JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר את בידוד התאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט לצורך יישום פוטנציאלי במחקרי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח ביטוי גנים. בהקשר של ויסות גדילת העין וקוצר ראייה, RPE ככל הנראה ממלא תפקיד כממסר תאי לאותות מודולריים לגדילה, שכן הוא ממוקם בין הרשתית לשני קירות העין, כגון כורואיד וסקלרה. בעוד פרוטוקולים לבידוד RPE פותחו הן עבור אפרוחים והן עבור עכברים, פרוטוקולים אלה הוכיחו כי אינם ניתנים לתרגום ישיר לשרקן, שהפך למודל קוצר ראייה חשוב ונפוץ של יונקים. במחקר זה נעשה שימוש בכלים של ביולוגיה מולקולרית כדי לבחון את הביטוי של גנים ספציפיים כדי לאשר שהדגימות היו נקיות מזיהום מהרקמות הסמוכות. הערך של פרוטוקול זה כבר הוכח במחקר RNA-Seq של RPE משרקנים צעירים בעלי פיגמנט שנחשפו לקוצר ראייה אופטי הגורם לקוצר ראייה. מעבר לוויסות גדילת העיניים, לפרוטוקול זה יש יישומים פוטנציאליים נוספים במחקרים על מחלות רשתית, כולל מקולאופתיה קוצרת ראייה, אחד הגורמים המובילים לעיוורון במיופים, שבהם RPE היה מעורב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית ולאחר שהשתכללה, מניבה דגימות RPE באיכות גבוהה המתאימות ללימודי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח RNA.

Introduction

RPE מורכב משכבה ייחודית של תאים פיגמנטיים הממוקמים בין הרשתית העצבית לבין כורואיד כלי הדם, ול- RPE תפקידים מוכרים היטב בפיתוח ותחזוקה של תפקוד רשתית תקין, כולל פוטוטרנסדוקציה 1,2. לאחרונה, RPE הוקצה תפקיד מפתח נוסף בוויסות צמיחת העין3, ובכך התפתחות קוצר ראייה4. משימה זו מבוססת על המיקום הקריטי של ה-RPE, המשולב בין הרשתית לכורואיד ועל ההסכמה הרחבה כיום שצמיחת העין, ולכן שגיאות שבירה, מווסתות באופן מקומי5. ה-RPE ממלא תפקיד מפתח כממסר אותות, המקשר בין הרשתית, המקור המשוער של אותות מודולריים לגדילה, לכורואיד ולסקלרה, שתי המטרות של האותות המועברים 6,7,8.

העלייה באורך הציר המאפיינת את רוב קוצר הראייה אינה יכולה להיחשב שפירה, כאשר שינויים פתופיזיולוגיים המערבים את הרשתית, כורואיד ו / או סקלרה מייצגים תוצאות בלתי נמנעות וכעת מוכרות היטב של התארכות עיניים מוגזמת 7,9. בהקשר זה, RPE הוא אולי הפגיע ביותר, שכן, בהיותה רקמה לא מיטוטית, היא מסוגלת להכיל רק את חדר הזגוגית המתרחב על ידי מתיחה ודילול של תאים בודדים. בעוד שתפקידו בפתולוגיות הקשורות לקוצר ראייה, כגון ניוון מקולרי קוצר ראייה, עדיין לא הובן במלואו, RPE היה מעורב בפתוגנזה של מספר מחלות רשתית אחרות, כולל ניוון גיאוגרפי, אחד הגורמים המובילים לעיוורון, הקשור להפרעות מתועדות ברשתית, RPE, וכורואיד10,11, 12.

