JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) מרקמות הצמח. PSI יחד עם PSII אחראי על המרת אור לאנרגיה כימית בפוטו-אוטוטרופים חמצניים ויש לו יעילות קוונטית של ~1, מה שהופך אותו ליעד לחקר העברת אנרגיה מונעת אור.

Abstract

שיטה זו משמשת לבידוד מערכת פוטו-סיסטם I (PSI) יחד עם קומפלקס קצירת האור I (LHCI), האנטנה המקורית שלה, מצמחים. PSI-LHCI הוא קומפלקס חלבון ממברנה גדול המתאם מאות גורמי קצירת אור והובלת אלקטרונים והיא מערכת קצירת האור היעילה ביותר שנמצאת בטבע. פוטונים הנספגים על ידי ארבעת חלבוני האנטנה של LHCA המרכיבים את LHCI מועברים באמצעות אינטראקציה אקסיטונית למרכז תגובת הליבה של PSI ומשמשים כדי להקל על הפרדת מטען מונעת אור על פני קרום התילקואיד, ומספקים כוח ואנרגיה מפחיתים לקיבוע פחמן באורגניזמים פוטו-אוטוטרופיים. היעילות הקוונטית הגבוהה של PSI הופכת את המתחם הזה למודל מצוין לחקר העברת אנרגיה מונעת אור. בפרוטוקול זה, רקמת הצמח הומוגנית מכנית, והכלורופלסטים מופרדים מהפסולת התאית בתפזורת על ידי סינון וצנטריפוגה. לאחר מכן הכלורופלסטים המבודדים עוברים ליזה אוסמוטית, וממברנות התילקואיד משוחזרות באמצעות צנטריפוגה ומסיסות באמצעות חומר הניקוי n-dodecyl-beta-maltoside. החומר המסיס נטען על עמוד חילופי אניונים כדי לאסוף את רוב הקומפלקסים המכילים כלורופיל. קומפלקסים גדולים יותר משקעים מהתמיסה, מושעים מחדש בנפח קטן ונטענים על שיפועי סוכרוז כדי להפריד בין הקומפלקסים העיקריים המכילים כלורופיל. שברי שיפוע הסוכרוז המתקבלים מאופיינים לזיהוי רצועת העניין המכילה PSI-LHCI. פרוטוקול זה דומה מאוד לפרוטוקול המשמש להתגבשות PSI-LHCI של הצמח עם כמה פישוטים ומסתמך על שיטות שפותחו במהלך השנים במעבדתו של נתן נלסון.

Introduction

פוטוסינתזה חמצנית היא אחת התגובות הכימיות החשובות ביותר על הפלנטה שלנו. המרת האור לאנרגיה כימית מתרחשת במרכזי התגובה של שתי מערכות פוטו, מערכת פוטו-סיסטם I (PSI) ופוטו-סיסטם II (PSII)1 (איור 1A). PSI הוא קומפלקס פיגמנט-חלבון גדול ושמור מאוד שהתפתח לפני למעלה מ-3.5 מיליארד שנים 2,3. קומפלקס זה, המכיל כ-100 מולקולות כלורופיל וכ-20 קרוטנואידים, מקל על העברת אלקטרונים על פני קרום התילקואיד מפלסטוציאנין לפרדוקסין המשמש כמקבל האלקטרונים הסופי של שרשרת הובלת האלקטרונים הפוטוסינתטית 1,4,5 (איור 1B, C). בצמחים, הפרדת מטען מונעת אור זו היא תוצאה של אנרגיית אור המועברת הן מפיגמנטים של אנטנת ליבת PSI והן מפיגמנטים של אנטנה היקפית של קומפלקס קצירת אור I (LHCI) למרכז התגובה של PSI (איור 1D). LHCI הוא קומפלקס אנטנה ספציפי ל-PSI בתוך קרום התילקואיד המורכב מארבעה חלבוני אנטנת LHCA קושרים כלורופיל a/b 6,7.

