Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias

Resumen

Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes para su posible aplicación en estudios de biología molecular, incluidos los análisis de expresión génica. En el contexto de la regulación del crecimiento ocular y la miopía, el EPR probablemente desempeña un papel como un relé celular para las señales moduladoras del crecimiento, ya que se encuentra entre la retina y las dos paredes del ojo, como la coroides y la esclerótica. Si bien se han desarrollado protocolos para aislar el EPR tanto para polluelos como para ratones, estos protocolos han demostrado no ser directamente traducibles al conejillo de indias, que se ha convertido en un modelo de miopía de mamíferos importante y ampliamente utilizado. En este estudio, se utilizaron herramientas de biología molecular para examinar la expresión de genes específicos para confirmar que las muestras estaban libres de contaminación de los tejidos adyacentes. El valor de este protocolo ya se ha demostrado en un estudio RNA-Seq de EPR de conejillos de indias pigmentados jóvenes expuestos a un desenfoque óptico inductor de miopía. Más allá de la regulación del crecimiento ocular, este protocolo tiene otras aplicaciones potenciales en estudios de enfermedades de la retina, incluida la maculopatía miópica, una de las principales causas de ceguera en miopes, en la que se ha implicado el EPR. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente simple y una vez perfeccionada, produce muestras de EPR de alta calidad adecuadas para estudios de biología molecular, incluido el análisis de ARN.

Introducción

El EPR comprende una monocapa única de células pigmentadas ubicadas entre la retina neural y la coroides vascular, y el EPR tiene funciones bien reconocidas en el desarrollo y mantenimiento de la función normal de la retina, incluida la fototransducción ^1,2. Más recientemente, al EPR se le ha asignado un papel clave adicional en la regulación del crecimiento ocular³ y, por lo tanto, en el desarrollo de la miopía⁴. Esta asignación se basa en la ubicación crítica del EPR, interpuesta entre la retina y la coroides y la ahora amplia aceptación de que el crecimiento ocular y, por lo tanto, los errores refractivos están regulados localmente⁵. Se cree que el EPR desempeña un papel clave como relé de señal, vinculando la retina, la fuente asumida de señales moduladoras del crecimiento, con la coroides y la esclerótica, los dos objetivos de las señales transmitidas ^6,7,8.

El aumento de la longitud axial que caracteriza a la mayoría de la miopía no puede considerarse benigno, con cambios fisiopatológicos que involucran retina, coroides y/o esclerótica que representan consecuencias inevitables y ahora bien reconocidas del alargamiento ocular excesivo ^7,9. En este contexto, el EPR es quizás el más vulnerable, ya que, al ser un tejido no mitótico, solo puede acomodar la cámara vítrea en expansión mediante el estiramiento y adelgazamiento de células individuales. Si bien su papel en las patologías relacionadas con la miopía, como la degeneración macular miópica, aún no se comprende completamente, el EPR se ha implicado en la patogénesis de una serie de otras enfermedades de la retina, incluida la atrofia geográfica, una de las principales causas de ceguera, que se asocia con anomalías documentadas en la retina, el EPR y la coroides^{10,11, 12}.

El aislamiento exitoso de las células del EPR, libres de contaminación de los tejidos oculares adyacentes, abre potencialmente muchas oportunidades de investigación para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a una variedad de enfermedades oculares / retinianas. Sin embargo, el aislamiento del EPR ha demostrado ser un desafío, con muchos estudios publicados que utilizan muestras combinadas de retina/EPR o EPR/coroides por esta razón^13,14,15. Los estudios que implican el aislamiento exitoso del EPR de una calidad adecuada para estudios de biología molecular se han limitado a ojos de pollo y ratón^16,17. Por ejemplo, el método simultáneo de aislamiento de EPR y estabilización de ARN (SRIRS) descrito por Wang et ^al.18. Aislar las células del EPR en ratones no parece funcionar bien en los ojos de conejillo de indias. El protocolo descrito aquí representa un refinamiento de un enfoque que fue inicialmente prototipado con ojos de musaraña de árbol por uno de los autores (M.F.) y ha demostrado producir muestras de EPR de alta calidad, apropiadas para ARN y otros análisis de biología molecular, de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes¹⁹.

Protocolo

Todos los cuidados y tratamientos con animales utilizados en este estudio se ajustaron a la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Berkeley.

1. Enucleación del ojo de cobaya

1. Eutanasia a un conejillo de indias con una inyección intracardíaca de pentobarbital sódico administrada bajo anestesia (isoflurano al 5% en oxígeno).
2. Enuclear los ojos con la ayuda de fórceps y tijeras, e inmediatamente transferirlos a una placa de Petri de 10 cm con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para lavar. Transfiera los ojos a una solución fresca de PBS.
   NOTA: Se recomienda una placa de 6 pocillos que contenga 4 ml de solución por pocillo.

2. Aislamiento de la copa ocular posterior y del complejo EPR/coroides/esclerótica

1. Con la ayuda de un microscopio de disección, use una aguja de 18 G para hacer una pequeña incisión inicial en la esclerótica, aproximadamente 1.0 mm detrás del límite limbal (es decir, entre la córnea y la esclerótica) (Figura 1A); Luego use tijeras para extirpar el segmento anterior, incluyendo la córnea, el iris, el cuerpo ciliar y el cristalino.
2. A continuación, trabajando con la copa ocular del segmento ocular posterior restante, separe la retina del complejo RPE/coroides/esclerótica; usar fórceps para agarrar primero y luego tirar suavemente de la zonula de Zinn y luego pelar progresivamente la retina sin fragmentación (Figura 1B).
   NOTA: La retina no debe ser agarrada directamente para evitar la fragmentación de la retina y el aislamiento incompleto del tejido retiniano. El uso de un microscopio es esencial para este paso de disección.

3. Aislamiento del EPR de la coroides

1. Después de que la retina se haya extirpado por completo, sumerja la copa ocular posterior restante, que incluye el EPR, la coroides y la esclerótica, en un reactivo de almacenamiento de tejido durante 5 minutos (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Use una placa de 12 pocillos con pocillos identificados, cada uno lleno con 2 ml del reactivo de almacenamiento de tejido.
2. Transfiera la copa ocular a otro pozo lleno con 4 ml de PBS durante 10 s antes de moverlo a un tercer pocillo lleno con 2 ml de PBS.
3. Conecte una aguja de 30 G a una jeringa de 1 ml llena de PBS para el paso final de aislamiento del EPR. Empuje suavemente la jeringa para crear una corriente en chorro de PBS; primero, apunte esta corriente al EPR para hacer un pequeño desgarro o agujero en él, y luego dirija el flujo de PBS hacia la abertura creada para separar el EPR como una hoja de la coroides (Figura 1C).
   NOTA: El desprendimiento del EPR como una hoja produce la muestra más grande del EPR. Una vez más, el uso de un microscopio es esencial para este paso.
4. Después de separar el EPR de la coroides (Figura 1D), recoja el tejido del EPR en una jeringa sin aguja de 1 ml y luego transfiera la muestra recolectada a un tubo de 1,5 ml.
5. Centrifugar el tubo de 1,5 ml con el EPR recogido a 8.000 × g durante 1 minuto para obtener un pellet de EPR (Figura 2A).
6. Deseche la solución de PBS y reemplácela con 350 ml de tampón de lisis, como se incluye en los kits de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales); pipetear 20x para mezclar y, así, preservar la calidad de la muestra. Para un almacenamiento y conservación a largo plazo, transfiera las muestras a un congelador de -80 °C.
   NOTA: El tampón de lisis es un componente patentado del kit de aislamiento de ARN para la lisis celular y tisular antes del aislamiento de ARN y el aislamiento simultáneo de ARN/ADN/proteína. Para inactivar las ARNas en el lisado, asegúrese de agregar β-mercaptoetanol al tampón de lisis (10 μL de β-mercaptoetanol por 1 ml de tampón de lisis).

4. Extracción de RPE-ARN

1. Use un kit de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales) para aislar y recolectar el ARN de las muestras de EPR siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Evaluar la calidad de la muestra mediante electroforesis.
   NOTA: El protocolo descrito produjo un producto de buena calidad (es decir, número de integridad de ARN [RIN] superior a 8.0).

Resultados

El análisis de las muestras de EPR recogidas utilizando el protocolo anterior mostró ARN bien conservado (RIN >8,0, Figura 2B), con 240,2 ng ± 35,1 ng por ojo (n = 8, NanoDrop, Figura 2B). Para evaluar aún más la calidad de las muestras aisladas de EPR, particularmente la ausencia de contaminantes coroideos y esclerales, examinamos la expresión de genes representativos para cada uno de estos últimos tejidos en las muestras de EPR¹⁹...

Discusión

En este artículo, describimos un método para aislar el EPR, apropiado para los análisis de expresión génica del EPR, de los ojos de conejillos de indias jóvenes y pigmentados. Los méritos de este protocolo son que produce muestras de EPR de alta calidad que están relativamente libres de contaminación, con ARN adecuadamente preservado para análisis específicos de ARN y, sin embargo, es relativamente simple y eficiente. Mientras que en el ejemplo proporcionado aquí, las muestras de EPR se recolectaron de los oj...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe with Slip Tip	Bd Vacutainer Labware Medical	22-253-260
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile	pectrum Chemical Mfg. Corp	970-95008
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile	Thomas Scientific LLC	1198D72
Agilent 2100 Bioanalyzer			automated electrophoresis to check RNA quality
Balanced Salt Solutions	Gibco	10010031
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm	Fine Science Tools, Inc.	11083-07
Dumont forceps no. 5	ROBOZ	RS-5045
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26419
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26437
MiniSpin Microcentrifuges	Eppendorf	540108	Max. Speed: 8,000 g
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020	tissue storage reagent
RNeasy Mini kits	Qiagen	74104	RNA isolation kit
Student Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools, Inc.	91500-09