从植物组织中纯化活性光系统 I-Light Harvesting Complex I

摘要

该协议描述了从植物组织中分离光系统 I （PSI） - 光收集复合物 I （LHCI）。PSI 和 PSII 负责在含氧光合自养生物中将光转化为化学能，量子效率为 ~1，使其成为研究光驱动能量转移的目标。

摘要

这种方法用于将光系统 I （PSI） 与其天然天线光收集复合物 I （LHCI） 一起从植物中分离出来。PSI-LHCI 是一种大型膜蛋白复合物，协调数百种光捕获和电子传输因子，是自然界中发现的最高效的光捕获系统。构成 LHCI 的四种 LHCA 天线蛋白吸收的光子通过激子相互作用转移到 PSI 核心反应中心，并用于促进光驱动电荷分离穿过类囊体膜，为光合自养生物中的碳固定提供还原能力和能量。PSI 的高量子效率使该复合物成为研究光驱动能量转移的优秀模型。在该方案中，植物组织被机械匀浆，并通过过滤和离心将叶绿体与大量细胞碎片分离。然后渗透裂解分离的叶绿体，通过离心回收类囊体膜，并使用去污剂 n-十二烷基-β-麦芽糖苷溶解。将溶解的材料加载到阴离子交换柱上，以收集大多数含叶绿素的复合物。从溶液中沉淀出较大的复合物，以小体积重悬，并加载蔗糖梯度以分离主要的含叶绿素复合物。对所得蔗糖梯度级分进行表征，以识别含有 PSI-LHCI 的目标条带。该方案与植物 PSI-LHCI 结晶中使用的方案高度相似，但有一些简化，并依赖于 Nathan Nelson 实验室多年来开发的方法。

引言

含氧光合作用是我们星球上最重要的化学反应之一。光到化学能的转化发生在两个光系统的反应中心，即光系统 I （PSI） 和光系统 II （PSII）¹（图 1A）。PSI 是一种大型、高度保守的多亚基色素-蛋白质复合物，进化于 35 亿年前 ^2,3。这种复合物包含大约 100 个叶绿素分子和大约 20 个类胡萝卜素，有助于电子穿过类囊体膜从质体蓝蛋白转移到铁氧还蛋白，作为光合电子传递链的末端电子受体 ^1,4,5（图 1B、C).在植物中，这种光驱动的电荷分离是光能从 PSI 核心天线色素和光收集复合物 I （LHCI） 的外周天线色素转移到 PSI 反应中心的结果（图 1D）。LHCI 是类囊体膜内的 PSI 特异性天线复合物，由四个结合 LHCA 天线蛋白的叶绿素 a/b 组成 ^6,7。

图 1：光合电子传递链和 PSI-LHCI 复合物的整体结构。（A） 光合电子传递链包含四个主要的膜结合光合复合物和三个可溶性电子载体。通过传输链的电子流（红色箭头）和质子泵（黑色箭头）进入管腔用于产生还原力 （NADPH） 并产生用于碳固定的 ATP 37,38,39,40。使用 Biorender.com 创建。（B） 从管腔侧看植物 PSI-LHCI 的结构。PsaA 和 PsaB 是 PSI 的最大亚基，构成了复合物的核心。LHCI 是与 PSI 相关的光捕获天线复合物，由四个触角 LHCA1-4 组成。（C） PSI-LHCI 复合物协调超过 150 个配体。这里显示的是叶绿素（绿色）、类胡萝卜素（粉红色）、醌类（紫色）、脂质（橙色）和黄色/橙色反应中心的 FeS 簇。（D） PSI 的反应中心分为两个分支（A 和 B），从 P700 开始，反应中心特殊叶绿素对，进入两个辅助叶绿素 （_A-1A/B），然后是另一对叶绿素 （A_0A/B）。这些叶绿素在每个分支中紧随一个叶绿醌（在某些出版物中为 A_1A/B 或 Q_A/B），然后在铁硫簇 F_x 处连接在一起，然后是另外两个簇，F_A 和 F_B，由 PsaC 亚基协调。请单击此处查看此图的较大版本。

