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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo descreve o isolamento do Fotossistema I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) de tecidos vegetais. O PSI, juntamente com o PSII, é responsável pela conversão de luz em energia química em fotoautotróficos oxigenados e tem uma eficiência quântica de ~ 1, tornando-o um alvo para estudar a transferência de energia impulsionada pela luz.

Resumo

Este método é usado para isolar o Fotossistema I (PSI) junto com o Complexo de Colheita de Luz I (LHCI), sua antena nativa, das plantas. PSI-LHCI é um grande complexo de proteínas de membrana que coordena centenas de fatores de coleta de luz e transporte de elétrons e é o sistema de coleta de luz mais eficiente encontrado na natureza. Os fótons absorvidos pelas quatro proteínas da antena LHCA que compõem o LHCI são transferidos por meio de interação excitônica para o centro de reação do núcleo PSI e são usados para facilitar a separação de carga acionada por luz através da membrana tilacóide, fornecendo potência e energia redutoras para fixação de carbono em organismos fotoautotróficos. A alta eficiência quântica do PSI torna este complexo um excelente modelo para estudar a transferência de energia impulsionada pela luz. Neste protocolo, o tecido vegetal é homogeneizado mecanicamente e os cloroplastos são separados dos detritos celulares a granel por filtração e centrifugação. Os cloroplastos isolados são então lisados osmoticamente e as membranas dos tilacóides são recuperadas por centrifugação e solubilizadas usando o detergente n-dodecil-beta-maltosídeo. O material solubilizado é carregado em uma coluna de troca aniônica para coletar a maioria dos complexos contendo clorofila. Complexos maiores são precipitados da solução, ressuspensos em um pequeno volume e carregados em gradientes de sacarose para separar os principais complexos contendo clorofila. As frações de gradiente de sacarose resultantes são caracterizadas para identificar a banda de interesse contendo PSI-LHCI. Este protocolo é altamente semelhante ao protocolo usado na cristalização da planta PSI-LHCI com algumas simplificações e se baseia em métodos desenvolvidos ao longo dos anos no laboratório de Nathan Nelson.

Introdução

A fotossíntese oxigenada é uma das reações químicas mais importantes do nosso planeta. A conversão da luz em energia química ocorre nos centros de reação de dois fotossistemas, fotossistema I (PSI) e fotossistema II (PSII)1 (Figura 1A). PSI é um complexo pigmento-proteína grande e altamente conservado que evoluiu há mais de 3,5 bilhões de anos 2,3. Este complexo, que contém aproximadamente 100 moléculas de clorofila e cerca de 20 carotenóides, facilita a transferência de elétrons através da membrana tilacóide da plastocianina para a ferredoxina, atuando como o aceptor terminal de elétrons da cadeia fotossintética de transporte de elétrons 1,4,5 (Figura 1B, C). Nas plantas, essa separação de carga acionada por luz é o resultado da energia luminosa transferida dos pigmentos da antena central PSI e dos pigmentos periféricos da antena do complexo I de coleta de luz (LHCI) para o centro de reação PSI (Figura 1D). O LHCI é um complexo de antena específico do PSI dentro da membrana do tilacóide composto por quatro proteínas de antena LHCA de ligação à clorofila a / b 6,7.

