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摘要

本协议描述了一种基于网络药理学预测和代谢组学验证的探索叶藻对抗高脂血症的关键靶点和机制的综合策略。

摘要

高脂血症已成为全球心血管疾病和肝损伤的主要危险因素。在中医和印度医学理论中，Fructus Phyllanthi（FP）是一种有效的抗高脂血症药物，但其潜在机制有待进一步探索。本研究旨在基于网络药理学预测与代谢组学验证相结合的综合策略，揭示FP对抗高脂血症的机制。通过评估血浆脂质水平，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），建立了高脂肪饮食（HFD）诱导的小鼠模型。应用网络药理学找出FP的有效成分和抗高脂血症的潜在靶点。进行血浆和肝脏代谢组学鉴定正常组、模型组和干预组的差异代谢产物及其对应通路。进一步构建网络药理学与代谢组学的关系，全面了解FP抗高脂血症的过程。通过分子对接验证获得的关键靶蛋白。这些结果表明，FP改善了HFD诱导的高脂血症的血脂水平和肝损伤。没食子酸、槲皮素和β-谷甾醇在FP中被证明是关键的活性化合物。通过代谢组学发现血浆和肝脏中分别有16种和6种潜在差异代谢物参与FP对高脂血症的治疗效果。此外，整合分析表明，干预效果与CYP1A1、AChE和MGAM以及L-犬尿氨酸、皮质酮、乙酰胆碱和棉子糖的调节有关，主要涉及色氨酸代谢途径。分子对接确保了上述作用于高脂血症相关蛋白靶标的成分在降低脂质中发挥关键作用。综上所述，本研究为防治高脂血症提供了新的可能性。

引言

高脂血症是一种常见的代谢性疾病，严重影响人体健康，也是心血管疾病的主要危险因素1。最近，这种疾病出现了与年龄相关的下降趋势，由于长期不规律的生活方式和不健康的饮食习惯，年轻人变得更加易感2。在临床上，各种药物已被用于治疗高脂血症。例如，高脂血症和相关动脉粥样硬化性疾病患者最常用的药物之一是他汀类药物。然而，长期使用他汀类药物具有不容忽视的副作用，导致预后不良，例如不耐受，治疗耐药性和不良事件3，4。这些缺点已成为高脂血症患者的额外痛点。因此，应提出稳定的降脂效果和较少副作用的新疗法。

中医（TCM）因其疗效好、副作用少而被广泛用于治疗疾病5。Fructus Phyllanthi （FP），余甘子林恩的干果。（俗称余甘子或印度醋栗），是中印中药6、7的著名药食同源材料。根据中医理论8，该药已被用于清热，冷却血液和促进消化。现代药理研究表明，FP富含没食子酸、鞣花酸、槲皮素9等生物活性化合物，它们通过作为抗氧化剂、抗炎、护肝、抗降血脂等，具有一系列多方面的生物学特性10。最近的研究也表明，FP可以有效调节高脂血症患者的血脂。例如，Variya等人11已经证明，FP果汁及其主要化学成分没食子酸可以降低血浆胆固醇，减少肝脏和主动脉中的油脂浸润。治疗效果与FP调节增加过氧化物酶体增殖物激活受体α的表达和降低肝质活性有关。然而，FP改善高脂血症的潜在机制有待进一步研究，因为它的生物活性成分相当广泛。我们试图探索FP治疗效果的潜在机制，这可能有利于该药物的进一步开发和利用。

目前，网络药理学被认为是研究中医治疗机制的一种整体有效的技术。构建完整的药物-成分-基因-疾病网络，寻找多成分药物综合治疗的多靶点机制，而不是寻找单一的致病基因和治疗单个靶点的药物12。这种技术特别适用于中医，因为它们的化学成分很大。不幸的是，网络药理学在理论上只能用于预测受化学成分影响的靶点。应观察疾病模型中的内源性代谢物，以验证网络药理学的有效性。随着系统生物学的发展而出现的代谢组学方法是监测内源性代谢物变化的重要工具13。代谢产物的变化反映了宿主的稳态变化，也是研究内部机制的重要指标。一些研究人员成功地整合了网络药理学和代谢组学，探索了药物与疾病之间的相互作用机制14，15。