1966 年首次从植物中分离出 PSI，揭示了 PSI 和 PSII 之间光捕获色素含量的差异，表明 PSI 相对于 PSII 高度富含 β-胡萝卜素，并且细胞色素 f 和 b₆（细胞色素 b₆f 复合物的一部分）与 PSI 不紧密结合，而是在类囊体膜内松散结合⁸.九年后，通过 SDS 处理分离的 PSI 部分变性，结果表明小 PSI 亚基的解离猝灭了 PSI 的 NADP+ 光还原，而 P700 信号和大部分叶绿素保留在剩余的大分子量 PSI 颗粒内，确定了 PSI 的一些小亚基对全部生物学功能的必要性以及 PSI 反应中心的位置⁹.关于 PSI 核心与 LHCI 之间关联的研究于 1980 年代初首次发表，当时观察到分离出含有不同比例叶绿素 A 与 P700 的不同大小的 PSI 物种，表明 PSI 与含有叶绿素的外周天线系统有关10,11,12,13。然而，直到 2003 年，植物 PSI 的第一个晶体结构才发表¹⁴。植物 PSI-LHCI 的晶体结构突出了植物 PSI 核心和蓝藻之间的显着守恒，并提供了植物 PSI 核心和 LHCI 天线内叶绿素排列的第一张图片，进一步了解植物 PSI-LHCI 复合物内的能量转移途径¹⁴。在过去的十年中，确定了更多的植物 PSI-LHCI 结构，为超级复合物的结构描述添加了原子水平细节 15,16,17,18,19。

PSI 不仅具有接近 1 的量子效率，而且拥有自然界中最大的负还原电位^20,21。全面了解 PSI-LHCI 及其特性对于理解光驱动的能量转移和将仿生解决方案应用于未来的光收集技术至关重要。为了进一步了解 PSI-LHCI 及其许多亚基如何实现如此有效的能量转换，分离用于研究的复合物必须是活性和完整的。该方案允许在这种活性状态下温和纯化复合物^22,23。

在这种方法中，植物组织被机械破坏，并且通过离心分离含有光合电子传递链的叶绿体。类囊体膜在低渗叶绿体裂解后分离，然后使用去污剂 n-十二烷基-β-麦芽糖苷 （β-DDM） 溶解。使用阴离子交换色谱分离溶解的含有叶绿素的膜复合物，并使用蔗糖梯度离心进一步分离 PSI-LHCI。从梯度中去除并通过光谱和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 进行表征后，可以制备复合物用于进一步实验。该程序用于从植物中纯化 PSI-LHCI 复合物，而无需使用任何亲和标签。只需稍作修改，它就可以适应于从其他生物体制备复合物，稳定替代 PSI 复合物或光合电子传递链的其他复合物。使用类似的方案获得适用于高分辨率结构分析的 PSI 复合物 23,24,25,26,27,28,29,30。

研究方案

1. 从菠菜叶制备类囊体膜

1. 在冰上工作，并在准备过程中尽可能避免暴露在光线下。如果保持高叶绿素浓度，则弱光环境就足够了，并且要注意尽可能多地覆盖样品。除非另有说明，否则在 4 °C 下执行所有离心步骤。
2. 用剪刀从菠菜叶 （500 g） 上去除茎，轻轻将叶子压入搅拌机中，并用冰冷的蔗糖、tricine、NaCl （STN） 缓冲液完全覆盖（表 1）。在 STN 缓冲液中将植物组织匀浆 10 秒 2 次（总共 20 秒），脉冲之间留出 10 秒以防止使用脉冲设置过热。
   注：缓冲液与叶子的典型比例是 1 L STN 缓冲液与 500 g 菠菜叶。
3. 将粗棉布层固定在一个大的冷藏烧杯或其他容器上，然后将混合的混合物倒入布中，从而通过八层粗棉布过滤细胞碎片。使用玻璃棒或勺子搅拌过滤器中的细胞碎片，使裂解物流过。
4. 通过以 1000 x g 离心 9 分钟从细胞裂解物中沉淀叶绿体。将叶绿体重悬于 1 L 低渗缓冲液中（表 1）。要重悬叶绿体，请在缓冲液中使用移液管或涡流叶绿体沉淀，然后转移到适当大小的组织研磨机或类似匀浆器中。
   注意：暴露于低渗溶液并在组织研磨机中重悬会裂解叶绿体。
5. 以 500 x g 离心 2 分钟以去除淀粉（收集为白色颗粒）。使用移液管或小画笔轻轻地将任何已沉淀的绿色材料重悬回上清液中，同时尽可能避免淀粉重悬。将溶液以 12,000 x g 离心 10 分钟以沉淀类囊体膜。
6. 使用移液管或小油漆刷将沉淀的膜重悬于最少量的高盐重悬缓冲液（表 1）中，仅足以重悬膜，并使用均质器进行均质化，如步骤 1.4 所示。以 8000 x g 离心 10 分钟。
7. 像以前一样重悬于最少量的 STN2 缓冲液中（表 1），仅足以重悬膜并使用紫外-可见分光光度计测量叶绿素含量。通过在 80% 丙酮溶液中以 1/1000 稀释样品并使用 Porra 等人的方法确定叶绿素浓度³¹。
8. 通过添加 STN2 缓冲液并均匀分装到两个或三个离心管中，调整至所需的叶绿素浓度，通常为 3 mg/mL。500 克叶子的预期产量约为 200 毫克叶绿素，但根据起始材料的状态预计会发生变化。在 -80 °C 下冷冻，直到准备好进行膜溶解。在此阶段冷冻的膜可稳定至少 6 个月。