figure-introduction-1273
איור 1: שרשרת הובלת האלקטרונים הפוטוסינתטית והמבנה הכולל של קומפלקס PSI-LHCI. (A) שרשרת הובלת האלקטרונים הפוטוסינתטית מכילה ארבעה קומפלקסים פוטוסינתטיים עיקריים הקשורים לממברנה ושלושה נשאי אלקטרונים מסיסים. זרימת אלקטרונים (חצים אדומים) דרך שרשרת ההובלה ושאיבת פרוטונים (חצים שחורים) לתוך הלומן משמשים ליצירת כוח מפחית (NADPH) וייצור ATP לקיבוע פחמן 37,38,39,40. נוצר עם Biorender.com. (B) מבנה הצמח PSI-LHCI מהצד הלומנלי. PsaA ו-PsaB הן יחידות המשנה הגדולות ביותר של PSI ומהוות את ליבת המתחם. LHCI הוא קומפלקס האנטנות לקצירת האור הקשור ל-PSI ומורכב מארבע אנטנות, LHCA1-4. (C) קומפלקס PSI-LHCI מתאם מעל 150 ליגנדים. מוצגים כאן כלורופיל (ירוק), קרוטנואידים (ורוד), קינונים (סגול), ליפידים (כתום) ואשכולות FeS של מרכז התגובה בצהוב/כתום. (D) מרכז התגובה של PSI מחולק לשני ענפים (A ו-B), החל מ-P700, זוג הכלורופיל המיוחד של מרכז התגובה, ונכנס לשני כלורופיל נלווים (A-1A/B) ואחריו זוג נוסף של כלורופיל (A0A/B). אחרי כלורופיל זה מופיע פילוקווינון (A1A/B או QA/B בחלק מהפרסומים) בכל ענף לפני שהם מתחברים יחד בצביר הברזל-גופרית Fx ואחריו שני אשכולות נוספים, FA ו-FB, בתיאום תת-יחידת PsaC. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הבידוד הראשון של PSI מצמחים בשנת 1966 שפך אור על ההבדלים בתכולת הפיגמנט של קצירת האור בין PSI ל-PSII, והראה כי PSI היה מועשר מאוד ב-β-קרוטן ביחס ל-PSII וכי ציטוכרומים f ו-b6 (חלק מקומפלקסי הציטוכרום b6f) אינם קשורים באופן הדוק ל-PSI אלא קשורים באופן רופף בתוך קרום התילקואיד8. תשע שנים לאחר מכן, עם דנטורציה חלקית של PSI מבודד באמצעות טיפול ב-SDS, הוכח כי דיסוציאציה של תת-יחידות PSI קטנות מרווה את הפחתה של NADP+ על ידי PSI, בעוד שאות P700 ורוב הכלורופיל נשארו בתוך חלקיק ה-PSI בעל המשקל המולקולרי הגדול שנותר, מה שזיהה את הצורך של חלק מתת-היחידות הקטנות של PSI לתפקוד ביולוגי מלא ומיקום מרכז התגובה של PSI9. מחקר על הקשר בין ליבת PSI ל-LHCI פורסם לראשונה בתחילת שנות ה-80, כאשר נצפו בידודים של מיני PSI בגדלים שונים המכילים יחסים שונים של כלורופיל A ל-P700, מה שמרמז על הקשר של PSI עם מערכת אנטנות היקפית המכילה כלורופיל 10,11,12,13. עם זאת, רק בשנת 2003 פורסם המבנה הגבישי הראשון של הצמח PSI14. המבנה הגבישי של הצמח PSI-LHCI הדגיש את השימור המדהים בין ליבת ה-PSI של הצמחים לבין ציאנובקטריה וסיפק את התמונה הראשונה של סידור הכלורופיל בתוך ליבת ה-PSI של הצמח ואנטנת LHCI, מה שקידם את ההבנה של מסלולי העברת האנרגיה בתוך קומפלקס PSI-LHCI של הצמח14. במהלך העשור האחרון נקבעו מבני PSI-LHCI נוספים של הצמח והוסיפו פרטים על רמות אטומיות לתיאור המבני של קומפלקס העל 15,16,17,18,19.