本文通过整合网络药理学和代谢组学技术，探讨FP对抗高脂血症的机制基础。应用网络药理学分析FP中主要活性成分与高脂血症分子靶点的关系。随后，进行代谢组学观察动物模型中内源性代谢物的变化，这可以解释药物在代谢水平的作用。与单纯应用网络药理学或代谢组学相比，这种综合分析提供了更具体、更全面的研究机制。此外，分子对接策略用于分析活性成分与关键蛋白质之间的相互作用。总的来说，这种综合方法可以弥补网络药理学实验证据的缺乏和代谢组学方法缺乏内源性机制的不足，可用于天然药物的治疗机制分析。该协议的主要原理图流程图如图 1所示。

研究方案

所有涉及动物处理的程序均按照《成都中医药大学实验动物护理和使用指南》进行，并经成都中医药大学机构伦理委员会批准（协议编号2020-36）。雄性C57BL / 6小鼠（20±2g）用于本研究。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 基于网络药理学的预测

注:网络药理学用于预测FP对抗高脂血症的活性成分及其关键靶点。

  1. 活性成分和关键目标的选择
    1. 在中药系统药理学数据库（TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php）中搜索关键词"叶藻"，获取FP候选活性成分和靶点列表。
      注意:通常，数据库中只有口服生物利用度（OB）≥30%和药物样（DL）值≥0.18的成分才作为活性成分包括在内。
    2. 在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/），在线孟德尔遗传在人类数据库（OMIM;https://omim.org/）和治疗靶点数据库（TTD;http://db.idrblab.net/ttd/）中搜索关键字"高脂血症"，以获得高脂血症的相应候选靶点。下载疾病目标电子表格。删除重复靶点，获取高脂血症靶点列表。
    3. 将步骤 1.1.1 和 1.1.2 中的这些列表复制到新的电子表格中。使用工具栏中的"数据 - 识别重复项"功能获取交叉点目标。将交叉目标列表导入UniProtKB （http://www.uniprot.org/），以标准化基因和蛋白质名称。
      注意:这些目标与FP和高脂血症有关。因此，预测这些交叉靶点作为FP抗高脂血症的靶标。
  2. 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建
    1. 打开字符串数据库 （https://string-db.org/） 11.5.将FP抗高脂血症的交叉目标列表粘贴到"名称列表"对话框中。在"生物体"中选择智人 ，然后单击 搜索>继续。
      注意:人类和小鼠具有高度相似的基因。因此，用小鼠进行进一步的实验验证。
    2. 当结果可用时，在"高级设置"中 勾选隐藏网络中断开连接的节点 。在"所需的最低交互分数"中设置 最高置信度 （0.900）， 然后单击" 更新 "按钮。
    3. 单击标题栏中的 导出 ，然后下载 PNG 和 TSV 格式的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络的简短表格文本。
  3. 构建药物-成分-疾病-靶点网络
    1. 打开细胞景观3.9.1（见 材料表）。导入步骤 1.2.3 的 TSV 格式文件。通过控制面板中的样式栏优化网络节点的颜色、字体和侧面。
    2. 使用"分析网络"功能进行网络拓扑分析。通过CytoHubba在Cytoscape中获得枢纽基因。建立药物-成分-靶点-疾病网络。
  4. GO和KEGG富集分析
    1. 打开大卫生物信息学资源（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）。单击"开始分析 "并将目标列表粘贴到左侧对话框中。在"选择标识符"中选择 官方基因符号 。在"选择物种"中选择智 人 。在"列表类型"中勾选 基因列表 。点击 提交列表。
    2. 当结果可用时， 单击使用DAVID工具之一分析上面的基因列表。蜱 GOTERM_BP_DIRECT，GOTERM_CC_DIRECT，GOTERM_MF_DIRECT "基因本体"，用于GO功能富集分析。在"途径"中勾选 KEGG_Pathway ，以进行KEGG途径富集分析。
    3. 单击 "功能注释图 "以显示结果。
      注意:将富集分析的统计显著性阈值设置为 p < 0.05。

2. 实验设计

  1. FP水提取物的制备
    注:FP在成都中医药大学8师林娜教授的实验室处理。
    1. 将FP（90g）的干粉浸泡在干净的2L容量瓶中的1L纯水中。使用超声波处理（在4°C水浴中，功率:250W，频率:35kHz）帮助溶解30分钟。过滤溶液，用双层1mm x 1mm无菌医用纱布获得提取物。重复上述操作三次，以确保FP完全溶解。
    2. 使用旋转蒸发法进一步浓缩。将转速设置为50 rpm，温度为60°C，持续4小时。将水提取物浓缩至 100 mL。
    3. 将FP（0.9克/毫升）的粗提取物均匀分成两份（50毫升）。一份用作高剂量FP液体（0.9 g / mL）。将 50 mL 纯水加入另一部分，并将其视为低剂量 FP 液体 （0.45 g/mL）。使用高剂量和低剂量FP水溶液进行给药。将液体储存在-20°C直至使用。
  2. 动物制备
    1. 在室温下将50只雄性C57BL / 6小鼠（20±2g）置于通风良好的房间中，具有12小时的明暗循环，并可自由获取食物和纯净水。
    2. 将小鼠随机分为两组:喂养10只正常饮食的小鼠和高脂肪饮食的40只小鼠（参见 材料表）以诱导高脂血症。
      注意:喂食8周后，筛选小鼠以进行进一步的药物干预。
    3. 在第8周，从每个小鼠眼眶中提取约200μL血液。在4°C下以5，733× g 离心血液10分钟以获得血浆样品。使用市售检测试剂盒测定TC和TG水平（参见 材料表）。
    4. 选择六只脂质水平最正常的小鼠作为无治疗对照（NC）组。选择24只血脂水平明显较高的小鼠作为高脂饮食组，并随机分为4组:高脂饮食（HFD）组、低剂量FP（FP_L）组、高剂量FP（FP_H）组和阳性对照（PC）组。
    5. 分别用两种剂量的FP（低剂量，4.5 g / kg和高剂量，9 g / kg）对FP_L和FP_H组进行胃冲洗;用辛伐他汀片剂（5mg / kg;见 材料表）对PC组进行胃冲洗;并用相同体积的生理盐水对NC和HFD组进行胃冲洗，每天一次，持续4周。
      注意:目前的研究使用FP和辛伐他汀的水溶液进行治疗。
    6. 在第12周，用1%戊巴比妥钠（30mg / kg）麻醉后，处死所有组的小鼠。从每只小鼠的眼眶静脉收集~400μL血液样本。
      注意:用镊子刺激小鼠的脚趾和脚底。如果没有反应，则证明麻醉充分。
    7. 在4°C下以5，733× g 离心血液10分钟以获得血浆样品，并使用市售的测定试剂盒测定TC，TG，LDL-C和HDL-C水平（参见 材料表）。获取肝组织样本16 并对其进行组织病理学分析。使用剩余的血浆和肝脏样本进行代谢组学分析（步骤3）。
      注意:所有样品均储存在-80°C直至使用。
  3. 肝脏组织病理学检查
    1. 用4%多聚甲醛溶液固定新鲜肝组织超过24小时。从固定剂中取出组织，并用手术刀平滑目标组织。将组织和相应的标签放入脱水机中。
    2. 在乙醇梯度中脱水:75%酒精4小时，85%酒精2小时，90%酒精2小时，95%酒精1小时，无水乙醇1小时，二甲苯30分钟。将组织盒放入石蜡中的组织模具中洗涤三次，每次30分钟16。
    3. 将浸蜡的组织放入组织嵌入器中（见 材料表）。在蜡凝固之前，从脱水机中取出组织，将它们放入嵌入的盒子中，并贴上相应的标签。
    4. 在-20°C冷冻台中冷却蜡块，将它们从嵌入框架中取出，然后修剪蜡块。
    5. 使用切片机将修剪好的蜡块切成3μm厚的部分（见 材料表）。将切片漂浮在40°C的水中，将它们从载玻片中取出，然后在60°C的烤箱中烘烤。用水和干蜡烘烤后，将其取出并保持在室温下。
    6. 依次将切片放入二甲苯I中10分钟，二甲苯II放置10分钟，二甲苯III放置10分钟，无水乙醇I放置5分钟，无水乙醇II放置5分钟，75%酒精放置5分钟，用水洗涤16。
    7. 用苏木精染色溶液染色切片4分钟，1%盐酸醇溶液（75%酒精）进行区分，1%氨水溶液背蓝色，并用水洗涤。
    8. 用伊红染色溶液染色切片2分钟，然后用水洗涤。
    9. 使用放大倍率为200x和400x的光学显微镜观察切片。
  4. 液相色谱-质谱）LC-MS）分析
    1. FP的成分鉴定
      注:分析使用超高效液相色谱法结合混合四极杆-轨道高分辨率质谱法（UPLC-Q-Orbirap HRMS，LC-MS;见 材料表）进行。
      1. 精确测量1g干燥的FP粉末，并将其放入干净的50mL容量瓶中。
      2. 向容量瓶中加入25 mL 70%甲醇并准确称定。使用超声波处理（在4°C水浴中，功率:250W，频率:35kHz）30分钟以帮助溶解。再次准确称定，精确测定溶解后的损失，并用70%甲醇弥补损失。
        注意:不要测量体积，因为容量瓶的刻度不准确，尤其是在4°C水浴后。
      3. 摇晃以充分混合。使用0.22μm微孔膜进行过滤。
    2. 血浆样品制备
      1. 将 100 μL 血浆（步骤 2.2.7）精确加入 1.5 mL 离心管中的双倍体积 （200 μL） 乙腈中，并用涡旋振动器涡旋至少 30 秒。对所有示例执行此过程。
      2. 在4°C下以17，200× g 离心所有样品10分钟。 离心后将上清液转移到新的 1.5 mL 离心管中。在氮气下干燥上清液。用 200 μL 提取溶剂（乙腈:水 = 4:1 [v/v]）复溶。
      3. 涡旋重构溶液至少30秒，并使用超声波处理10分钟（在4°C水浴中，功率:250W，频率:35kHz）。在4°C下以17，200× g 离心10分钟。
      4. 用0.22μm滤膜过滤上清液，并将其保持在4°C进行分析。
    3. 肝脏样本制备
      1. 将90mg肝组织（步骤2.2.7）在冰冷的甲醇 - 水（1:1，v / v，1mL）中匀浆1分钟，并在4°C下以21，500× g 离心10分钟。 将上清液转移到 1.5 mL 离心管中。对所有示例执行此过程。
      2. 按照相同的步骤再次提取沉淀物，并将上清液汇集到新的 1.5 mL 离心管中。在氮气下干燥上清液。用 300 μL 提取溶剂（甲醇:水 = 4:1 [v/v]）复溶。
      3. 涡旋重构溶液至少30秒，并使用超声波处理10分钟（在4°C水浴中，功率:250W，频率:35kHz）。在4°C下以17，200× g 离心15分钟。
      4. 用0.22μm滤膜过滤上清液，并将其保持在4°C进行分析。
        注意:混合质控（QC）样品是通过混合来自每个血浆和肝脏样品的10μL等分试样（每六个样品一个）来制备的。
    4. LC-MS分析参数
      注意:流动相由0.1%甲酸（溶剂A）和乙腈（溶剂B）组成。将这些溶剂转移到干净的玻璃瓶中，并将它们与LC-MS系统连接。
      1. 在LC-MS系统的"入口文件"中设置血浆样品的梯度程序如下:1%B（0-1.5分钟），1%-60%B（1.5-13.0分钟），60%-99%B（13.0-20.0分钟），保持在99%B（20.0-25.0分钟），99%-1%B（25.0-25.1分钟），并保持在1%B直到27分钟。
      2. 在LC-MS系统的"入口文件"中设置血浆样品的自动进样器条件如下:进样体积，2 μL;以及每次分析的流速 0.3 mL/min。
      3. 在LC-MS系统的"入口文件"中设置肝脏样品的梯度程序如下:1%B（0-1分钟），1%-53%B（1-15分钟），53%-70%B（15-30分钟），70%-90%B（30-32分钟），90%-95%B（32-40分钟），95%-1%B（40-42分钟），并保持在1%B直到45分钟。
      4. 在LC-MS系统的"入口文件"中设置肝脏样品的自动进样器条件如下:进样体积，5 μL;以及每次分析的流速 0.3 mL/min。
      5. 在LC-MS系统的"MS调谐文件"中设置血浆和肝脏样品的MS检测条件。使用正电离和负电离模式进行MS采集。
        注:加热电喷雾电离参数如下:喷雾电压:正电离3.5kV，负电离3.8kV;护套气体流量:55 ARB;辅助气体流量:15 ARB;探头加热器温度:300°C;毛细管温度:350°C。
      6. 将收集的原始数据导入化合物发现器软件，并按照制造商的说明设置方法模板（参见 材料表）。