2. 膜增溶

1. 用 β-DDM 溶解类囊体膜。从 10% β-DDM 原液中加入足够的去污剂，以达到 6：1 的 β-DDM 与叶绿素比例。在冰上孵育 30 分钟。每 5-10 分钟缓慢倒置试管数次，轻轻混合。
2. 使用超速离心机以 120,000 x g 离心 30 分钟，以去除不溶性物质。弃去沉淀并保存上清液以用于后续步骤。

3. 使用二乙氨基乙基 （DEAE） 柱洗脱

1. 使用 1.5 mL 柱床体积制备阴离子交换柱，用于溶解样品中的 1 mg 总叶绿素。准备色谱柱并在 4 °C 下运行。 将树脂倒入固定在环形支架上的柱中。在添加水或柱低盐缓冲液时让填料沉淀，以防止柱干涸。确保色谱柱没有气泡，并且顶部平坦且水平。
2. 使用两个柱体积 （CV） 的柱低盐缓冲液（表 1）洗涤柱，并将步骤 2.2 中的上清液加载到柱上。让上清液完全流入色谱柱，然后再继续。
3. 在 1 CV 的柱低盐缓冲液中洗涤柱。
4. 使用线性 NaCl 梯度和低盐和高盐柱缓冲液 （5-250 mM NaCl; 表 1）总体积为 6 CV（即，如果柱床体积为 30 mL，则使用 90 mL 低盐缓冲液和 90 mL 高盐缓冲液）。
   1. 用低盐和高盐缓冲液填充两个烧杯。将低盐缓冲液滴入色谱柱中，使用装满水的试管在高盐缓冲液和低盐缓冲液之间形成盐桥，使其逐渐混合。使用搅拌棒确保进入低盐缓冲液的高盐缓冲液在滴入色谱柱之前被混合。这确保了 NaCl 梯度是线性的。开始收集馏分。
5. 收集 4 mL 级分（对于从约 35 mg 叶绿素开始的典型实验），并合并在梯度的最后三分之一附近洗脱的深绿色级分（图 2A）。

4. 聚乙二醇 （PEG） 沉淀

1. 向混合的叶绿素级分中，缓慢加入PEG6000至终浓度为 8%。PEG 浓度可能略有不同;如果在达到 8 后没有看到沉淀，则以 2% 的增量增加 PEG 浓度，直到看到沉淀（溶液会变得浑浊）。
2. 以 3,214 x g 离心 5 分钟。完全弃去上清液;完全去除所有残留的 PEG 对于在下一步实现良好的溶解至关重要。将绿色沉淀重悬于 2-5 mL 柱后重悬缓冲液中（表 1）。
3. 为了验证类囊体是否已完全洗涤 PEG，将一小份重悬的材料在台式离心机中以 18,407 x g 在 4 °C 下旋转 5 分钟，以确保材料可溶。在这个阶段，小的绿色沉淀是可以接受的，但大多数（如果不是全部）叶绿素应保留在溶液中。保留可溶性馏分。