הבידוד המוצלח של תאי RPE, ללא זיהום מרקמות עיניים סמוכות, עשוי לפתוח הזדמנויות מחקר רבות להשגת תובנות חדשות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מגוון מחלות עיניים/רשתית. עם זאת, הבידוד של RPE הוכח כמאתגר, כאשר מחקרים רבים שפורסמו עשו שימוש בדגימות רשתית / RPE משולבות או RPE / כורואיד מסיבה זו13,14,15. מחקרים הכרוכים בבידוד מוצלח של RPE באיכות המתאימה ללימודי ביולוגיה מולקולרית הוגבלו לעיני אפרוחים ועכבר16,17. לדוגמה, שיטת בידוד RPE וייצוב RNA בו זמנית (SRIRS) שתוארה על ידי וואנג ואחרים 18. כדי לבודד תאי RPE בעכברים לא נראה לעבוד טוב בעיני שרקן. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג חידוד של גישה שבתחילה יוצרה אבטיפוס עם עיני חורש עצים על ידי אחד המחברים (M.F.) והוכחה כמניבה דגימות RPE באיכות גבוהה, המתאימות לניתוח RNA וביולוגיה מולקולרית אחרת, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט19.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים והטיפולים ששימשו במחקר זה תאמו את הצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בברקלי.

1. חינוך עין השרקן

  1. המתת חסד של שרקן עם הזרקה תוך לבבית של נתרן pentobarbital מועבר תחת הרדמה (5% isoflurane בחמצן).
  2. לחנך את העיניים בעזרת מלקחיים ומספריים, ומיד להעביר אותם לצלחת פטרי 10 ס"מ עם מלח סטרילי פוספט חוצץ (PBS) לשטיפה. העבירו את העיניים לתמיסת PBS טרייה.
    הערה: צלחת 6 בארות המכילה 4 מ"ל תמיסה לכל באר מומלצת.

2. בידוד של העין האחורית העין וקומפלקס RPE/כורואיד/סקלרה

  1. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, השתמשו במחט 18G כדי לבצע חתך קטן ראשוני בסקלרה, בערך 1.0 מ"מ מאחורי גבול הגפיים (כלומר, בין הקרנית לסקלרה) (איור 1A); לאחר מכן השתמש במספריים כדי להסיר את החלק הקדמי, כולל הקרנית, הקשתית, הגוף הריסי והעדשה הגבישית.
  2. לאחר מכן, בעבודה עם העין הנותרת של מקטע העין האחורי, לנתק את הרשתית מקומפלקס RPE/choroid/sclera; השתמשו במלקחיים כדי לתפוס תחילה ואז למשוך בעדינות בזונולה של, ואז לקלף בהדרגה את הרשתית ללא פיצול (איור 1B).
    הערה: אין לתפוס את הרשתית ישירות כדי למנוע פיצול רשתית ובידוד רקמת רשתית חלקי. השימוש במיקרוסקופ חיוני לשלב דיסקציה זה.

