Выделение пигментных эпителиальных клеток сетчатки из глаз морской свинки

Резюме

Описан простой и эффективный метод выделения клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз молодых пигментированных морских свинок. Эта процедура позволяет проводить последующие молекулярно-биологические исследования изолированного RPE, включая анализ экспрессии генов.

Аннотация

Этот протокол описывает выделение клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) из глаз молодых пигментированных морских свинок для потенциального применения в исследованиях молекулярной биологии, включая анализ экспрессии генов. В контексте регуляции роста глаз и близорукости RPE, вероятно, играет роль клеточного реле для сигналов модуляции роста, поскольку он расположен между сетчаткой и двумя стенками глаза, такими как сосудистая оболочка и склера. Хотя протоколы изоляции RPE были разработаны как для цыплят, так и для мышей, оказалось, что эти протоколы не могут быть напрямую перенесены на морскую свинку, которая стала важной и широко используемой моделью близорукости млекопитающих. В этом исследовании инструменты молекулярной биологии использовались для изучения экспрессии специфических генов, чтобы подтвердить, что образцы не были загрязнены соседними тканями. Ценность этого протокола уже была продемонстрирована в исследовании RNA-Seq RPE молодых пигментированных морских свинок, подвергшихся оптическому расфокусированию, вызывающему близорукость. Помимо регуляции роста глаз, этот протокол имеет и другие потенциальные применения в исследованиях заболеваний сетчатки, включая миопическую макулопатию, одну из основных причин слепоты при миопах, в которую был вовлечен RPE. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно прост и после совершенствования дает высококачественные образцы RPE, подходящие для исследований молекулярной биологии, включая анализ РНК.

Введение

RPE содержит уникальный монослой пигментированных клеток, расположенных между нервной сетчаткой и сосудистой сосудистой сосудистой оболочкой, и RPE играет хорошо известную роль в развитии и поддержании нормальной функции сетчатки, включая фототрансдукцию ^1,2. Совсем недавно РПЭ была отведена дополнительная ключевая роль в регуляции роста^{глаз 3} и, таким образом, в развитии близорукости⁴. Это назначение основано на критическом расположении RPE, расположенном между сетчаткой и сосудистой оболочкой, и в настоящее время широко распространенном признании того, что рост глаз и, следовательно, аномалии рефракции регулируются локально⁵. Считается, что RPE играет ключевую роль в качестве сигнального реле, связывающего сетчатку, предполагаемый источник сигналов модуляции роста, с сосудистой оболочкой и склерой, двумя мишенями ретранслируемых сигналов ^6,7,8.

Увеличение осевой длины, которое характеризует большинство близорукости, не может считаться доброкачественным, при этом патофизиологические изменения, затрагивающие сетчатку, сосудистую оболочку и/или склеру, представляют собой неизбежные и в настоящее время хорошо известные последствия чрезмерного удлинения глаза ^7,9. В этом контексте RPE, пожалуй, наиболее уязвим, поскольку, будучи немитотической тканью, он способен приспосабливаться к расширяющейся стекловидной камере только за счет растяжения и истончения отдельных клеток. Хотя его роль в патологиях, связанных с близорукостью, таких как миопическая макулярная дегенерация, еще предстоит полностью понять, RPE был вовлечен в патогенез ряда других заболеваний сетчатки, включая географическую атрофию, одну из основных причин слепоты, которая связана с документально подтвержденными аномалиями сетчатки, RPE и сосудистой оболочки^{10,11, Статья 12}.

Успешная изоляция клеток RPE, свободных от загрязнения из соседних тканей глаза, потенциально открывает множество исследовательских возможностей для получения нового понимания механизмов, лежащих в основе различных заболеваний глаз / сетчатки. Тем не менее, выделение РПЭ оказалось сложной задачей, и по этой причине во многих опубликованных исследованиях использовались комбинированные образцы сетчатки/РПЭ или РПЭ/сосудистой оболочки^13,14,15. Исследования, связанные с успешным выделением RPE качества, подходящего для исследований молекулярной биологии, были ограничены глазами цыплят и мышей^16,17. Например, метод одновременной изоляции RPE и стабилизации РНК (SRIRS), описанный Wang et ^al.18. Выделение клеток RPE у мышей, по-видимому, не очень хорошо работает в глазах морских свинок. Описанный здесь протокол представляет собой усовершенствование подхода, который был первоначально прототипирован с глазами землеройки одним из авторов (М.Ф.) и доказал, что дает высококачественные образцы RPE, подходящие для анализа РНК и других молекулярной биологии, из глаз молодых пигментированных морских свинок¹⁹.

протокол

Весь уход за животными и лечение, используемые в этом исследовании, соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и офтальмологических исследованиях. Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Беркли.

1. Энуклеация глаза морской свинки

1. Усыпить морскую свинку внутрисердечной инъекцией пентобарбитала натрия, вводимого под наркозом (5% изофлурана в кислороде).
2. Энуклеируйте глаза с помощью щипцов и ножниц и немедленно перенесите их в 10-сантиметровую чашку Петри со стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для промывания. Перенесите глаза в свежий раствор PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется 6-луночная пластина, содержащая 4 мл раствора на лунку.

2. Изоляция заднего глазного стакана глаза и комплекса РПЭ/сосудистая/склера

1. С помощью рассекающего микроскопа используйте иглу 18 G, чтобы сделать начальный небольшой разрез в склере, примерно на 1,0 мм позади лимбальной границы (т. е. между роговицей и склерой) (рис. 1A); Затем с помощью ножниц удалите передний сегмент, включая роговицу, радужную оболочку, цилиарное тело и хрусталик.
2. Затем, работая с оставшимся задним глазным сегментом, отсоедините сетчатку от комплекса РПЭ/сосудистая оболочка/склера; используйте щипцы, чтобы сначала захватить, а затем осторожно потянуть за зонулу Зинна, а затем постепенно отслаивать сетчатку без фрагментации (рис. 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатку нельзя захватывать напрямую, чтобы избежать фрагментации сетчатки и неполной изоляции тканей сетчатки. Использование микроскопа необходимо для этого этапа вскрытия.

3. Изоляция СИЗОД от сосудистой оболочки

1. После того, как сетчатка будет полностью удалена, погрузите оставшуюся заднюю чашку глаза, которая включает РПЭ, сосудистую оболочку и склеру, в реагент для хранения тканей на 5 минут (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 12-луночную пластину с идентифицированными лунками, каждая из которых заполнена 2 мл реагента для хранения тканей.
2. Перенесите наглазник в другую лунку, заполненную 4 мл PBS, в течение 10 с, прежде чем переместить его в третью лунку, заполненную 2 мл PBS.
3. Прикрепите иглу 30 г к шприцу объемом 1 мл, наполненному PBS, для заключительного этапа изоляции RPE. Осторожно надавите на шприц, чтобы создать струю PBS; сначала направьте этот поток на СИЗОД, чтобы сделать в нем небольшой разрыв или отверстие, а затем направьте поток ПБС в созданное отверстие, чтобы отсоединить РПЭ как лист от сосудистой оболочки (рис. 1С).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отсоединение СИЗОД в виде листа дает самый большой образец СИЗО. Опять же, использование микроскопа необходимо для этого шага.
4. После отделения РПЭ от сосудистой оболочки (рис. 1D) соберите ткань РПЭ в безыгольный шприц объемом 1 мл, а затем перенесите собранный образец в пробирку объемом 1,5 мл.
5. Центрифугируют пробирку объемом 1,5 мл с собранным РПЭ в дозе 8 000 × г в течение 1 мин, чтобы получить гранулу РПЭ (рис. 2А).
6. Откажитесь от раствора PBS и замените его 350 мл буфера для лизиса, включенного в наборы для выделения РНК (см. Таблицу материалов); Пипеткой 20 раз перемешать и, таким образом, сохранить качество образца. Для более длительного хранения и консервации перенесите образцы в морозильную камеру с температурой -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса является запатентованным компонентом набора для выделения РНК для лизиса клеток и тканей перед выделением РНК и одновременной изоляцией РНК/ДНК/белка. Чтобы инактивировать РНК в лизате, обязательно добавьте β-меркаптоэтанол в буфер для лизиса (10 мкл β-меркаптоэтанола на 1 мл буфера для лизиса).

4. Выделение RPE-РНК

1. Используйте набор для выделения РНК (см. Таблицу материалов) для выделения и сбора РНК из образцов RPE в соответствии с инструкциями производителя. Оцените качество образца с помощью электрофореза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол дал продукт хорошего качества (т.е. номер целостности РНК [RIN] более 8,0).

Результаты

Анализ образцов RPE, собранных с использованием вышеуказанного протокола, показал хорошо сохранившуюся РНК (RIN >8.0, рис. 2B) с 240,2 нг ± 35,1 нг на глаз (n = 8, NanoDrop, рис. 2B). Для дальнейшей оценки качества выделенных образцов RPE, в частности, отсутствия контаминантов ?...

Обсуждение

В этой статье мы описываем метод выделения RPE, подходящий для анализа экспрессии генов RPE, из глаз молодых пигментированных морских свинок. Достоинства этого протокола заключаются в том, что он дает высококачественные образцы RPE, которые относительно свободны от загрязнения, с РНК, соот?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe with Slip Tip	Bd Vacutainer Labware Medical	22-253-260
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile	pectrum Chemical Mfg. Corp	970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile	Thomas Scientific LLC	1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzer			automated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt Solutions	Gibco	10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm	Fine Science Tools, Inc.	11083-07
Dumont forceps no. 5	ROBOZ	RS-5045
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26419
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26437
MiniSpin Microcentrifuges	Eppendorf	540108	Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020	tissue storage reagent
RNeasy Mini kits	Qiagen	74104	RNA isolation kit
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, Inc.	91500-09