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Resumen

Este protocolo describe el aislamiento del Fotosistema I (PSI) - Complejo de Recolección de Luz I (LHCI) a partir de tejidos vegetales. PSI, junto con PSII, es responsable de la conversión de la luz en energía química en fotoautótrofos oxigenados y tiene una eficiencia cuántica de ~ 1, lo que lo convierte en un objetivo para el estudio de la transferencia de energía impulsada por la luz.

Resumen

Este método se utiliza para aislar el Fotosistema I (PSI) junto con el Complejo de Recolección de Luz I (LHCI), su antena nativa, de las plantas. PSI-LHCI es un gran complejo de proteínas de membrana que coordina cientos de factores de recolección de luz y transporte de electrones y es el sistema de recolección de luz más eficiente que se encuentra en la naturaleza. Los fotones absorbidos por las cuatro proteínas de la antena LHCA que componen el LHCI se transfieren a través de la interacción excitónica al centro de reacción del núcleo PSI y se utilizan para facilitar la separación de la carga impulsada por la luz a través de la membrana tilacoide, proporcionando potencia reductora y energía para la fijación de carbono en organismos fotoautótrofos. La alta eficiencia cuántica de PSI hace de este complejo un modelo excelente para estudiar la transferencia de energía impulsada por la luz. En este protocolo, el tejido vegetal se homogeneiza mecánicamente y los cloroplastos se separan de los desechos celulares a granel mediante filtración y centrifugación. A continuación, los cloroplastos aislados se lisan osmóticamente y las membranas tilacoides se recuperan mediante centrifugación y se solubilizan utilizando el detergente n-dodecil-beta-maltósido. El material solubilizado se carga en una columna de intercambio aniónico para recoger la mayoría de los complejos que contienen clorofila. Los complejos más grandes se precipitan de la solución, se resuspenden en un volumen pequeño y se cargan en gradientes de sacarosa para separar los principales complejos que contienen clorofila. Las fracciones del gradiente de sacarosa resultantes se caracterizan para identificar la banda de interés que contiene PSI-LHCI. Este protocolo es muy similar al protocolo utilizado en la cristalización de plantas PSI-LHCI con algunas simplificaciones y se basa en métodos desarrollados a lo largo de los años en el laboratorio de Nathan Nelson.

Introducción

La fotosíntesis oxigénica es una de las reacciones químicas más importantes de nuestro planeta. La conversión de la luz en energía química ocurre en los centros de reacción de dos fotosistemas, el fotosistema I (PSI) y el fotosistema II (PSII)1 (Figura 1A). PSI es un gran complejo pigmento-proteína de múltiples subunidades altamente conservado que evolucionó hace más de 3.500 millones de años 2,3. Este complejo, que contiene aproximadamente 100 moléculas de clorofila y alrededor de 20 carotenoides, facilita la transferencia de electrones a través de la membrana tilacoide de plastocianina a ferredoxina actuando como aceptor de electrones terminal de la cadena de transporte de electrones fotosintéticos 1,4,5 (Figura 1B, C). En las plantas, esta separación de carga impulsada por la luz es el resultado de la energía luminosa transferida tanto de los pigmentos de la antena del núcleo PSI como de los pigmentos de la antena periférica del complejo I de recolección de luz (LHCI) al centro de reacción PSI (Figura 1D). El LHCI es un complejo de antenas específico de PSI dentro de la membrana tilacoide compuesto por cuatro proteínas de antena LHCA de unión a clorofila a/b 6,7.