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Figura 1: A cadeia de transporte de elétrons fotossintéticos e a estrutura geral do complexo PSI-LHCI. (A) A cadeia de transporte de elétrons fotossintéticos contém quatro complexos fotossintéticos principais ligados à membrana e três portadores de elétrons solúveis. O fluxo de elétrons (setas vermelhas) através da cadeia de transporte e o bombeamento de prótons (setas pretas) para o lúmen são usados para criar poder redutor (NADPH) e produzir ATP para fixação de carbono 37,38,39,40. Criado com Biorender.com. (B) A estrutura da planta PSI-LHCI do lado luminal. PsaA e PsaB são as maiores subunidades do PSI e compreendem o núcleo do complexo. O LHCI é o complexo de antenas coletoras de luz associado ao PSI e é composto por quatro antenas, LHCA1-4. (C) O complexo PSI-LHCI coordena mais de 150 ligantes. Aqui são mostradas clorofilas (verde), carotenóides (rosa), quinonas (roxo), lipídios (laranja) e os aglomerados de FeS do centro de reação em amarelo / laranja. (D) O centro de reação do PSI é dividido em dois ramos (A e B), começando em P700, o par de clorofila especial do centro de reação, indo para duas clorofilas acessórias (A-1A / B) seguidas por outro par de clorofilas (A0A / B). Essas clorofilas são seguidas por uma filoquinona (A1A / B ou QA / B em algumas publicações) em cada ramo antes de se unirem no cluster ferro-enxofre Fx, seguido por mais dois clusters, FA e FB, coordenados pela subunidade PsaC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O primeiro isolamento de PSI de plantas em 1966 lançou luz sobre as diferenças no conteúdo de pigmento coletor de luz entre PSI e PSII, mostrando que o PSI era altamente enriquecido em β-caroteno em relação ao PSII e que os citocromos f e b6 (parte dos complexos do citocromo b6f) não estão fortemente ligados ao PSI, mas fracamente associados dentro da membrana tilacóide8. Nove anos depois, com a desnaturação parcial de PSI isolada via tratamento com SDS, foi demonstrado que a dissociação de pequenas subunidades PSI extinguiu a fotorredução de NADP+ por PSI, enquanto o sinal P700 e a maioria das clorofilas permaneceram dentro da partícula PSI de grande peso molecular restante, identificando a necessidade de algumas das pequenas subunidades de PSI para função biológica completa e a localização do centro de reação PSI9. A pesquisa sobre a associação entre o núcleo PSI e o LHCI foi publicada pela primeira vez no início dos anos 1980, quando foram observados isolamentos de espécies PSI de tamanhos diferentes contendo diferentes proporções de clorofila A para P700, sugerindo a associação de PSI com um sistema de antena periférica contendo clorofila10 , 11 , 12 , 13 . No entanto, não foi até 2003 que a primeira estrutura cristalina da planta PSI foi publicada14. A estrutura cristalina da planta PSI-LHCI destacou a notável conservação entre o núcleo PSI das plantas e as cianobactérias e forneceu a primeira imagem do arranjo da clorofila dentro do núcleo PSI da planta e da antena LHCI, promovendo a compreensão das vias de transferência de energia dentro do complexo PSI-LHCI da planta14. Na última década, mais estruturas PSI-LHCI de plantas foram determinadas, adicionando detalhes de níveis atômicos à descrição estrutural do supercomplexo 15,16,17,18,19.

PSI não só tem uma eficiência quântica próxima a um, mas possui o potencial de redução mais negativo da natureza20,21. Uma compreensão completa do PSI-LHCI e suas propriedades é essencial para entender a transferência de energia movida a luz e aplicar soluções bioinspiradas à futura tecnologia de coleta de luz. Para aprofundar essa compreensão de como o PSI-LHCI e suas muitas subunidades podem alcançar uma conversão de energia tão eficiente, os complexos isolados para estudo devem ser ativos e inteiros. Esse protocolo permite a purificação suave do complexo nesse estado ativo22,23.

Neste método, os tecidos vegetais são mecanicamente interrompidos e os cloroplastos contendo a cadeia de transporte de elétrons fotossintéticos são isolados por centrifugação. As membranas tilacóides são separadas após a lise hipotônica do cloroplasto e são então solubilizadas usando o detergente n-dodecil-beta-maltosídeo (β-DDM). Os complexos de membrana contendo clorofila solubilizada são separados usando cromatografia de troca aniônica e PSI-LHCI é separado usando centrifugação de gradiente de sacarose. Após a remoção do gradiente e após a caracterização por espectroscopia e usando eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), o complexo pode ser preparado para novos experimentos. Este procedimento é usado para purificar o complexo PSI-LHCI de plantas sem o uso de quaisquer tags de afinidade. Com pequenas modificações, pode ser adaptado para preparações do complexo a partir de outros organismos, estabilizar complexos PSI alternativos ou outros complexos da cadeia fotossintética de transporte de elétrons. Protocolos semelhantes foram usados para obter o complexo PSI adequado para análise estrutural de alta resolução 23,24,25,26,27,28,29,30.