5. 蔗糖梯度的制备

1. 用蔗糖梯度缓冲液分五层（10%、15%、20%、25% 和 30% 层）制备 10%-30% 不连续的蔗糖梯度（表 1）。通过在多聚体离心管中小心地将蔗糖级分分层来组装蔗糖梯度，从 30% 层开始，到 10% 层结束。调整每一层的体积，使试管顶部有足够的顶部空间来加载所需体积的样品。
2. 将步骤 4.2 中的可溶性材料中的样品加载到蔗糖梯度中。将足够的样品等于 170 μg 叶绿素加载到一个试管中，将 420 μg 叶绿素加载到另一个试管中，以获得不同浓度的梯度，以评估每个条带的均匀性（图 3A）。
   注：添加的样品量是任意的，但通常约为 150 至 500 μg 叶绿素的范围是合适的。
3. 将梯度以 100,000 x g 离心 16 小时，以分离样品中的不同复合物。

6. 去除蔗糖组分和 PEG 沉淀

1. 离心后，从转子上去除梯度，并使用数码相机或手机拍摄试管的照片。用针头刺穿底部的试管，然后慢慢排空内容物，以分离馏分。在离心管中收集不同的含叶绿素级分。
   注：如果需要，可以将样品等分并冷冻以供后续分析。
2. 对于某些应用，需要去除蔗糖。要去除蔗糖，请使用 PEG 沉淀（或凝胶过滤）的第二步。将 PSI-LHCI 级分中的 NaCl 浓度调节至 120 mM，并添加 PEG6000 至终浓度为 10%。
3. 在台式离心机中，在 4 °C 下以 18,407 x g 离心样品 5 分钟。将绿色沉淀重悬于 30 mM Tricine-NaOH pH 8.0、50 mM NaCl 和 0.05% β-DDM 中。
4. 在台式离心机中，在 4 °C 下以 18,407 x g 离心样品 5 分钟，以确保所有材料都保持在溶液中。

7. 测量 PSI 的 P700 含量

注：该方法可用于快速测定 PSI。

1. 将样品稀释至 OD₆₈₀ 为 1-1.5，并在黑暗中与 10 mM 抗坏血酸孵育 1 小时以完全降低 P700。
2. 使用 UV-Vis 光谱仪测量样品的吸收光谱。以 0.50 nm 的数据间隔和 60 nm/min 的扫描速率测量仅 650 nm 至 750 nm 的吸光度，以检测 P700 含量。
3. 将样品暴露在强光下（350 μmol 光子/m²/s），并在曝光期间再次测量光谱。
4. 从光谱中减去暗光谱，以观察植物在 702 nm 左右的 P700 漂白。
5. 使用 700 nm 处的吸收和 64/mM/cm 的消光系数测定 P700 含量，如 Hiyama 和 Ke 32,33,34 中所述。
6. 使用 Porra 等人 ³¹ 中描述的方法测量总叶绿素量（叶绿素 A 和叶绿素 B）。使用这些浓度来确定叶绿素与 P700 的比率。

结果

该方案用于在三天内从植物组织中分离和表征活性 PSI-LHCI。PSI-LHCI 通过首先分离植物类囊体膜，然后用 β-DDM 溶解来纯化。膜制备阶段的典型产量是从 500 克叶子中获得 200 毫克叶绿素。这可能因使用的初始材料而异。

实验的第 2 天和第 3 天使用阴离子交换色谱和蔗糖梯度离心来分离类囊体膜内的不同蛋白质复合物。溶解和超速离心后，小的深色不溶?...

讨论

使用该方案，可以在其活性状态下纯化来自植物组织的 PSI-LHCI 复合物。这里使用了菠菜叶，但这些方法可以应用于各种植物的制剂^23,40。在所有情况下，在执行此协议时都必须小心，以保护复合物免受损坏。这种制备应在黑暗或绿光下，在冰上用预冷缓冲液进行，并且所有重悬步骤都应轻柔地进行。

在类?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Falcon tube	VWR	62406-200	Used for storing thylakoids
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cm	biorad	7374153
Cheesecloth grade 50, 100% cotton	Arkwright LLC	B07D1FZZMB	From Amazon
Glass rods	Millipore Sigma	BR135825	Any similar rod will suffice
Low profile 64 oz vitamix blender	Vitamix
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Open top polyallomer centrifugation tubes	Seton Scientific	5030
Optima XE Ultracentrifuge	beckman coulter	A94471
Polyethylene glycol 6,000	Hampton Research	HR2-533
Potter-Elvehjen Tissue Grinder, 30 ml.	WHEATON	358049
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
SW 40 Ti	beckman coulter	331301
TOYOPEARL DEAE-650C	Tosoh Bioscience	7988
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
β-DDM	Glycon - Biochemicals GmbH	D97002	Stored as 10% stocks at -20 °C