ל-PSI לא רק יש יעילות קוונטית קרובה לאחת, אלא מתגאה בפוטנציאל ההפחתה השלילי ביותר בטבע20,21. הבנה מלאה של PSI-LHCI ותכונותיו חיונית להבנת העברת אנרגיה מונעת אור ויישום פתרונות בהשראת ביו לטכנולוגיית קצירת אור עתידית. כדי לקדם את ההבנה הזו של האופן שבו PSI-LHCI ויחידות המשנה הרבות שלו יכולות להשיג המרת אנרגיה יעילה כל כך, קומפלקסים מבודדים למחקר חייבים להיות פעילים ושלמים. פרוטוקול זה מאפשר טיהור עדין של הקומפלקס במצב פעיל זה22,23.

בשיטה זו רקמות הצמח מופרעות מכנית וכלורופלסטים המכילים את שרשרת הובלת האלקטרונים הפוטוסינתטית מבודדים על ידי צנטריפוגה. ממברנות התילקואיד מופרדות לאחר ליזה של כלורופלסט היפוטוני ולאחר מכן מסיסות באמצעות חומר הניקוי n-dodecyl-beta-maltoside (β-DDM). הכלורופיל המסיס המכיל קומפלקסים ממברניים מופרדים באמצעות כרומטוגרפיה של חילופי אניונים ו-PSI-LHCI מופרד עוד יותר באמצעות צנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. לאחר הסרה מהשיפוע ולאחר אפיון הן על ידי ספקטרוסקופיה והן באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל סולפט (SDS-PAGE), ניתן להכין את הקומפלקס לניסויים נוספים. הליך זה משמש לטיהור קומפלקס PSI-LHCI מצמחים ללא שימוש בתגי זיקה כלשהם. עם שינויים קלים ניתן להתאים אותו להכנות של הקומפלקס מאורגניזמים אחרים, לייצב מתחמי PSI חלופיים או קומפלקסים אחרים של שרשרת הובלת האלקטרונים הפוטוסינתטית. פרוטוקולים דומים שימשו להשגת קומפלקס PSI המתאים לניתוח מבני ברזולוציה גבוהה 23,24,25,26,27,28,29,30.

