-5045
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26419
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26437
MiniSpin Microcentrifuges	Eppendorf	540108	Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020	tissue storage reagent
RNeasy Mini kits	Qiagen	74104	RNA isolation kit
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, Inc.	91500-09