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Figura 1: La cadena de transporte de electrones fotosintéticos y la estructura general del complejo PSI-LHCI. (A) La cadena de transporte de electrones fotosintéticos contiene cuatro complejos fotosintéticos principales unidos a la membrana y tres transportadores de electrones solubles. El flujo de electrones (flechas rojas) a través de la cadena de transporte y el bombeo de protones (flechas negras) hacia el lumen se utilizan para crear potencia reductora (NADPH) y producir ATP para la fijación de carbono 37,38,39,40. Creado con Biorender.com. (B) La estructura de la planta PSI-LHCI desde el lado lumenal. PsaA y PsaB son las subunidades más grandes de PSI y comprenden el núcleo del complejo. El LHCI es el complejo de antenas recolectoras de luz asociado con PSI y está compuesto por cuatro antenas, LHCA1-4. (C) El complejo PSI-LHCI coordina más de 150 ligandos. Aquí se muestran las clorofilas (verde), los carotenoides (rosa), las quinonas (morado), los lípidos (naranja) y los grupos de FeS del centro de reacción en amarillo/naranja. (D) El centro de reacción de PSI se divide en dos ramas (A y B), a partir de P700, el par especial de clorofila del centro de reacción, que se convierte en dos clorofilas accesorias (A-1A / B) seguidas de otro par de clorofilas (A0A / B). Estas clorofilas son seguidas por una filoquinona (A1A/B o QA/B en algunas publicaciones) en cada rama antes de unirse en el grupo de hierro-azufre Fx, seguido de dos grupos más, FA y FB, coordinados por la subunidad PsaC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El primer aislamiento de PSI de plantas en 1966 arrojó luz sobre las diferencias en el contenido de pigmento de recolección de luz entre PSI y PSII, mostrando que PSI estaba altamente enriquecido en β-caroteno en relación con PSII y que los citocromos f y b6 (parte de los complejos de citocromo b6f) no están estrechamente unidos a PSI, sino vagamente asociados dentro de la membrana tilacoide8. Nueve años más tarde, con la desnaturalización parcial de PSI aislada mediante tratamiento con SDS, se demostró que la disociación de pequeñas subunidades de PSI apagó la fotorreducción de NADP+ por PSI, mientras que la señal P700 y la mayoría de las clorofilas permanecieron dentro de la partícula PSI de gran peso molecular restante, identificando la necesidad de algunas de las pequeñas subunidades de PSI para una función biológica completa y la ubicación del centro de reacción de PSI9. La investigación sobre la asociación entre el núcleo PSI y el LHCI se publicó por primera vez a principios de la década de 1980, cuando se observaron aislamientos de especies PSI de diferentes tamaños que contenían diferentes proporciones de clorofila A a P700, lo que sugiere la asociación de PSI con un sistema de antena periférica que contiene clorofila 10,11,12,13. Sin embargo, no fue hasta 2003 que se publicó la primera estructura cristalina de la planta PSI14. La estructura cristalina de la planta PSI-LHCI destacó la notable conservación entre el núcleo PSI de las plantas y las cianobacterias y proporcionó la primera imagen de la disposición de la clorofila dentro del núcleo PSI de la planta y la antena LKCI, lo que mejoró la comprensión de las vías de transferencia de energía dentro del complejo PSI-LHCI de la planta14. Durante la última década, se determinaron más estructuras PSI-LHCI de plantas, agregando detalles de niveles atómicos a la descripción estructural del supercomplejo 15,16,17,18,19.

PSI no solo tiene una eficiencia cuántica cercana a uno, sino que cuenta con el potencial de reducción más negativo en la naturaleza20,21. Una comprensión completa de PSI-LHCI y sus propiedades es esencial para comprender la transferencia de energía impulsada por la luz y aplicar soluciones bioinspiradas a la futura tecnología de recolección de luz. Para avanzar en esta comprensión de cómo PSI-LHCI y sus muchas subunidades pueden lograr una conversión de energía tan eficiente, los complejos aislados para el estudio deben estar activos y completos. Este protocolo permite la purificación suave del complejo en este estado activo22,23.

En este método, los tejidos vegetales se rompen mecánicamente y los cloroplastos que contienen la cadena de transporte de electrones fotosintéticos se aíslan por centrifugación. Las membranas tilacoides se separan después de la lisis hipotónica del cloroplasto y luego se solubilizan utilizando el detergente n-dodecil-beta-maltósido (β-DDM). Los complejos de membrana que contienen clorofila solubilizada se separan mediante cromatografía de intercambio aniónico y PSI-LHCI se separa aún más mediante centrifugación en gradiente de sacarosa. Después de la eliminación del gradiente y después de la caracterización tanto por espectroscopia como por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), el complejo puede prepararse para futuros experimentos. Este procedimiento se utiliza para purificar el complejo PSI-LHCI de plantas sin el uso de ninguna etiqueta de afinidad. Con pequeñas modificaciones, se puede adaptar para preparaciones del complejo de otros organismos, estabilizar complejos PSI alternativos u otros complejos de la cadena de transporte de electrones fotosintéticos. Se utilizaron protocolos similares para obtener el complejo PSI adecuado para el análisis estructural de alta resolución 23,24,25,26,27,28,29,30.

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Protocolo

1. Preparación de membranas tilacoides a partir de hojas de espinaca.

  1. Trabaje sobre hielo y evite la exposición a la luz siempre que sea posible en esta preparación. Un ambiente con poca luz es suficiente si se mantienen altas concentraciones de clorofila, y se tiene cuidado de mantener las muestras cubiertas tanto como sea posible. Realice todos los pasos de centrifugación a 4 °C a menos que se especifique lo contrario.
  2. Retire los tallos de las hojas de espinaca (500 g) con unas tijeras, presione suavemente las hojas en una licuadora y cúbralas completamente con sacarosa helada, tricina, tampón NaCl (STN) (Tabla 1). Homogeneizar el tejido vegetal en el tampón STN durante 10 s dos veces (20 s en total), dejando 10 s entre pulsos para evitar el sobrecalentamiento utilizando el ajuste de pulsos.
    NOTA: Una proporción típica de tampón a hojas es de 1 L de tampón STN por 500 g de hojas de espinaca.
  3. Filtre los restos de celda a través de ocho capas de gasa asegurando las capas de gasa sobre un vaso de precipitados grande y frío u otro recipiente y vertiendo la mezcla mezclada a través del paño. Use una varilla de vidrio o una cuchara para remover los restos de células en el filtro para permitir que el lisado fluya a través de él.
  4. Pellets de cloroplastos procedentes de la célula lisado por centrifugación a 1000 x g durante 9 min. Resuspender los cloroplastos en 1 L de tampón hipotónico (Tabla 1). Para resuspender los cloroplastos, utilice una pipeta o un gránulo de cloroplasto en forma de remolino en tampón y transfiéralo a un triturador de tejidos o a un homogeneizador similar del tamaño adecuado.
    NOTA: La exposición a la solución hipotónica y la resuspensión en un triturador de tejidos lisan los cloroplastos.
  5. Centrifugar durante 2 min a 500 x g para eliminar el almidón (recogido como una bolita blanca). Vuelva a suspender suavemente cualquier material verde que se haya granulado de nuevo en el sobrenadante con una pipeta o un pincel pequeño, evitando la resuspensión del almidón tanto como sea posible. Centrifugar la solución a 12.000 x g durante 10 min para pellet las membranas tilacoides.
  6. Vuelva a suspender las membranas peletizadas en cantidades mínimas del tampón de resuspensión con alto contenido de sal (Tabla 1), solo lo suficiente para resuspender las membranas, utilizando una pipeta o un pincel pequeño y homogeneizar utilizando un homogeneizador como en el paso 1.4. Centrífuga a 8000 x g durante 10 min.
  7. Vuelva a suspender como antes en cantidades mínimas de tampón STN2 (Tabla 1), solo lo suficiente para resuspender las membranas y medir el contenido de clorofila utilizando un espectrofotómetro UV-Vis. Determinar la concentración de clorofila diluyendo la muestra 1/1000 en solución de acetona al 80% y utilizando el método de Porra et al.31.
  8. Ajuste a una concentración de clorofila deseada, generalmente 3 mg / mL, agregando tampón STN2 y alícuota de manera uniforme en dos o tres tubos de centrífuga. El rendimiento esperado de 500 g de hojas es de alrededor de 200 mg de clorofila, pero se espera una variación basada en el estado del material de partida. Congelar a -80 °C hasta que esté listo para la solubilización de la membrana. Las membranas congeladas en esta etapa son estables durante al menos 6 meses.

2. Solubilización de membranas

  1. Solubilizar las membranas tilacoides con β-DDM. Agregue suficiente detergente de un 10% de β-DDM para lograr una proporción de β-DDM a clorofila de 6:1. Incubar en hielo durante 30 min. Mezcle suavemente cada 5-10 minutos invirtiendo lentamente el tubo varias veces.
  2. Centrifugar a 120.000 x g durante 30 min utilizando una ultracentrífuga para eliminar el material insoluble. Deseche el pellet y guarde el sobrenadante para los pasos posteriores.

3. Elución mediante columna de dietilaminoetilo (DEAE)

  1. Prepare la columna de intercambio aniónico utilizando un volumen de lecho de 1,5 mL para 1 mg de clorofila total en la muestra solubilizada. Prepare la columna y pásela a 4 °C. Vierte la resina en una columna asegurada a un soporte de anillo. Deje que la resina se asiente mientras agrega agua o un tampón de columna bajo en sal para evitar que la columna se seque. Asegúrese de que la columna esté libre de burbujas y que la parte superior esté plana y nivelada.
  2. Lave la columna utilizando dos volúmenes de columna (CV) de tampón de columna con bajo contenido de sal (Tabla 1) y cargue el sobrenadante del paso 2.2 en la columna. Deje que el sobrenadante corra completamente hacia la columna antes de continuar.
  3. Lave la columna en un CV de tampón de columna con bajo contenido de sal.
  4. Eluir utilizando un gradiente lineal de NaCl con los tampones de columna de baja y alta sal (5-250 mM de NaCl; Tabla 1) hecho en un volumen total de seis CV (es decir, si el volumen del lecho de la columna es de 30 mL, use 90 mL de tampón bajo en sal y 90 mL de tampón alto en sal).
    1. Llene dos vasos de precipitados con los tampones de sal baja y alta. Mientras gotea un tampón con bajo contenido de sal en la columna, cree un puente de sal entre los tampones de alta y baja sal utilizando un tubo lleno de agua para mezclarlos gradualmente. Utilice una barra agitadora para asegurarse de que el tampón con alto contenido de sal que se mueve hacia el tampón con bajo contenido de sal se mezcle antes de que se gotee en la columna. Esto garantiza que el gradiente de NaCl sea lineal. Empieza a recolectar fracciones.
  5. Recoja fracciones de 4 mL (para un experimento típico que comienza con aproximadamente 35 mg de clorofila) y combine las fracciones de color verde oscuro que eluyen alrededor del último tercio del gradiente (Figura 2A).

4. Precipitación de polietilenglicol (PEG)

  1. A las fracciones de clorofila combinadas, agregue lentamente PEG6000 hasta una concentración final del 8%. La concentración de PEG puede variar un poco; si no se observa precipitación después de alcanzar el 8%, aumente la concentración de PEG en incrementos del 2% hasta que se vea precipitación (la solución se volverá turbia).
  2. Centrifugar a 3.214 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante por completo; La eliminación completa de todo el PEG residual es esencial para lograr una buena solubilización en el siguiente paso. Vuelva a suspender el precipitado verde en 2-5 mL de tampón de resuspensión posterior a la columna (Tabla 1).
  3. Para verificar que los tilacoides se han lavado completamente de PEG, centrifugar una pequeña alícuota del material resuspendido en una centrífuga de sobremesa a 18.407 x g a 4 °C durante 5 minutos para asegurarse de que el material sea soluble. Un pequeño precipitado verde es aceptable en esta etapa, pero la mayoría, si no toda, la clorofila debe permanecer en la solución. Conservar la fracción soluble.

5. Preparación de gradientes de sacarosa

  1. Prepare gradientes discontinuos de sacarosa del 10% al 30% en cinco capas (capas de 10%, 15%, 20%, 25% y 30%) con tampón de gradiente de sacarosa (Tabla 1). Ensamble los gradientes de sacarosa colocando cuidadosamente las fracciones de sacarosa en un tubo de centrífuga de polialómero, comenzando con la capa del 30% y terminando con la capa del 10%. Ajuste el volumen de cada capa para que haya suficiente espacio libre en la parte superior del tubo para cargar el volumen deseado de muestra.
  2. Cargue muestras del material soluble del paso 4.2 en gradientes de sacarosa. Cargue suficiente muestra para igualar 170 μg de clorofila en un tubo y 420 μg de clorofila en otro para obtener gradientes a diferentes concentraciones para evaluar la homogeneidad de cada banda (Figura 3A).
    NOTA: La cantidad de muestra añadida es arbitraria, pero suele ser apropiado un intervalo de unos 150 a 500 μg de clorofila.
  3. Centrifugar los gradientes a 100.000 x g durante 16 h para separar los diferentes complejos dentro de la muestra.

6. Eliminación de fracciones de sacarosa y precipitación de PEG

  1. Después de la centrifugación, elimine los gradientes del rotor y tome fotografías de los tubos con una cámara digital o un teléfono celular. Aísle las fracciones perforando los tubos en la parte inferior con una aguja y luego drene lentamente el contenido. Recoja las diferentes fracciones que contienen clorofila en tubos de centrífuga.
    NOTA: Las muestras se pueden alícuota y congelar para su posterior análisis si se desea.
  2. Para algunas aplicaciones, es deseable la eliminación de la sacarosa. Para eliminar la sacarosa, use un segundo paso de precipitación PEG (o filtración en gel). Ajuste la concentración de NaCl en la fracción PSI-LHCI a 120 mM y agregue PEG6000 hasta una concentración final del 10%.
  3. Centrifugar la muestra en una centrífuga de sobremesa a 18.407 x g a 4 °C durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet verde en 30 mM de Tricine-NaOH pH 8,0, 50 mM de NaCl y 0,05% de β-DDM.
  4. Centrifugar la muestra en una centrífuga de sobremesa a 18.407 x g a 4 °C durante 5 minutos para asegurarse de que todo el material permanezca en solución.

7. Medición del contenido de P700 de PSI

NOTA: Este método se puede utilizar para analizar rápidamente la PSI.

  1. Diluir las muestras hasta un OD680 de 1-1,5 e incubar en la oscuridad con 10 mM de ácido ascórbico durante 1 h para reducir completamente el P700.
  2. Mida el espectro de absorción de la muestra utilizando un espectrómetro UV-Vis. Mida la absorbancia de solo 650 nm a 750 nm con un intervalo de datos de 0,50 nm y una velocidad de escaneo de 60 nm/min para analizar el contenido de P700.
  3. Exponga la muestra a luz brillante (350 μmoles de fotones/m2/s) y vuelva a medir el espectro durante la exposición.
  4. Reste el espectro oscuro del espectro de luz para observar el blanqueo de P700 a alrededor de 702 nm en las plantas.
  5. Determine el contenido de P700 utilizando la absorción a 700 nm y un coeficiente de extinción de 64/mM/cm como se describe en Hiyama y Ke 32,33,34.
  6. Medir la cantidad total de clorofila (clorofila A y clorofila B) utilizando el método descrito en Porra et al.31. Utilice estas concentraciones para determinar la relación entre la clorofila y P700.

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Resultados

Este protocolo se utiliza para aislar y caracterizar PSI-LHCI activo de tejidos vegetales durante tres días. El PSI-LHCI se purifica aislando primero las membranas tilacoides de las plantas, que luego se solubilizan con β-DDM. Los rendimientos típicos de la etapa de preparación de la membrana son 200 mg de clorofila a partir de 500 g de hojas. Esto puede variar en función del material inicial utilizado.

Los días dos y tres del experimento utilizan cromat...

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Discusión

Con este protocolo, el complejo PSI-LHCI a partir de tejidos vegetales puede purificarse en su estado activo. Aquí se utilizaban hojas de espinaca, pero estos métodos se pueden aplicar a preparaciones de diversas plantas23,40. En todos los casos, se debe tener cuidado al realizar este protocolo para proteger el complejo de daños. Esta preparación debe realizarse en la oscuridad o bajo una luz verde, sobre hielo con tampones p...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Y.M. agradece el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el Premio No. 2034021 y el Departamento de Energía de los Estados Unidos, Oficina de Ciencias, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, División de Ciencias Químicas, Geociencias y Biociencias bajo el Premio No. DE-SC0022956. C.G. cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF, por sus siglas en inglés) en virtud del Premio No. 00036806.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Falcon tubeVWR62406-200Used for storing thylakoids
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cmbiorad7374153
Cheesecloth grade 50, 100% cottonArkwright LLCB07D1FZZMBFrom Amazon
Glass rodsMillipore SigmaBR135825Any similar rod will suffice
Low profile 64 oz vitamix blenderVitamix
NaClSigma-AldrichS7653
Open top polyallomer centrifugation tubesSeton Scientific5030
Optima XE Ultracentrifugebeckman coulterA94471
Polyethylene glycol 6,000Hampton ResearchHR2-533
Potter-Elvehjen Tissue Grinder, 30 ml.WHEATON358049
SucroseSigma-AldrichS7903
SW 40 Tibeckman coulter331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
β-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002Stored as 10% stocks at -20 °C

Referencias

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