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Protocolo

1. Preparação de membranas tilacóides a partir de folhas de espinafre

  1. Trabalhe no gelo e evite a exposição à luz sempre que possível nesta preparação. Um ambiente com pouca luz é suficiente se altas concentrações de clorofila forem mantidas e se tomar cuidado para manter as amostras cobertas o máximo possível. Execute todas as etapas de centrifugação a 4 °C, salvo indicação em contrário.
  2. Remova os caules das folhas de espinafre (500 g) usando uma tesoura, pressione suavemente as folhas no liquidificador e cubra completamente com sacarose gelada, tricina, tampão NaCl (STN) (Tabela 1). Homogeneizar o tecido vegetal em tampão STN por 10 s duas vezes (total de 20 s), deixando 10 s entre os pulsos para evitar superaquecimento usando a configuração de pulso.
    NOTA: Uma proporção típica de tampão para folhas é de 1 L de tampão STN para 500 g de folhas de espinafre.
  3. Filtre os detritos das células através de oito camadas de gaze, prendendo as camadas de gaze sobre um copo grande e refrigerado ou outro recipiente e despejando a mistura misturada através do pano. Use uma haste ou colher de vidro para mexer os detritos celulares no filtro para permitir que o lisado flua.
  4. Cloroplastos de pellets do lisado celular por centrifugação a 1000 x g por 9 min. Ressuspenda os cloroplastos em 1 L de tampão hipotônico (Tabela 1). Para ressuspender os cloroplastos, use uma pipeta ou pellet de cloroplasto em redemoinho em tampão e transfira para um moedor de tecido ou um homogeneizador semelhante em um tamanho apropriado.
    NOTA: A exposição à solução hipotônica e ressuspensão em um moedor de tecido lisa os cloroplastos.
  5. Centrifugue por 2 min a 500 x g para remover o amido (coletado como um pellet branco). Ressuspenda suavemente qualquer material verde que tenha sido peletizado de volta ao sobrenadante usando uma pipeta ou um pincel pequeno, evitando ao máximo a ressuspensão do amido. Centrifugue a solução a 12.000 x g por 10 min para granular as membranas tilacóides.
  6. Ressuspenda as membranas peletizadas em quantidades mínimas do tampão de ressuspensão com alto teor de sal (Tabela 1), apenas o suficiente para ressuspender as membranas, usando uma pipeta ou pincel pequeno e homogeneizar usando um homogeneizador como na etapa 1.4. Centrifugue a 8000 x g por 10 min.
  7. Ressuspenda como antes em quantidades mínimas de tampão STN2 (Tabela 1), apenas o suficiente para ressuspender as membranas e medir o conteúdo de clorofila usando um espectrofotômetro UV-Vis. Determinar a concentração de clorofila diluindo a amostra 1/1000 em solução de acetona a 80% e utilizando o método de et al.31.
  8. Ajuste para uma concentração de clorofila desejada, normalmente 3 mg / mL, adicionando tampão STN2 e alíquota uniformemente em dois ou três tubos de centrífuga. O rendimento esperado de 500 g de folhas é de cerca de 200 mg de clorofila, mas é esperada variação com base no estado do material de partida. Congelar a -80 °C até estar pronto para a solubilização da membrana. As membranas congeladas nesta fase são estáveis por pelo menos 6 meses.

2. Solubilização de membrana

  1. Solubilizar membranas tilacóides com β-DDM. Adicione detergente suficiente de um estoque de 10% de β-DDM para atingir uma proporção de 6:1 β-DDM para clorofila. Incubar no gelo por 30 min. Misture delicadamente a cada 5-10 minutos, invertendo lentamente o tubo várias vezes.
  2. Centrifugue a 120.000 x g por 30 min usando uma ultracentrífuga para remover o material insolúvel. Descarte o pellet e guarde o sobrenadante para as etapas subsequentes.

3. Eluição em coluna de dietilaminoetilo (DEAE)

  1. Preparar a coluna de permuta aniónica com 1,5 ml de leito de volume para 1 mg de clorofila total na amostra solubilizada. Preparar a coluna e rodar a 4 °C. Despeje a resina em uma coluna presa a um suporte de anel. Deixe a resina assentar enquanto adiciona água ou tampão de sal com baixo teor de água para evitar que a coluna seque. Certifique-se de que a coluna esteja livre de bolhas e que o topo esteja plano e nivelado.
  2. Lave a coluna usando dois volumes de coluna (CV) de tampão de baixo teor de sal da coluna (Tabela 1) e carregue o sobrenadante da etapa 2.2 na coluna. Deixe o sobrenadante correr completamente para a coluna antes de prosseguir.
  3. Lave a coluna em um CV de tampão de coluna com baixo teor de sal.
  4. Eluir usando um gradiente linear de NaCl com os tampões de coluna de baixo sal e alto teor de sal (5-250 mM de NaCl; Tabela 1) em um volume total de seis CV (ou seja, se o volume do leito da coluna for de 30 mL, use 90 mL de tampão com baixo teor de sal e 90 mL de tampão com alto teor de sal).
    1. Encha dois copos com os tampões de sal baixo e alto. Enquanto pinga tampão de sal baixo na coluna, crie uma ponte de sal entre os tampões de sal alto e baixo usando um tubo cheio de água para misturá-los gradualmente. Use uma barra de agitação para garantir que o tampão com alto teor de sal que se move para o tampão com baixo teor de sal esteja sendo misturado antes de pingar na coluna. Isso garante que o gradiente de NaCl seja linear. Comece a coletar frações.
  5. Colete frações de 4 mL (para um experimento típico começando com cerca de 35 mg de clorofila) e combine as frações verde-escuras eluindo em torno do último terço do gradiente (Figura 2A).

4. Precipitação de polietilenoglicol (PEG)

  1. Às frações de clorofila combinadas, adicione lentamente PEG6000 até uma concentração final de 8%. A concentração de PEG pode variar um pouco; se a precipitação não for observada após atingir 8%, aumente a concentração de PEG em incrementos de 2% até que a precipitação seja observada (a solução ficará turva).
  2. Centrifugue a 3.214 x g por 5 min. Rejeitar completamente o sobrenadante; a remoção completa de todo o PEG residual é essencial para obter uma boa solubilização na próxima etapa. Ressuspenda o precipitado verde em 2-5 mL de tampão de ressuspensão pós-coluna (Tabela 1).
  3. Para verificar se os tilacóides foram completamente lavados com PEG, girar uma pequena alíquota do material ressuspenso em uma centrífuga de bancada a 18,407 x g a 4 ° C por 5 min para garantir que o material seja solúvel. Um pequeno precipitado verde é aceitável nesta fase, mas a maior parte, se não toda, a clorofila deve permanecer na solução. Conservar a fracção solúvel.

5. Preparação de gradientes de sacarose

  1. Prepare gradientes de sacarose descontínuos de 10% a 30% em cinco camadas (camadas de 10%, 15%, 20%, 25% e 30%) com tampão de gradiente de sacarose (Tabela 1). Monte os gradientes de sacarose colocando cuidadosamente as frações de sacarose em camadas em um tubo de centrífuga de polialômero, começando com a camada de 30% e terminando com a camada de 10%. Ajuste o volume de cada camada para que haja espaço suficiente na parte superior do tubo para carregar o volume desejado de amostra.
  2. Carregar amostras do material solúvel da etapa 4.2 em gradientes de sacarose. Carregue amostra suficiente para igualar 170 μg de clorofila em um tubo e 420 μg de clorofila em outro para obter gradientes em diferentes concentrações para avaliar a homogeneidade de cada banda (Figura 3A).
    NOTA: A quantidade de amostra adicionada é arbitrária, mas uma faixa de cerca de 150 a 500 μg de clorofila é geralmente apropriada.
  3. Centrifugar os gradientes a 100.000 x g durante 16 h para separar os diferentes complexos no interior da amostra.