3. 代谢组学验证

注意:血浆和肝脏代谢物的代谢组学分析数据导入化合物发现器软件，通过采用分子特征提取算法进行代谢特征提取。参数设置如下:质量偏差，5 x 10-6;质量范围，100-1，500;信噪比 （SNR） 阈值，3;和保留时间偏差，0.05。通过QC峰面积的相对标准偏差（RSD）评估代谢组学的稳定性和可重复性。

  1. 使用SIMCA-P软件（参见 材料表）对LC-MS结果获得的积分值进行多变量统计分析。对均值中心数据和样本类建模使用正交偏最小二乘判别分析 （OPLS-DA）。
  2. 在OPLS-DA检验之后，考虑代谢物，在学生t检验的投影（VIP）值中具有可变重要性的积分>1和p值<0.05作为潜在的差异代谢物。
  3. 通过开放数据库来源识别干扰的代谢物和代谢途径，包括人类代谢组（HMDB; http://www.hmdb.ca/），京都基因和基因组百科全书（KEGG; https://www.kegg.jp/）和MetaboAnalyst5.0（https://www.metaboanalyst.ca/）。
  4. 通过MetaboAnalyst5.0和"Wu Kong"平台（https://www.omicsolution.com/wkomics/main/）可视化结果视图。

4. 分子对接

  1. 分别从TCMSP数据库中下载所选FP成分的3D结构。在"化学名称"搜索框中搜索成分名称，并以mol2格式下载相应的3D结构文件。
  2. 从AlphaFold蛋白结构数据库（AlphaFold DB;，https://alphafold.ebi.ac.uk/）下载关键靶标的晶体结构。在搜索框中搜索目标名称，下载pdb格式的相应晶体结构文件。
  3. 将成分和目标结构文件导入AutoDockTools软件。单击 编辑>删除水 以删除水分子。单击" 编辑>氢">"添加 "以添加氢。将成分设置为"配体"，并通过选择整个靶标作为"受体"来执行盲对接17。
  4. 在"中心"和"大小"后面的框中输入一个值以调整新开发的空间，从而可以完全包含配体和受体。以 pdbqt 格式保存配体和受体文件。
  5. 使用 AutoDock Vina 执行分子对接。将"受体"栏设置为"receptor.pdbqt"的名称，将"配体"栏设置为"ligand.pdbqt"的名称。获得配体与受体结合的最佳位置。记录最佳位置的结合能值。
    注意:对接过程由遗传算法14 计算。所有停靠运行选项均为默认值。对接框架将自动从最高到最低的绑定能量排名。
  6. 将对接文件导入PILP（蛋白质-配体相互作用分析器 https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index）以获取视觉系统模型。下载 pse 格式的模型文件，并将其导入 PyMOL 软件（参见材料表）以构建进一步的可视化。

5. 统计分析

注意:使用SPSS统计软件（见 材料表）进行数据分析。将 p < 0.05 的值视为具有统计显著性。

  1. 将值表示为标准差 （SD） ±均值。
  2. 执行单因素方差分析，然后是事后最小显著差异 （LSD）、Dunnett（方差相等）或邓内特 T3（方差不相等的情况下），以检验组间的统计显著性。

结果

网络药理学
根据数据库和LC-MS分析的药代动力学和药效学特性，共筛选了FP中的18种潜在成分（总离子色谱图见 补充图1）。通过相关文献，没食子酸的含量远高于其他成分，可有效降低脂质9，11。因此，这种成分也被认为是一种潜在的成分。总共确定了19个成分和134个与FP相关的成分目标。所有19种成分如 表1所示...

讨论

近年来，高脂血症的发病率一直在上升，主要是由于长期不健康的饮食习惯。中药及其化学成分具有多种药理活性，近年来已被广泛研究37，38。FP是一种水果资源，既可用作药物，又可用作食品，具有治疗高脂血症的重要潜力。然而，FP对抗高脂血症的潜在治疗机制有待进一步研究。

网络药理学在分子水平上评估药物多药理作用，?...

披露声明

所有作者都声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中医养生康复产品开发创新团队（2022C005）和"养生康复+"新业务跨界融合研究的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

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