Protocol

1. הכנת ממברנות תילקואיד מעלי תרד

  1. עבדו על קרח והימנעו מחשיפה לאור במידת האפשר בתכשיר זה. סביבת תאורה חלשה מספיקה אם נשמרים ריכוזי כלורופיל גבוהים, ומקפידים לשמור על הדגימות מכוסות ככל האפשר. בצע את כל שלבי הצנטריפוגה ב-4 מעלות צלזיוס אלא אם צוין אחרת.
  2. מוציאים גבעולים מעלי התרד (500 גרם) בעזרת מספריים, לוחצים בעדינות את העלים לבלנדר ומכסים לחלוטין בסוכרוז קר כקרח, טריצין, מאגר NaCl (STN) (טבלה 1). הומוגניזציה של רקמת הצמח במאגר STN למשך 10 שניות פעמיים (סה"כ 20 שניות), והשאיר 10 שניות בין פולסים כדי למנוע התחממות יתר באמצעות הגדרת הדופק.
    הערה: יחס טיפוסי של חיץ לעלים הוא 1 ליטר של מאגר STN עבור 500 גרם עלי תרד.
  3. סנן פסולת תאים דרך שמונה שכבות של בד גבינה על ידי אבטחת שכבות בד הגבינה מעל גדולה וצוננת או כלי קיבול אחר ושפוך את התערובת המעורבת דרך הבד. השתמש במוט זכוכית או בכף כדי לערבב את פסולת התאים במסנן כדי לאפשר לליזט לזרום דרכו.
  4. גלולה כלורופלסטים מהתא ליזאט על ידי צנטריפוגה ב 1000 x גרם למשך 9 דקות. השעו מחדש כלורופלסטים ב-1 ליטר של מאגר היפוטוני (טבלה 1). כדי להשעות כלורופלסטים, השתמש בפיפטה או בכדור כלורופלסט מערבולת במאגר והעביר למטחנת רקמות או להומוגניזטור דומה בגודל מתאים.
    הערה: חשיפה לתמיסה היפוטונית, והשעיה מחדש במטחנת רקמות מביאה את הכלורופלסטים.
  5. צנטריפוגה למשך 2 דקות בחום של 500 x גרם להסרת עמילן (שנאסף ככדור לבן). השעו בעדינות כל חומר ירוק שחזר לתוך הסופרנטנט באמצעות פיפטה או מברשת צבע קטנה תוך הימנעות ככל האפשר מהשעיית עמילן. צנטריפוגה את התמיסה ב 12,000 x גרם למשך 10 דקות כדי לגלול ממברנות תילקואיד.
  6. השעו מחדש את הממברנות הגלוליות בכמויות מינימליות של מאגר השעיית המלח הגבוה (טבלה 1), רק מספיק כדי להשעות מחדש את הממברנות, באמצעות פיפטה או מברשת צבע קטנה ולהומוגניזציה באמצעות הומוגנייזר כמו בשלב 1.4. צנטריפוגה ב 8000 x גרם למשך 10 דקות.
  7. השעיה מחדש כמו קודם בכמויות מינימליות של מאגר STN2 (טבלה 1), מספיק רק כדי להשעות מחדש ממברנות ולמדוד את תכולת הכלורופיל באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis. קבע את ריכוז הכלורופיל על ידי דילול הדגימה 1/1000 בתמיסת אצטון של 80% ושימוש בשיטה של Porra et al.31.
  8. התאם לריכוז הכלורופיל הרצוי, בדרך כלל 3 מ"ג/מ"ל, על ידי הוספת מאגר STN2 ו-aliquot באופן שווה לשניים או שלושה צינורות צנטריפוגה. התשואה הצפויה מ -500 גרם עלים היא בסביבות 200 מ"ג כלורופיל, אך צפויה שונות המבוססת על מצב חומר המוצא. מקפיאים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שמוכן להמסת הממברנה. ממברנות שהוקפאו בשלב זה יציבות למשך 6 חודשים לפחות.

2. מסיסות ממברנה

  1. מסיס ממברנות תילקואיד עם β-DDM. הוסף מספיק חומר ניקוי ממלאי β-DDM של 10% כדי להשיג יחס β-DDM לכלורופיל של 6:1. דגירה על קרח למשך 30 דקות. ערבבו בעדינות כל 5-10 דקות על ידי היפוך איטי של השפופרת מספר פעמים.
  2. צנטריפוגה ב-120,000 x גרם למשך 30 דקות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה להסרת חומר בלתי מסיס. השליכו את הגלולה ושמרו את הסופרנטנט לשלבים הבאים.

3. סילוק באמצעות עמודת דיאתילאמינואתיל (DEAE).

  1. הכן את עמודת חילופי האניונים באמצעות נפח מיטה של 1.5 מ"ל עבור 1 מ"ג של כלורופיל כולל בדגימה המסיסה. הכן את העמוד והפעל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יוצקים את השרף לתוך עמוד המאובטח על מעמד טבעת. הניחו לשרף להתיישב תוך הוספת מים או מאגר מלח נמוך בעמודה כדי למנוע מהעמוד להתייבש. ודא שהעמודה נקייה מבועות והחלק העליון שטוח וישר.
  2. שטפו את העמודה באמצעות שני נפחי עמודות (CV) של מאגר המלח הנמוך בעמודה (טבלה 1) וטענו את ה-supernatant משלב 2.2 על העמודה. אפשרו לסופרנטנט לרוץ לגמרי לתוך העמוד לפני שתמשיכו הלאה.
  3. שטפו את העמודה בקורות חיים אחד של מאגר מלח נמוך בעמודה.
  4. יש לשטוף באמצעות שיפוע NaCl ליניארי עם חוצצי עמודי המלח הנמוכים והגבוהים (5-250 מ"מ NaCl; טבלה 1) מיוצר בנפח כולל של שישה CV (כלומר, אם נפח מיטת העמודים הוא 30 מ"ל, השתמש ב-90 מ"ל של מאגר מלח נמוך ו-90 מ"ל של מאגר מלח גבוה).
    1. מלאו שתי כוסות במאגרי המלח הנמוכים והגבוהים. תוך כדי טפטוף מאגר מלח נמוך לתוך העמוד, צור גשר מלח בין מאגרי המלח הגבוהים והנמוכים באמצעות צינור מלא במים כדי לערבב אותם בהדרגה. השתמש במוט ערבוב כדי להבטיח שמאגר המלח הגבוה העובר למאגר המלח הנמוך מעורבב לפני שהוא מטפטף לתוך העמודה. זה מבטיח ששיפוע NaCl יהיה ליניארי. התחל לאסוף שברים.
  5. אספו 4 מ"ל שברים (עבור ניסוי טיפוסי שמתחיל בכ-35 מ"ג כלורופיל) ושלבו את השברים הירוקים הכהים סביב השליש האחרון של השיפוע (איור 2A).

4. משקעי פוליאתילן גליקול (PEG).

  1. לשברי הכלורופיל המשולבים, הוסיפו לאט PEG6000 לריכוז סופי של 8%. ריכוז ה-PEG יכול להשתנות מעט; אם לא רואים משקעים לאחר שהגיעו ל-8%, הגדילו את ריכוז ה-PEG במרווחים של 2% עד לצפייה במשקעים (התמיסה תהפוך לעכורה).
  2. צנטריפוגה ב 3,214 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט לחלוטין; הסרה מוחלטת של כל שאריות ה-PEG חיונית להשגת מסיסות טובה בשלב הבא. השעו מחדש את המשקעים הירוקים ב-2-5 מ"ל של מאגר השעיה לאחר העמודה (טבלה 1).
  3. כדי לוודא שהתילאקואידים נשטפו לחלוטין מ-PEG, סובב כמות קטנה של החומר המרחף בצנטריפוגה על שולחן ב-18,407 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להבטיח שהחומר מסיס. משקעים ירוקים קטנים מקובלים בשלב זה, אך רוב, אם לא כולם, הכלורופיל צריך להישאר בתמיסה. שמור על החלק המסיס.

5. הכנת שיפועי סוכרוז

  1. הכן שיפועי סוכרוז לא רציפים של 10%-30% בחמש שכבות (שכבות של 10%, 15%, 20%, 25% ו-30%) עם מאגר שיפוע סוכרוז (טבלה 1). הרכיבו את שיפועי הסוכרוז על ידי שכבות זהירות של שברי סוכרוז בצינור צנטריפוגה פוליאלומר, החל משכבת ה-30% וכלה בשכבת ה-10%. כוונן את עוצמת הקול של כל שכבה כך שיהיה מספיק מרווח ראש בחלק העליון של הצינור כדי לטעון את נפח הדגימה הרצוי.
  2. טען דגימות מהחומר המסיס משלב 4.2 לשיפועי סוכרוז. טען מספיק דגימה כדי להיות שווה ל-170 מיקרוגרם של כלורופיל לתוך שפופרת אחת, ו-420 מיקרוגרם של כלורופיל לתוך צינור אחר כדי לקבל שיפועים בריכוזים שונים כדי להעריך את ההומוגניות של כל פס (איור 3A).
    הערה: כמות הדגימה שנוספה היא שרירותית אך טווח של כ-150 עד 500 מיקרוגרם כלורופיל מתאים בדרך כלל.
  3. צנטריפוגה את השיפועים ב-100,000 x g למשך 16 שעות כדי להפריד בין הקומפלקסים השונים בתוך המדגם.

6. הסרת שברי סוכרוז ומשקעי PEG

  1. לאחר הצנטריפוגה, הסר את השיפועים מהרוטור וצלם את הצינורות באמצעות מצלמה דיגיטלית או טלפון סלולרי. בודד את השברים על ידי ניקוב הצינורות בתחתית בעזרת מחט ואז ניקוז איטי של התוכן. אסוף את השברים השונים המכילים כלורופיל בצינורות צנטריפוגה.
    הערה: ניתן לצטט את הדגימות ולהקפיא אותן לניתוח עוקב במידת הצורך.
  2. עבור יישומים מסוימים רצוי להסיר סוכרוז. להסרת סוכרוז, השתמש בשלב שני של משקעי PEG (או סינון ג'ל). התאם את ריכוז ה-NaCl בשבר PSI-LHCI ל-120 מ"מ והוסף PEG6000 לריכוז סופי של 10%.
  3. צנטריפוגה את הדגימה בצנטריפוגה שולחנית ב-18,407 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השהה מחדש את הגלולה הירוקה ב-30 מ"מ Tricine-NaOH pH 8.0, 50 מ"מ NaCl ו-0.05% β-DDM.
  4. צנטריפוגה את הדגימה בצנטריפוגה שולחנית ב-18,407 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להבטיח שכל החומר יישאר בתמיסה.

7. מדידת תכולת P700 של PSI

הערה: ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון במהירות PSI.

  1. יש לדלל את הדגימות ל-OD680 של 1-1.5 ולדגור בחושך עם חומצה אסקורבית של 10 מ"מ למשך שעה אחת כדי להפחית את ה-P700 לחלוטין.
  2. מדוד את ספקטרום הספיגה של הדגימה באמצעות ספקטרומטר UV-Vis. מדוד ספיגה מ-650 ננומטר עד 750 ננומטר בלבד עם מרווח נתונים של 0.50 ננומטר וקצב סריקה של 60 ננומטר/דקה לבדיקת תכולת P700.
  3. חשוף את הדגימה לאור בהיר (350 מיקרומול פוטונים/מ"ר לשנייה) ומדוד שוב את הספקטרום במהלך החשיפה.
  4. הפחיתו את הספקטרום הכהה מספקטרום האור כדי לצפות בהלבנת P700 בסביבות 702 ננומטר בצמחים.
  5. קבע את תכולת ה-P700 באמצעות הספיגה ב-700 ננומטר ומקדם הכחדה של 64/מ"מ/ס"מ כמתואר ב-Hiyama ו-Ke 32,33,34.
  6. מדוד את כמות הכלורופיל הכוללת (כלורופיל A וכלורופיל B) בשיטה המתוארת ב-Porra et al.31. השתמש בריכוזים אלה כדי לקבוע את יחס הכלורופיל ל-P700.

תוצאות

פרוטוקול זה משמש לבידוד ואפיון PSI-LHCI פעיל מרקמות הצמח במשך שלושה ימים. PSI-LHCI מטוהר על ידי בידוד תחילה של ממברנות תילקואיד צמחיות אשר לאחר מכן מסיסות באמצעות β-DDM. תשואות אופייניות משלב הכנת הממברנה הן 200 מ"ג כלורופיל מ -500 גרם עלים. זה יכול להשתנות בהתאם לחומר הראשוני בו נעשה ...

Discussion

באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לטהר את קומפלקס PSI-LHCI מרקמות הצמח במצבו הפעיל. כאן נעשה שימוש בעלי תרד, אך ניתן ליישם שיטות אלה על תכשירים מצמחים שונים23,40. בכל המקרים, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע פרוטוקול זה כדי להגן על המתחם מפני נזק. הכנה זו צריכה ...

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

י.מ. מכיר בתמיכת הקרן הלאומית למדע תחת פרס מס' 2034021 ומשרד האנרגיה של ארה"ב, משרד המדע, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסיים, המחלקה למדעי הכימיה, מדעי הגיאוגרפיה ומדעי הביולוגיה תחת פרס מס. דה-SC0022956. C.G. נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת פרס מס' 00036806.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Falcon tubeVWR62406-200Used for storing thylakoids
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cmbiorad7374153
Cheesecloth grade 50, 100% cottonArkwright LLCB07D1FZZMBFrom Amazon
Glass rodsMillipore SigmaBR135825Any similar rod will suffice
Low profile 64 oz vitamix blenderVitamix
NaClSigma-AldrichS7653
Open top polyallomer centrifugation tubesSeton Scientific5030
Optima XE Ultracentrifugebeckman coulterA94471
Polyethylene glycol 6,000Hampton ResearchHR2-533
Potter-Elvehjen Tissue Grinder, 30 ml.WHEATON358049
SucroseSigma-AldrichS7903
SW 40 Tibeckman coulter331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
β-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002Stored as 10% stocks at -20 °C

References

  1. Nelson, N., Junge, W. Structure and energy transfer in photosystems of oxygenic photosynthesis. Annual Review of Biochemistry. 84, 659-683 (2015).
  2. Fischer, W. W., Hemp, J., Johnson, J. E. Evolution of oxygenic photosynthesis. Annual Review of Earth and Planetary Sciences. 44 (1), 647-683 (2016).
  3. Yoon, H. S., Hackett, J. D., Ciniglia, C., Pinto, G., Bhattacharya, D. A molecular timeline for the origin of photosynthetic eukaryotes. Molecular Biology and Evolution. 21 (5), 809-818 (2004).
  4. Busch, A., Hippler, M. The structure and function of eukaryotic photosystem i. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1807 (8), 864-877 (2011).
  5. Rochaix, J. D. Regulation of photosynthetic electron transport. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1807 (3), 375-383 (2011).
  6. Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1556 (1), 29-40 (2002).
  7. Croce, R., Van Amerongen, H. Light-harvesting in photosystem I. Photosynthesis Research. 116 (2-3), 153-166 (2013).
  8. Anderson, J. M., Boardman, N. K. Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis I. Chlorophyll contents and photochemical activities of particles isolated from spinach chloroplasts. Bibliotek for Laeger. 112 (3), 403-421 (1966).
  9. Bengis, C., Nelson, N. Purification and properties of the photosystem I reaction center from chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 250 (8), 2783 (1975).
  10. Lam, E., Ortiz, W., Malkin, R. Chlorophyll a/b proteins of Photosystem I. FEBS Letters. 168 (1), 10-14 (1984).
  11. Kuang, T. Y., Argyroudi-Akoyunoglou, J. H., Nakatani, H. Y., Watson, J., Arntzen, C. J. The origin of the long-wavelength fluorescence emission band (77°K) from photosystem I. Archives of Biochemistry and Biophysics. 235 (2), 618-627 (1984).
  12. Mullet, J. E., Burke, J. J., Arntzen, C. J. A developmental study of Photosystem I peripheral chlorophyll proteins. Plant Physiology. 65 (5), 823-827 (1980).
  13. Mullet, J. E., Burke, J. J., Arntzen, C. J. Chlorophyll a/b proteins of Photosystem I. Plant Physiology. 65 (5), 814-822 (1980).
  14. Ben-Shem, A., Frolow, F., Nelson, N. Crystal structure of plant photosystem I. Nature. 426 (6967), 630-635 (2003).
  15. Mazor, Y., Borovikova, A., Nelson, N. The structure of plant photosystem I super-complex at 2.8 A resolution. eLife. 4, 07433 (2015).
  16. Qin, X., Suga, M., Kuang, T., Shen, J. R. Photosynthesis. Structural basis for energy transfer pathways in the plant PSI-LHCI supercomplex. Science. 348 (6238), 989-995 (2015).
  17. Mazor, Y., Borovikova, A., Caspy, I., Nelson, N. Structure of the plant photosystem I supercomplex at 2.6 resolution. Nature Plants. 3, 17014 (2017).
  18. Pan, X., et al. Structure of the maize photosystem I supercomplex with light-harvesting complexes I and II. Science. 360 (6393), 1109-1113 (2018).
  19. Wang, J., et al. Structure of plant photosystem I−light harvesting complex I supercomplex at 2.4 Å resolution. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (7), 1367-1381 (2021).
  20. Jensen, P. E., et al. function, and regulation of plant photosystem I. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1767 (5), 335-352 (2007).
  21. Nelson, N. Plant photosystem I - The most efficient nano-photochemical machine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 9 (3), 1709-1713 (2009).
  22. Amunts, A., Toporik, H., Borovikova, A., Nelson, N. Structure determination and improved model of plant photosystem I. Journal of Biological Chemistry. 285 (5), 3478-3486 (2010).
  23. Gorski, C., et al. The structure of the Physcomitrium patens photosystem I reveals a unique Lhca2 paralogue replacing Lhca4. Nature Plants. 8 (3), 307-316 (2022).
  24. Perez-Boerema, A., et al. Structure of a minimal photosystem I from the green alga Dunaliella salina. Nature Plants. 6 (3), 321-327 (2020).
  25. Toporik, H., et al. The structure of a red-shifted photosystem I reveals a red site in the core antenna. Nature Communications. 11 (1), 5279 (2020).
  26. Toporik, H., Li, J., Williams, D., Chiu, P. L., Mazor, Y. The structure of the stress-induced photosystem I-IsiA antenna supercomplex. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 443-449 (2019).
  27. Caspy, I., et al. Structure and energy transfer pathways of the Dunaliella Salina photosystem I supercomplex. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1861 (10), 148253 (2020).
  28. Naschberger, A., et al. Algal photosystem I dimer and high resolution model of PSI:plastocyanin complex. Nature Plants. 8 (10), 1191-1201 (2022).
  29. Furukawa, R., et al. Formation of a PSI-PSII megacomplex containing LHCSR and PsbS in the moss Physcomitrella patens. Journal of Plant Research. 132 (6), 867-880 (2019).
  30. Gisriel, C. J., et al. High-resolution cryo-electron microscopy structure of photosystem II from the mesophilic cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (1), 2116765118 (2021).
  31. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 12 (2), 103-107 (2004).
  32. Bassi, R., Simpson, D. Chlorophyll-protein complexes of barley photosystem I. European Journal of Biochemistry. 163 (2), 221-230 (1987).
  33. Hiyama, T., Ke, B. Difference spectra and excitation coefficients of P700. Biochimica et Biophysica Acta. 267 (459), 160-171 (1972).
  34. Anderson, J. M. P-700 content and polypeptide profile of chlorophyll-protein complexes of spinach and barley thylakoids. Biochimica et Biophysica Acta. 591 (1), 113-126 (1980).
  35. Caspy, I., et al. Dimeric and high-resolution structures of Chlamydomonas Photosystem I from a temperature-sensitive Photosystem II mutant. Communications Biology. 4 (1), 1-10 (2021).
  36. Caffarri, S., Kouřil, R., Kereïche, S., Boekema, E. J., Croce, R. Functional architecture of higher plant photosystem II supercomplexes. EMBO Journal. 28 (19), 3052-3063 (2009).
  37. Su, X., et al. Structure and assembly mechanism of plant C2S2M2-type PSII-LHCII supercomplex. Science. 357 (6353), 815-820 (2017).
  38. Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b 6 f at 3.6 Å resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
  39. Guo, H., Rubinstein, J. L. Structure of ATP synthase under strain during catalysis. Nature Communications. 13 (1), 2-10 (2022).
  40. Mazor, Y., Borovikova, A., Caspy, I., Nelson, N. Structure of the plant photosystem I supercomplex at 2.6 Å resolution. Nature Plants. 3, 17014 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Photosystem IIPSI LHCIN dodecyl beta maltoside

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved