Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India

Riepilogo

Descriviamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate. Questa procedura consente studi di biologia molecolare di follow-up sull'RPE isolato, comprese le analisi di espressione genica.

Abstract

Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate per una potenziale applicazione negli studi di biologia molecolare, comprese le analisi di espressione genica. Nel contesto della regolazione della crescita oculare e della miopia, l'RPE svolge probabilmente un ruolo come relè cellulare per i segnali modulatori della crescita, poiché si trova tra la retina e le due pareti dell'occhio, come la coroide e la sclera. Mentre i protocolli per isolare l'RPE sono stati sviluppati sia per i pulcini che per i topi, questi protocolli hanno dimostrato di non essere direttamente traducibili nella cavia, che è diventata un modello di miopia di mammifero importante e ampiamente utilizzato. In questo studio, sono stati utilizzati strumenti di biologia molecolare per esaminare l'espressione di geni specifici per confermare che i campioni erano privi di contaminazione dai tessuti adiacenti. Il valore di questo protocollo è già stato dimostrato in uno studio RNA-Seq di RPE da giovani cavie pigmentate esposte a defocus ottico che induce miopia. Oltre alla regolazione della crescita oculare, questo protocollo ha altre potenziali applicazioni negli studi sulle malattie della retina, tra cui la maculopatia miopica, una delle principali cause di cecità nei miopi, in cui l'RPE è stato implicato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice e, una volta perfezionata, produce campioni RPE di alta qualità adatti per studi di biologia molecolare, compresa l'analisi dell'RNA.

Introduzione

L'RPE comprende un monostrato unico di cellule pigmentate situate tra la retina neurale e la coroide vascolare e l'RPE ha ruoli ben noti nello sviluppo e nel mantenimento della normale funzione retinica, compresa la fototrasduzione ^1,2. Più recentemente, all'RPE è stato assegnato un ulteriore ruolo chiave nella regolazione della crescita oculare³ e, quindi, nello sviluppo della miopia⁴. Questa assegnazione si basa sulla posizione critica dell'RPE, interposta tra la retina e la coroide e sull'ormai ampia accettazione che la crescita dell'occhio e, quindi, gli errori di rifrazione sono regolati localmente⁵. Si ritiene che l'RPE svolga un ruolo chiave come relè di segnale, collegando la retina, la presunta fonte di segnali modulatori della crescita, alla coroide e alla sclera, i due bersagli dei segnali trasmessi ^6,7,8.

L'aumento della lunghezza assiale che caratterizza la maggior parte della miopia non può essere considerato benigno, con alterazioni fisiopatologiche che coinvolgono la retina, la coroide e/o la sclera che rappresentano conseguenze inevitabili e ormai ben riconosciute di un eccessivo allungamento oculare ^7,9. In questo contesto, l'RPE è forse il più vulnerabile, poiché, essendo un tessuto non mitotico, è in grado di ospitare la camera vitreale in espansione solo attraverso lo stiramento e l'assottigliamento delle singole cellule. Mentre il suo ruolo nelle patologie correlate alla miopia, come la degenerazione maculare miopica, deve ancora essere completamente compreso, l'RPE è stato implicato nella patogenesi di una serie di altre malattie della retina, tra cui l'atrofia geografica, una delle principali cause di cecità, che è associata ad anomalie documentate nella retina, RPE e coroide^{10,11, 12}.

Il successo dell'isolamento delle cellule RPE, libere dalla contaminazione dai tessuti oculari adiacenti, apre potenzialmente molte opportunità di ricerca per ottenere nuove informazioni sui meccanismi alla base di una varietà di malattie oculari / retiniche. Tuttavia, l'isolamento dell'RPE si è dimostrato impegnativo, con molti studi pubblicati che utilizzano campioni combinati di retina / RPE o RPE / coroide per questo motivo^13,14,15. Gli studi che prevedono l'isolamento riuscito dell'RPE di una qualità adatta agli studi di biologia molecolare sono stati limitati agli occhi di pulcino e topo^16,17. Ad esempio, il metodo simultaneo di isolamento RPE e stabilizzazione dell'RNA (SRIRS) descritto da Wang et ^al.18. Isolare le cellule RPE nei topi non sembra funzionare bene negli occhi delle cavie. Il protocollo qui descritto rappresenta un perfezionamento di un approccio che è stato inizialmente prototipato con occhi di toporagno degli alberi da uno degli autori (M.F.) e ha dimostrato di produrre campioni RPE di alta qualità, appropriati per l'RNA e altre analisi di biologia molecolare, dagli occhi di giovani cavie pigmentate¹⁹.

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Protocollo

Tutte le cure e i trattamenti degli animali utilizzati in questo studio sono conformi alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. I protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'Università della California, Berkeley.

1. Enucleazione dell'occhio di cavia

1. Eutanasia di una cavia con un'iniezione intracardiaca di pentobarbital di sodio somministrato in anestesia (isoflurano al 5% in ossigeno).
2. Enucleare gli occhi con l'aiuto di pinze e forbici e trasferirli immediatamente in una capsula di Petri di 10 cm con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per il lavaggio. Trasferire gli occhi alla soluzione PBS fresca.
   NOTA: Si consiglia una piastra a 6 pozzetti contenente 4 ml di soluzione per pozzetto.

2. Isolamento della coppa oculare posteriore dell'occhio e del complesso RPE/coroide/sclera

1. Con l'aiuto di un microscopio da dissezione, utilizzare un ago da 18 G per praticare una piccola incisione iniziale nella sclera, circa 1,0 mm dietro il confine limbare (cioè tra la cornea e la sclera) (Figura 1A); Quindi utilizzare le forbici per rimuovere il segmento anteriore, compresa la cornea, l'iride, il corpo ciliare e il cristallino.
2. Successivamente, lavorando con la restante coppa oculare del segmento oculare, staccare la retina dal complesso RPE / coroide / sclera; utilizzare una pinza per afferrare prima e poi tirare delicatamente la zonula di Zinn e poi per staccare progressivamente la retina senza frammentazione (Figura 1B).
   NOTA: La retina non deve essere afferrata direttamente per evitare la frammentazione retinica e l'isolamento incompleto del tessuto retinico. L'uso di un microscopio è essenziale per questa fase di dissezione.

3. Isolamento dell'RPE dalla coroide

1. Dopo che la retina è stata completamente rimossa, immergere la concia oculare posteriore rimanente, che include RPE, coroide e sclera, in un reagente di conservazione dei tessuti per 5 minuti (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Utilizzare una piastra a 12 pozzetti con pozzetti identificati, ciascuno riempito con 2 ml del reagente di stoccaggio dei tessuti.
2. Trasferire la concia oculare in un altro pozzetto riempito con 4 ml di PBS per 10 s prima di spostarlo in un terzo pozzetto riempito con 2 ml di PBS.
3. Collegare un ago da 30 G a una siringa da 1 mL riempita con PBS per la fase finale di isolamento RPE. Spingere delicatamente sulla siringa per creare una corrente a getto di PBS; per prima cosa, punta questo flusso verso l'RPE per fare un piccolo strappo o un buco in esso, quindi dirigere il flusso di PBS nell'apertura creata per staccare l'RPE come un foglio dalla coroide (Figura 1C).
   NOTA: il distacco dell'RPE come foglio produce il campione RPE più grande. Ancora una volta, l'uso di un microscopio è essenziale per questo passaggio.
4. Dopo aver staccato l'RPE dalla coroide (Figura 1D), raccogliere il tessuto RPE in una siringa senza ago da 1 ml, quindi trasferire il campione raccolto in una provetta da 1,5 ml.
5. Centrifugare il tubo da 1,5 mL con l'RPE raccolto a 8.000 × g per 1 minuto per ottenere un pellet RPE (Figura 2A).
6. Eliminare la soluzione PBS e sostituirla con 350 ml di tampone di lisi, come incluso nei kit di isolamento dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali); pipetta 20x per miscelare e, quindi, preservare la qualità del campione. Per una conservazione e una conservazione a lungo termine, trasferire i campioni in un congelatore a -80 °C.
   NOTA: Il tampone di lisi è un componente proprietario del kit di isolamento dell'RNA per la lisi cellulare e tissutale prima dell'isolamento dell'RNA e dell'isolamento simultaneo di RNA/DNA/proteine. Per inattivare le RNA nel lisato, assicurarsi di aggiungere β-mercaptoetanolo al tampone di lisi (10 μL di β-mercaptoetanolo per 1 mL di tampone di lisi).

4. Estrazione RPE-RNA

1. Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali) per isolare e raccogliere l'RNA dai campioni RPE seguendo le istruzioni fornite dal produttore. Valutare la qualità del campione tramite elettroforesi.
   NOTA: Il protocollo descritto ha prodotto un prodotto di buona qualità (cioè il numero di integrità dell'RNA [RIN] superiore a 8,0).

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Risultati

L'analisi dei campioni RPE raccolti utilizzando il protocollo di cui sopra ha mostrato RNA ben conservato (RIN >8.0, Figura 2B), con 240,2 ng ± 35,1 ng per occhio (n = 8, NanoDrop, Figura 2B). Per valutare ulteriormente la qualità dei campioni RPE isolati, in particolare l'assenza di contaminanti coroideali e sclerali, abbiamo esaminato l'espressione di geni rappresentativi per ciascuno di questi ultimi tessuti nei campioni RPE¹⁹. I ca...

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Discussione

In questo articolo, descriviamo un metodo per isolare RPE, appropriato per le analisi di espressione genica RPE, dagli occhi di giovani cavie pigmentate. I meriti di questo protocollo sono che produce campioni RPE di alta qualità che sono relativamente privi di contaminazione, con RNA adeguatamente conservato per analisi specifiche dell'RNA e, tuttavia, è relativamente semplice ed efficiente. Mentre nell'esempio fornito qui, i campioni RPE sono stati raccolti dagli occhi di una cavia giovane (2 settimane), il protocoll...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe with Slip Tip	Bd Vacutainer Labware Medical	22-253-260
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile	pectrum Chemical Mfg. Corp	970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile	Thomas Scientific LLC	1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzer			automated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt Solutions	Gibco	10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm	Fine Science Tools, Inc.	11083-07
Dumont forceps no. 5	ROBOZ	RS-5045
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26419
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26437
MiniSpin Microcentrifuges	Eppendorf	540108	Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020	tissue storage reagent
RNeasy Mini kits	Qiagen	74104	RNA isolation kit
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, Inc.	91500-09