6. Remoção de frações de sacarose e precipitação de PEG

  1. Após a centrifugação, remova os gradientes do rotor e tire fotos dos tubos usando uma câmera digital ou celular. Isole as fracções perfurando os tubos na parte inferior com uma agulha e, em seguida, drenando lentamente o conteúdo. Recolha as diferentes fracções contendo clorofila em tubos de centrifugação.
    NOTA: As amostras podem ser aliquotadas e congeladas para análise subsequente, se desejado.
  2. Para algumas aplicações, a remoção da sacarose é desejável. Para remover a sacarose, use uma segunda etapa de precipitação de PEG (ou filtração em gel). Ajustar a concentração de NaCl na fração PSI-LHCI para 120 mM e adicionar PEG6000 a uma concentração final de 10%.
  3. Centrifugue a amostra em uma centrífuga de bancada a 18.407 x g a 4 °C por 5 min. Ressuspenda o pellet verde em 30 mM Tricine-NaOH pH 8,0, 50 mM NaCl e 0,05% β-DDM.
  4. Centrifugue a amostra em uma centrífuga de bancada a 18.407 x g a 4 °C por 5 min para garantir que todo o material permaneça em solução.

7. Medindo o conteúdo P700 de PSI

NOTA: Este método pode ser usado para testar rapidamente o PSI.

  1. Diluir as amostras até um OD680 de 1-1,5 e incubar no escuro com ácido ascórbico 10 mM por 1 h para reduzir completamente o P700.
  2. Meça o espectro de absorção da amostra usando um espectrômetro UV-Vis. Meça a absorbância de apenas 650 nm a 750 nm com um intervalo de dados de 0,50 nm e uma taxa de varredura de 60 nm/min para testar o conteúdo de P700.
  3. Expor a amostra à luz brilhante (350 μmols de fotões/m2/s) e medir novamente o espectro durante a exposição.
  4. Subtraia o espectro escuro do espectro de luz para observar o branqueamento de P700 em torno de 702 nm nas plantas.
  5. Determinar o teor de P700 utilizando a absorção a 700 nm e um coeficiente de extinção de 64/mM/cm, conforme descrito em Hiyama e Ke 32,33,34.
  6. Medir a quantidade total de clorofila (clorofila A e clorofila B) usando o método descrito em et al.31. Use essas concentrações para determinar a proporção de clorofila para P700.

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Resultados

Este protocolo é usado para isolar e caracterizar o PSI-LHCI ativo dos tecidos vegetais durante três dias. O PSI-LHCI é purificado primeiro isolando as membranas tilacóides da planta, que são então solubilizadas com β-DDM. Os rendimentos típicos da fase de preparação da membrana são 200 mg de clorofila a partir de 500 g de folhas. Isso pode variar de acordo com o material inicial usado.

Os dias dois e três do experimento usam cromatografia de troca...

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Discussão

Usando este protocolo, o complexo PSI-LHCI dos tecidos vegetais pode ser purificado em seu estado ativo. Folhas de espinafre foram usadas aqui, mas esses métodos podem ser aplicados a preparações de várias plantas23,40. Em todos os casos, deve-se tomar cuidado ao executar este protocolo para proteger o complexo contra danos. Esta preparação deve ser feita no escuro ou sob luz verde, em gelo com tampões pré-resfriados, e t...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Y.M. reconhece o apoio da National Science Foundation sob o Prêmio nº 2034021 e do Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Escritório de Ciências Básicas de Energia, Divisão de Ciências Químicas, Geociências e Biociências sob o Prêmio nº DE-SC0022956. CG é apoiado pela National Science Foundation sob o Prêmio nº 00036806.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Falcon tubeVWR62406-200Used for storing thylakoids
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cmbiorad7374153
Cheesecloth grade 50, 100% cottonArkwright LLCB07D1FZZMBFrom Amazon
Glass rodsMillipore SigmaBR135825Any similar rod will suffice
Low profile 64 oz vitamix blenderVitamix
NaClSigma-AldrichS7653
Open top polyallomer centrifugation tubesSeton Scientific5030
Optima XE Ultracentrifugebeckman coulterA94471
Polyethylene glycol 6,000Hampton ResearchHR2-533
Potter-Elvehjen Tissue Grinder, 30 ml.WHEATON358049
SucroseSigma-AldrichS7903
SW 40 Tibeckman coulter331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
β-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002Stored as 10% stocks at -20 °C

Referências

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