3. בידוד RPE מהכורואיד

  1. לאחר הסרת הרשתית לחלוטין, טבלו את העין האחורית הנותרת, הכוללת את RPE, כורויד וסקלרה, בריאגנט אחסון רקמות למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים).
    הערה: השתמש בצלחת של 12 בארות עם בארות מזוהות, שכל אחת מהן מלאה ב- 2 מ"ל של מגיב אחסון הרקמות.
  2. מעבירים את העין לבאר אחרת מלאה ב-4 מ"ל PBS למשך 10 שניות לפני שמעבירים אותה לבאר שלישית מלאה ב-2 מ"ל PBS.
  3. חבר מחט 30 גרם למזרק 1 מ"ל מלא PBS לשלב הבידוד הסופי של RPE. לדחוף בעדינות על המזרק כדי ליצור זרם סילון של PBS; ראשית, כוונו את הזרם הזה אל ה-RPE כדי ליצור בו קרע קטן או חור, ואז כוונו את זרם PBS לתוך הפתח שנוצר כדי לנתק את ה-RPE כיריעה מהכורואיד (איור 1C).
    הערה: הניתוק של RPE כגיליון מניב את מדגם RPE הגדול ביותר. שוב, השימוש במיקרוסקופ חיוני לשלב זה.
  4. לאחר ניתוק ה-RPE מהכורואיד (איור 1D), אספו את רקמת ה-RPE במזרק 1 מ"ל ללא מחט, ולאחר מכן העבירו את הדגימה שנאספה לצינור של 1.5 מ"ל.
  5. צנטריפוגה את הצינור בנפח 1.5 מ"ל עם RPE שנאסף ב-8,000 × גרם למשך דקה אחת כדי לקבל גלולת RPE (איור 2A).
  6. השליכו את תמיסת PBS והחליפו אותה ב-350 מ"ל של חיץ ליזיס, כפי שנכלל בערכות בידוד RNA (ראו טבלת חומרים); פיפטה 20x לערבב, ובכך לשמור על איכות המדגם. לאחסון ושימור לטווח ארוך יותר, העבירו את הדגימות למקפיא בטמפרטורה של 80°C-.
    הערה: מאגר הליזה הוא רכיב קנייני של ערכת בידוד RNA עבור ליזה של תאים ורקמות לפני בידוד RNA ובידוד RNA/DNA/חלבון בו זמנית. כדי להשבית את הרנ"א בליזט, הקפד להוסיף β-מרקפטואתנול למאגר הליזיס (10 מיקרוליטר של β-מרקפטואתנול לכל 1 מ"ל של חיץ ליזיס).

4. מיצוי RPE-RNA

  1. השתמש בערכת בידוד RNA (ראה טבלת חומרים) כדי לבודד ולאסוף את הרנ"א מדגימות RPE בהתאם להוראות היצרן שסופקו. להעריך את איכות הדגימה באמצעות אלקטרופורזה.
    הערה: הפרוטוקול המתואר הניב מוצר באיכות טובה (כלומר, מספר שלמות RNA [RIN] מעל 8.0).

תוצאות

ניתוח דגימות RPE שנאספו באמצעות הפרוטוקול לעיל הראה רנ"א שמור היטב (RIN >8.0, איור 2B), עם 240.2 ננוגרם ± 35.1 ננוגרם לעין (n = 8, NanoDrop, איור 2B). כדי להעריך עוד יותר את איכות דגימות ה-RPE המבודדות, ובמיוחד את היעדר המזהמים הכורואידיים והסקלרליים, בחנו את ביטוי הגנים המייצגים ?...

Discussion

במאמר זה נתאר שיטה לבידוד RPE, המתאימה לניתוח ביטוי גנים של RPE, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנטים. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא מניב דגימות RPE באיכות גבוהה שהן יחסית חופשיות מזיהום, עם RNA שנשמר כראוי לניתוחים ספציפיים ל-RNA, ועם זאת, הוא פשוט ויעיל יחסית. בעוד שבדוגמה המובאת כאן, דגימות RPE...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע בחו"ל (S.G.), חוקר פוסט-דוקטורט ע"ש לוריס ודייוויד ריץ' (S.G.), ומענק מהמכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומיים לבריאות (R01EY012392; סי' פ"ו).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Syringe with Slip TipBd Vacutainer Labware Medical22-253-260
2-MercaptoethanolInvitrogen21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterilepectrum Chemical Mfg. Corp970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, SterileThomas Scientific LLC1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzerautomated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt SolutionsGibco10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cmFine Science Tools, Inc.11083-07
Dumont forceps no. 5ROBOZRS-5045
Hypodermic disposable needlesExelint International, Co.26419
Hypodermic disposable needlesExelint International, Co.26437
MiniSpin MicrocentrifugesEppendorf540108Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization SolutionInvitrogenAM7020tissue storage reagent
RNeasy Mini kitsQiagen74104RNA isolation kit
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools, Inc.91500-09

References

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
  3. Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
  4. Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
  5. Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
  6. Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
  7. Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
  8. Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
  9. Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
  10. Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
  11. McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
  12. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  13. Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
  14. Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
  15. He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
  16. Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
  17. Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
  18. Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
  19. Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
  20. De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
  21. Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
  22. Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
  23. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved