Reinigung des aktiven Photosystems I-Light Harvesting Complex I aus Pflanzengewebe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) aus pflanzlichem Gewebe. PSI ist zusammen mit PSII für die Umwandlung von Licht in chemische Energie in oxygenen Photoautotrophen verantwortlich und hat eine Quanteneffizienz von ~1, was es zu einem Ziel für die Untersuchung des lichtgetriebenen Energietransfers macht.

Zusammenfassung

Diese Methode wird verwendet, um Photosystem I (PSI) zusammen mit dem Light Harvesting Complex I (LHCI), seiner nativen Antenne, von Pflanzen zu isolieren. PSI-LHCI ist ein großer Membranproteinkomplex, der Hunderte von Lichtsammel- und Elektronentransportfaktoren koordiniert und das effizienteste Lichtsammelsystem in der Natur ist. Photonen, die von den vier LHCA-Antennenproteinen, aus denen LHCI besteht, absorbiert werden, werden durch exzitonische Wechselwirkung an das PSI-Kernreaktionszentrum übertragen und werden verwendet, um die lichtgesteuerte Ladungstrennung über die Thylakoidmembran zu erleichtern, wodurch die Leistung und Energie für die Kohlenstofffixierung in photoautotrophen Organismen reduziert wird. Die hohe Quanteneffizienz von PSI macht diesen Komplex zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung des lichtgetriebenen Energietransfers. Bei diesem Protokoll wird das Pflanzengewebe mechanisch homogenisiert und die Chloroplasten werden durch Filtration und Zentrifugation von den Zellresten getrennt. Die isolierten Chloroplasten werden dann osmotisch lysiert, und die Thylakoidmembranen werden durch Zentrifugation zurückgewonnen und mit dem Detergens n-Dodecyl-beta-Maltosid solubilisiert. Das solubilisierte Material wird auf eine Anionenaustauschersäule geladen, um den größten Teil der chlorophyllhaltigen Komplexe zu sammeln. Größere Komplexe werden aus der Lösung ausgefällt, in einem kleinen Volumen resuspendiert und auf Saccharosegradienten geladen, um die wichtigsten chlorophyllhaltigen Komplexe zu trennen. Die resultierenden Saccharosegradientenfraktionen werden charakterisiert, um die interessierende Bande zu identifizieren, die PSI-LHCI enthält. Dieses Protokoll ist dem Protokoll, das bei der Kristallisation von pflanzlichem PSI-LHCI verwendet wird, mit einigen Vereinfachungen sehr ähnlich und stützt sich auf Methoden, die im Laufe der Jahre im Labor von Nathan Nelson entwickelt wurden.

Einleitung

Die oxygene Photosynthese ist eine der wichtigsten chemischen Reaktionen auf unserem Planeten. Die Umwandlung von Licht in chemische Energie findet in den Reaktionszentren zweier Photosysteme statt, Photosystem I (PSI) und Photosystem II (PSII)¹ (Abbildung 1A). PSI ist ein großer, hochkonservierter Pigment-Protein-Komplex mit mehreren Untereinheiten, der sich vor über 3,5 Milliarden Jahren entwickelt hat ^2,3. Dieser Komplex, der etwa 100 Chlorophyllmoleküle und etwa 20 Carotinoide enthält, erleichtert den Transfer von Elektronen über die Thylakoidmembran von Plastocyanin zu Ferredoxin, das als terminaler Elektronenakzeptor der photosynthetischen Elektronentransportkette ^1,4,5 fungiert (Abbildung 1B, C). In Pflanzen ist diese lichtgetriebene Ladungstrennung das Ergebnis der Lichtenergie, die sowohl von den PSI-Kernantennenpigmenten als auch von den peripheren Antennenpigmenten des Light Harvesting Complex I (LHCI) zum PSI-Reaktionszentrum übertragen wird (Abbildung 1D). LHCI ist ein PSI-spezifischer Antennenkomplex innerhalb der Thylakoidmembran, der aus vier Chlorophyll a/b-bindenden LHCA-Antennenproteinen^{besteht 6,7}.

Abbildung 1: Die photosynthetische Elektronentransportkette und die Gesamtstruktur des PSI-LHCI-Komplexes. (A) Die photosynthetische Elektronentransportkette besteht aus vier membrangebundenen photosynthetischen Hauptkomplexen und drei löslichen Elektronenträgern. Der Elektronenfluss (rote Pfeile) durch die Transportkette und das Pumpen von Protonen (schwarze Pfeile) in das Lumen werden genutzt, um Reduktionskraft (NADPH) zu erzeugen und ATP für die Kohlenstofffixierung zu erzeugen 37,38,39,40. Erstellt mit Biorender.com. (B) Die Struktur der Pflanze PSI-LHCI von der Lumenalseite aus. PsaA und PsaB sind die größten Untereinheiten von PSI und bilden den Kern des Komplexes. LHCI ist der lichtsammelnde Antennenkomplex, der mit PSI assoziiert ist und aus vier Antennen, LHCA1-4, besteht. (C) Der PSI-LHCI-Komplex koordiniert über 150 Liganden. Hier sind Chlorophylle (grün), Carotinoide (rosa), Chinone (violett), Lipide (orange) und die FeS-Cluster des Reaktionszentrums in gelb/orange dargestellt. (D) Das Reaktionszentrum von PSI wird in zwei Zweige (A und B) aufgeteilt, beginnend mit P700, dem speziellen Chlorophyllpaar des Reaktionszentrums, und geht in zwei akzessorische Chlorophylle (_A-1A/B) über, gefolgt von einem weiteren Paar Chlorophyllen (A_0A/B). Auf diese Chlorophylle folgt in jedem Zweig ein Phyllochinon (A_1A/B oder Q_A/B in einigen Publikationen), bevor sie sich am Eisen-Schwefel-Cluster F_x zusammenschließen, gefolgt von zwei weiteren Clustern, F_A und F_B, die von der PsaC-Untereinheit koordiniert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die erste Isolierung von PSI aus Pflanzen im Jahr 1966 gab Aufschluss über die Unterschiede im lichtsammelnden Pigmentgehalt zwischen PSI und PSII und zeigte, dass PSI im Vergleich zu PSII stark mit β-Carotin angereichert war und dass die Cytochrome f und b₆ (Teil der Cytochrom b₆f-Komplexe) nicht fest an PSI gebunden sind, sondern lose innerhalb der Thylakoidmembran assoziiert^{sind 8}. Neun Jahre später konnte bei teilweiser Denaturierung von isolierten PSI mittels SDS-Behandlung gezeigt werden, dass die Dissoziation kleiner PSI-Untereinheiten die NADP+-Photoreduktion durch PSI unterdrückte, während das P700-Signal und die meisten Chlorophylle innerhalb des verbleibenden PSI-Partikels mit großem Molekulargewicht blieben, was die Notwendigkeit einiger der kleinen Untereinheiten von PSI für die volle biologische Funktion und die Lage des PSI-Reaktionszentrums identifiziert⁹. Die Erforschung des Zusammenhangs zwischen dem PSI-Kern und LHCI wurde erstmals in den frühen 1980er Jahren veröffentlicht, als Isolierungen von unterschiedlich großen PSI-Spezies mit unterschiedlichen Verhältnissen von Chlorophyll A zu P700 beobachtet wurden, was auf eine Assoziation von PSI mit einem chlorophyllhaltigen peripheren Antennensystem hindeutet 10,11,12,13. Es dauerte jedoch bis 2003, bis die erste Kristallstruktur der Pflanze PSI, veröffentlicht^{wurde 14}. Die Kristallstruktur des pflanzlichen PSI-LHCI unterstreicht die bemerkenswerte Konservierung zwischen dem PSI-Kern von Pflanzen und Cyanobakterien und lieferte das erste Bild der Chlorophyllanordnung innerhalb des pflanzlichen PSI-Kerns und der LHCI-Antenne, was das Verständnis der Energietransferwege innerhalb des pflanzlichen PSI-LHCI-Komplexes^{fördert 14}. In den letzten zehn Jahren wurden weitere PSI-LHCI-Strukturen von Pflanzen bestimmt, die der strukturellen Beschreibung des Superkomplexes 15,16,17,18,19 Details auf atomarer Ebene hinzufügen.

PSI hat nicht nur einen Quantenwirkungsgrad nahe eins, sondern weist auch das negativste Reduktionspotenzial in der Natur^{auf 20,21}. Ein vollständiges Verständnis von PSI-LHCI und seinen Eigenschaften ist unerlässlich, um die lichtgetriebene Energieübertragung zu verstehen und bioinspirierte Lösungen auf zukünftige Lichtsammeltechnologien anzuwenden. Um dieses Verständnis darüber zu vertiefen, wie PSI-LHCI und seine vielen Untereinheiten eine so effiziente Energieumwandlung erreichen können, müssen die für die Untersuchung isolierten Komplexe aktiv und vollständig sein. Dieses Protokoll ermöglicht die schonende Reinigung des Komplexes in diesem aktiven Zustand^22,23.

Bei dieser Methode werden Pflanzengewebe mechanisch aufgebrochen und Chloroplasten, die die photosynthetische Elektronentransportkette enthalten, durch Zentrifugation isoliert. Die Thylakoidmembranen werden nach einer hypotonen Chloroplastenlyse abgetrennt und anschließend mit dem Detergens n-Dodecyl-beta-Maltosid (β-DDM) solubilisiert. Die solubilisierten chlorophyllhaltigen Membrankomplexe werden mittels Anionenaustauschchromatographie getrennt und PSI-LHCI wird weiter mittels Saccharosegradientenzentrifugation getrennt. Nach der Entfernung aus dem Gradienten und nach Charakterisierung sowohl durch Spektroskopie als auch unter Verwendung der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) kann der Komplex für weitere Experimente vorbereitet werden. Dieses Verfahren wird verwendet, um den PSI-LHCI-Komplex aus Pflanzen ohne die Verwendung von Affinitäts-Tags zu reinigen. Mit geringfügigen Modifikationen kann es für Präparationen des Komplexes aus anderen Organismen adaptiert werden, alternative PSI-Komplexe oder andere Komplexe der photosynthetischen Elektronentransportkette stabilisieren. Ähnliche Protokolle wurden verwendet, um einen PSI-Komplex zu erhalten^, der für die hochauflösende Strukturanalyse^{geeignet ist 23,24,25,26,27,28,29,30}.

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Protokoll

1. Herstellung von Thylakoidmembranen aus Spinatblättern

1. Arbeiten Sie auf Eis und vermeiden Sie bei dieser Zubereitung nach Möglichkeit Lichteinwirkung. Eine Umgebung mit wenig Licht ist ausreichend, wenn hohe Chlorophyllkonzentrationen aufrechterhalten werden und darauf geachtet wird, dass die Proben so weit wie möglich bedeckt bleiben. Alle Zentrifugationsschritte bei 4 °C durchführen, sofern nicht anders angegeben.
2. Den Spinat (500 g) mit einer Schere von den Stielen befreien, die Blätter vorsichtig in einen Mixer drücken und vollständig mit eiskalter Saccharose, Tricin, NaCl (STN)-Puffer bedecken (Tabelle 1). Homogenisieren Sie das Pflanzengewebe zweimal 10 s lang in STN-Puffer (insgesamt 20 s), wobei zwischen den Impulsen 10 s verbleiben, um eine Überhitzung mit der Impulseinstellung zu vermeiden.
   HINWEIS: Ein typisches Verhältnis von Puffer zu Blättern beträgt 1 l STN-Puffer für 500 g Spinatblätter.
3. Filtern Sie Zellreste durch acht Schichten Käsetuch, indem Sie die Schichten des Käsetuchs über einem großen, gekühlten Becherglas oder einem anderen Behälter befestigen und die gemischte Mischung durch das Tuch gießen. Rühre mit einem Glasstab oder Löffel die Zelltrümmer im Filter um, damit das Lysat durchfließen kann.
4. Pellet-Chloroplasten aus der Zelle lysieren durch Zentrifugation bei 1000 x g für 9 min. Resuspendieren Sie Chloroplasten in 1 l hypotonischem Puffer (Tabelle 1). Um Chloroplasten zu resuspendieren, verwenden Sie eine Pipette oder wirbeln Sie das Chloroplasten-Pellet in Puffer und geben Sie es in eine Gewebemühle oder einen ähnlichen Homogenisator in geeigneter Größe.
   HINWEIS: Bei Einwirkung einer hypotonischen Lösung und Resuspension in einer Gewebeschleifmaschine werden die Chloroplasten lysiert.
5. 2 min bei 500 x g zentrifugieren, um Stärke (als weißes Kügelchen gesammelt) zu entfernen. Bringen Sie grünes Material, das sich in den Überstand zurückgebildet hat, vorsichtig mit einer Pipette oder einem kleinen Pinsel zurück und vermeiden Sie dabei so weit wie möglich eine Stärkeresuspension. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 12.000 x g für 10 Minuten, um Thylakoidmembranen zu pelletieren.
6. Die pelletierten Membranen werden mit einer Pipette oder einem kleinen Pinsel in minimalen Mengen des Resuspensionspuffers mit hohem Salzgehalt (Tabelle 1) resuspendiert, nur so viel, dass die Membranen resuspendiert werden, und mit einem Homogenisator wie in Schritt 1.4 homogenisieren. Zentrifugieren bei 8000 x g für 10 min.
7. Resuspendieren Sie wie zuvor in minimalen Mengen STN2-Puffer (Tabelle 1), nur genug, um Membranen zu resuspendieren und den Chlorophyllgehalt mit einem UV-Vis-Spektralphotometer zu messen. Bestimmen Sie die Chlorophyllkonzentration, indem Sie die Probe 1/1000 in 80%iger Acetonlösung verdünnen und die Methode von Porra et ^al.31 anwenden.
8. Stellen Sie die gewünschte Chlorophyllkonzentration ein, in der Regel 3 mg/ml, indem Sie STN2-Puffer zugeben und gleichmäßig in zwei oder drei Zentrifugenröhrchen aliquotieren. Die erwartete Ausbeute von 500 g Blättern liegt bei etwa 200 mg Chlorophyll, aber es ist mit Schwankungen je nach Zustand des Ausgangsmaterials zu rechnen. Bei -80 °C einfrieren, bis die Membran solubilisiert werden kann. Membranen, die in diesem Stadium eingefroren werden, sind mindestens 6 Monate lang stabil.

2. Solubilisierung der Membran

1. Solubilisieren Sie Thylakoidmembranen mit β-DDM. Fügen Sie ausreichend Waschmittel aus einer 10%igen β-DDM-Brühe hinzu, um ein Verhältnis von β-DDM zu Chlorophyll von 6:1 zu erreichen. 30 min auf Eis inkubieren. Alle 5-10 min vorsichtig mischen, indem Sie die Tube mehrmals langsam umdrehen.
2. Zentrifugieren Sie 30 Minuten lang bei 120.000 x g mit einer Ultrazentrifuge, um unlösliches Material zu entfernen. Entsorgen Sie das Pellet und bewahren Sie den Überstand für die nachfolgenden Schritte auf.

3. Elution mit Diethylaminoethyl (DEAE)-Säule

1. Bereiten Sie die Anionenaustauschersäule unter Verwendung eines 1,5-ml-Bettvolumens für 1 mg Gesamtchlorophyll in der solubilisierten Probe vor. Die Säule vorbereiten und bei 4 °C laufen lassen. Gießen Sie das Harz in eine Säule, die an einem Ringständer befestigt ist. Lassen Sie das Harz absetzen, während Sie Wasser oder Säulenpuffer mit niedrigem Salzgehalt hinzufügen, um zu verhindern, dass die Säule trocken läuft. Stellen Sie sicher, dass die Säule frei von Blasen ist und die Oberseite flach und eben ist.
2. Waschen Sie die Säule mit zwei Säulenvolumina (CV) Säulenpuffer mit niedrigem Salzgehalt (Tabelle 1) und laden Sie den Überstand aus Schritt 2.2 auf die Säule. Lassen Sie den Überstand vollständig in die Säule einlaufen, bevor Sie fortfahren.
3. Waschen Sie die Säule in einem CV Säulenpuffer mit niedrigem Salzgehalt.
4. Eluieren Sie unter Verwendung eines linearen NaCl-Gradienten mit den Puffern mit niedrigem Salzgehalt und hohem Salzgehalt (5-250 mM NaCl; Tabelle 1) hergestellt in einem Gesamtvolumen von sechs CV (d. h. wenn das Säulenbettvolumen 30 mL beträgt, verwenden Sie 90 mL Puffer mit niedrigem Salzgehalt und 90 mL Puffer mit hohem Salzgehalt).
   1. Füllen Sie zwei Becher mit dem niedrigen und dem hohen Salzpuffer. Während Sie den salzarmen Puffer in die Säule tropfen, schaffen Sie eine Salzbrücke zwischen den Puffern mit hohem und niedrigem Salzgehalt, indem Sie ein mit Wasser gefülltes Rohr verwenden, um sie nach und nach zu mischen. Stellen Sie mit einem Rührstäbchen sicher, dass der Puffer mit hohem Salzgehalt, der in den Puffer mit niedrigem Salzgehalt übergeht, gemischt wird, bevor er in die Säule getropft wird. Dadurch wird sichergestellt, dass der NaCl-Gradient linear ist. Beginne mit dem Sammeln von Fraktionen.
5. Sammeln Sie 4 ml-Fraktionen (für ein typisches Experiment, das mit etwa 35 mg Chlorophyll beginnt) und kombinieren Sie die dunkelgrünen Fraktionen, die um das letzte Drittel des Gradienten eluieren (Abbildung 2A).

4. Fällung von Polyethylenglykol (PEG)

1. Zu den kombinierten Chlorophyllfraktionen geben Sie langsam PEG6000 bis zu einer Endkonzentration von 8%. Die PEG-Konzentration kann etwas variieren; Wenn nach Erreichen von 8 % kein Niederschlag zu sehen ist, erhöhen Sie die PEG-Konzentration in Schritten von 2 %, bis Niederschlag zu sehen ist (die Lösung wird trüb).
2. Zentrifugieren Sie bei 3.214 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand vollständig; Die vollständige Entfernung aller verbleibenden PEG ist unerlässlich, um im nächsten Schritt eine gute Solubilisierung zu erreichen. Resuspendieren Sie den grünen Niederschlag in 2-5 ml Resuspensionspuffer nach der Säule (Tabelle 1).
3. Um zu überprüfen, ob die Thylakoide vollständig von PEG gewaschen wurden, schleudern Sie ein kleines Aliquot des resuspendierten Materials in einer Tischzentrifuge bei 18.407 x g bei 4 °C für 5 Minuten, um sicherzustellen, dass das Material löslich ist. Ein kleiner grüner Niederschlag ist in diesem Stadium akzeptabel, aber der größte Teil, wenn nicht sogar das gesamte Chlorophyll sollte in der Lösung verbleiben. Behalten Sie die lösliche Fraktion.

5. Herstellung von Saccharosegradienten

1. Bereiten Sie 10%-30% diskontinuierliche Saccharosegradienten in fünf Schichten (10%, 15%, 20%, 25% und 30% Schichten) mit Saccharose-Gradientenpuffer vor (Tabelle 1). Setzen Sie die Saccharosegradienten zusammen, indem Sie die Saccharosefraktionen vorsichtig in ein Polyallomer-Zentrifugenröhrchen schichten, beginnend mit der 30%-Schicht und endend mit der 10%-Schicht. Passen Sie das Volumen jeder Schicht so an, dass oben im Röhrchen genügend Kopfraum vorhanden ist, um das gewünschte Probenvolumen zu laden.
2. Laden Sie Proben aus dem löslichen Material aus Schritt 4.2 in Saccharosegradienten. Laden Sie genügend Proben wie 170 μg Chlorophyll in ein Röhrchen und 420 μg Chlorophyll in ein anderes, um Gradienten bei unterschiedlichen Konzentrationen zu erhalten, um die Homogenität jeder Bande zu beurteilen (Abbildung 3A).
   HINWEIS: Die Menge der hinzugefügten Probe ist willkürlich, aber ein Bereich von etwa 150 bis 500 μg Chlorophyll ist in der Regel angemessen.
3. Zentrifugieren Sie die Gradienten bei 100.000 x g für 16 h, um die verschiedenen Komplexe innerhalb der Probe zu trennen.

6. Entfernung von Saccharosefraktionen und PEG-Fällung

1. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren die Gradienten vom Rotor und fotografieren Sie die Röhrchen mit einer Digitalkamera oder einem Mobiltelefon. Isolieren Sie die Fraktionen, indem Sie die Röhrchen am Boden mit einer Nadel durchstechen und dann den Inhalt langsam abtropfen lassen. Sammeln Sie die verschiedenen chlorophyllhaltigen Fraktionen in Zentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Die Proben können auf Wunsch aliquotiert und für die anschließende Analyse eingefroren werden.
2. Für einige Anwendungen ist die Entfernung von Saccharose wünschenswert. Um Saccharose zu entfernen, verwenden Sie einen zweiten Schritt der PEG-Fällung (oder Gelfiltration). Passen Sie die NaCl-Konzentration in der PSI-LHCI-Fraktion auf 120 mM an und fügen Sie PEG6000 zu einer Endkonzentration von 10 % hinzu.
3. Die Probe wird in einer Tischzentrifuge bei 18.407 x g bei 4 °C für 5 min zentrifugiert. Resuspendieren Sie das grüne Pellet in 30 mM Tricine-NaOH pH 8,0, 50 mM NaCl und 0,05 % β-DDM.
4. Die Probe wird in einer Tischzentrifuge bei 18.407 x g bei 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert, um sicherzustellen, dass das gesamte Material in Lösung bleibt.

7. Messung des P700-Gehalts an PSI

HINWEIS: Diese Methode kann verwendet werden, um PSI schnell zu testen.

1. Verdünnen Sie die Proben auf einen OD₆₈₀ von 1-1,5 und inkubieren Sie sie 1 h lang im Dunkeln mit 10 mM Ascorbinsäure, um P700 vollständig zu reduzieren.
2. Messen Sie das Absorptionsspektrum der Probe mit einem UV-Vis-Spektrometer. Messen Sie die Absorption von nur 650 nm bis 750 nm mit einem Datenintervall von 0,50 nm und einer Scanrate von 60 nm/min für die Bestimmung des P700-Gehalts.
3. Setzen Sie die Probe hellem Licht (350 μmol Photonen/m²/s) aus und messen Sie das Spektrum während der Belichtung erneut.
4. Subtrahieren Sie das dunkle Spektrum vom Lichtspektrum, um das P700-Bleichen bei etwa 702 nm in Pflanzen zu beobachten.
5. Der P700-Gehalt wird anhand der Absorption bei 700 nm und eines Extinktionskoeffizienten von 64/mM/cm bestimmt, wie in Hiyama und Ke 32,33,34 beschrieben.
6. Messen Sie die Gesamtchlorophyllmenge (Chlorophyll A und Chlorophyll B) mit der in Porra et ^al.31 beschriebenen Methode. Verwenden Sie diese Konzentrationen, um das Verhältnis von Chlorophyll zu P700 zu bestimmen.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll wird verwendet, um aktives PSI-LHCI aus Pflanzengeweben über einen Zeitraum von drei Tagen zu isolieren und zu charakterisieren. PSI-LHCI wird gereinigt, indem zunächst pflanzliche Thylakoidmembranen isoliert und dann mit β-DDM solubilisiert werden. Typische Erträge aus der Phase der Membranvorbereitung sind 200 mg Chlorophyll aus 500 g Blättern. Dies kann je nach verwendetem Ausgangsmaterial variieren.

An den Tagen zwei und drei des Expe...

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Diskussion

Mit Hilfe dieses Protokolls kann der PSI-LHCI-Komplex aus Pflanzengeweben in seinem aktiven Zustand gereinigt werden. Hier wurden Spinatblätter verwendet, aber diese Methoden können auf Präparate aus verschiedenen Pflanzen angewendet werden^23,40. In jedem Fall muss bei der Durchführung dieses Protokolls darauf geachtet werden, den Komplex vor Schäden zu schützen. Diese Zubereitung sollte im Dunkeln oder bei grünem Licht, a...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Falcon tube	VWR	62406-200	Used for storing thylakoids
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cm	biorad	7374153
Cheesecloth grade 50, 100% cotton	Arkwright LLC	B07D1FZZMB	From Amazon
Glass rods	Millipore Sigma	BR135825	Any similar rod will suffice
Low profile 64 oz vitamix blender	Vitamix
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Open top polyallomer centrifugation tubes	Seton Scientific	5030
Optima XE Ultracentrifuge	beckman coulter	A94471
Polyethylene glycol 6,000	Hampton Research	HR2-533
Potter-Elvehjen Tissue Grinder, 30 ml.	WHEATON	358049
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
SW 40 Ti	beckman coulter	331301
TOYOPEARL DEAE-650C	Tosoh Bioscience	7988
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
β-DDM	Glycon - Biochemicals GmbH	D97002	Stored as 10% stocks at -20 °C