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Résumé

Le présent protocole décrit une stratégie intégrée pour explorer les cibles et mécanismes clés de Fructus Phyllanthi contre l’hyperlipidémie basée sur la prédiction pharmacologique en réseau et la vérification métabolomique.

Résumé

L’hyperlipidémie est devenue l’un des principaux facteurs de risque de maladies cardiovasculaires et de lésions hépatiques dans le monde entier. Fructus Phyllanthi (FP) est un médicament efficace contre l’hyperlipidémie dans les théories de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) et de la médecine indienne, mais le mécanisme potentiel nécessite une exploration plus approfondie. La présente recherche vise à révéler le mécanisme de la PF contre l’hyperlipidémie en s’appuyant sur une stratégie intégrée combinant la prédiction de la pharmacologie des réseaux et la validation métabolomique. Un modèle de souris induites par un régime riche en graisses (HFD) a été établi en évaluant les taux de lipides plasmatiques, y compris le cholestérol total (TC), les triglycérides (TG), le cholestérol à lipoprotéines de basse densité (LDL-C) et le cholestérol à lipoprotéines de haute densité (HDL-C). La pharmacologie de réseau a été appliquée pour découvrir les ingrédients actifs de la PF et les cibles potentielles contre l’hyperlipidémie. La métabolomique du plasma et du foie a été réalisée pour identifier les métabolites différentiels et leurs voies correspondantes parmi le groupe normal, le groupe modèle et le groupe d’intervention. La relation entre la pharmacologie de réseau et la métabolomique a été construite pour obtenir une vue complète du processus de PF contre l’hyperlipidémie. Les protéines cibles clés obtenues ont été vérifiées par amarrage moléculaire. Ces résultats ont montré que la PF améliorait les taux de lipides plasmatiques et les lésions hépatiques de l’hyperlipidémie induite par une HFD. L’acide gallique, la quercétine et le bêta-sitostérol dans la PF ont été démontrés comme les composés actifs clés. Un total de 16 et six métabolites différentiels potentiels dans le plasma et le foie, respectivement, se sont révélés impliqués dans les effets thérapeutiques de la PF contre l’hyperlipidémie par métabolomique. En outre, l’analyse d’intégration a indiqué que les effets de l’intervention étaient associés au CYP1A1, à l’AChE et au MGAM, ainsi qu’à l’ajustement de la L-kynurénine, de la corticostérone, de l’acétylcholine et du raffinose, impliquant principalement la voie métabolique du tryptophane. L’amarrage moléculaire a permis de s’assurer que les ingrédients ci-dessus agissant sur les cibles protéiques liées à l’hyperlipidémie jouaient un rôle clé dans la réduction des lipides. En résumé, cette recherche a fourni une nouvelle possibilité pour prévenir et traiter l’hyperlipidémie.

Introduction

L’hyperlipidémie est une maladie métabolique courante ayant de graves répercussions sur la santé humaine et constitue également le principal facteur de risque de maladies cardiovasculaires1. Récemment, il y a eu une tendance à la baisse liée à l’âge pour cette maladie, et les jeunes sont devenus plus sensibles en raison de modes de vie irréguliers à long terme et d’habitudes alimentaires malsaines2. En clinique, divers médicaments ont été utilisés pour traiter l’hyperlipidémie. Par exemple, l’un des médicaments les plus couramment utilisés pour les patients atteints d’hyperlipidémie et de troubles athérosclérotiques connexes est les statines. Cependant, l’utilisation à long terme des statines a des effets secondaires qui ne peuvent pas être négligés, ce qui conduit à un mauvais pronostic, tels que l’intolérance, la résistance au traitement et les événements indésirables 3,4. Ces lacunes sont devenues des douleurs supplémentaires pour les patients hyperlipidémiques. Par conséquent, de nouveaux traitements pour une efficacité hypolipidémiante stable et moins d’effets secondaires devraient être proposés.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a été largement utilisée pour traiter les maladies en raison de sa bonne efficacité et de ses effets secondairespeu 5. Fructus Phyllanthi (FP), le fruit séché de Phyllanthus emblica Linn. (populairement connu sous le nom de baie d’amla ou groseille à maquereau indienne), est un médicament célèbre et un matériau homologue alimentaire des médecines traditionnelles chinoises et indiennes 6,7. Ce médicament a été utilisé pour éliminer la chaleur, refroidir le sang et favoriser la digestion, selon les théories de la MTC8. Des études pharmacologiques modernes ont montré que la PF est riche en composés bioactifs tels que les acides galliques, les acides ellagiques et la quercétine9, qui sont responsables d’une gamme de propriétés biologiques multiformes, en agissant comme antioxydant, anti-inflammatoire, protection du foie, antihypolipidémique, etc.10. Des recherches récentes ont également montré que la PF pouvait réguler efficacement les lipides sanguins des patients atteints d’hyperlipidémie. Par exemple, Variya et al.11 ont démontré que le jus de fruit FP et son principal ingrédient chimique de l’acide gallique peuvent diminuer le cholestérol plasmatique et réduire l’infiltration d’huile dans le foie et l’aorte. L’efficacité thérapeutique était liée à la régulation de la PF dans l’augmentation de l’expression du récepteur alpha activé par les proliférateurs de peroxysomes et la diminution de l’activité lipogénique hépatique. Cependant, le mécanisme sous-jacent de la PF dans l’amélioration de l’hyperlipidémie devrait être étudié plus avant, car ses ingrédients bioactifs sont assez étendus. Nous avons cherché à explorer le mécanisme potentiel de l’efficacité thérapeutique de la PF, qui pourrait être bénéfique pour le développement et l’utilisation ultérieurs de ce médicament.

Actuellement, la pharmacologie en réseau est considérée comme une technique holistique et efficace pour étudier le mécanisme thérapeutique de la MTC. Au lieu de rechercher des gènes et des médicaments uniques causant la maladie traitant uniquement une cible individuelle, un réseau complet médicament-ingrédients-gènes-maladies est construit pour trouver le mécanisme multi-cible du médicament multi-ingrédients concernant leur traitement complet12. Cette technique est particulièrement adaptée à la MTC, car leurs compositions chimiques sont massives. Malheureusement, la pharmacologie de réseau ne peut être utilisée que pour prévoir les cibles affectées par les ingrédients chimiques en théorie. Les métabolites endogènes dans le modèle de maladie doivent être observés pour valider l’efficacité de la pharmacologie en réseau. La méthode métabolomique, qui émerge avec le développement de la biologie des systèmes, est un outil important pour surveiller les changements dans les métabolites endogènes13. Les changements dans les métabolites reflètent les changements d’état stationnaire de l’hôte, ce qui est également un indicateur important pour étudier le mécanisme interne. Certains chercheurs ont intégré avec succès la pharmacologie et la métabolomique en réseau pour explorer le mécanisme d’interaction entre les médicaments et les maladies14,15.

Cet article explore les bases mécanistes de la PF contre l’hyperlipidémie en intégrant la pharmacologie en réseau et les techniques de métabolomique. La pharmacologie de réseau a été appliquée pour analyser la relation entre les principaux ingrédients actifs de la PF et les cibles moléculaires de l’hyperlipidémie. Par la suite, la métabolomique a été réalisée pour observer le changement des métabolites endogènes dans le modèle animal, ce qui peut expliquer les actions du médicament au niveau métabolique. Par rapport à l’application de la pharmacologie de réseau ou de la métabonomique seule, cette analyse intégrée a fourni un mécanisme de recherche plus spécifique et plus complet. De plus, la stratégie d’amarrage moléculaire a été utilisée pour analyser l’interaction entre les ingrédients actifs et les protéines clés. En général, cette approche intégrée pourrait compenser le manque de preuves expérimentales pour la pharmacologie des réseaux et l’absence d’un mécanisme endogène pour la méthode métabolomique, et peut être utilisée pour l’analyse du mécanisme thérapeutique de la médecine naturelle. L’organigramme schématique principal du protocole est illustré à la figure 1.

Protocole

Toutes les procédures impliquant la manipulation des animaux ont été menées conformément au Guide de soins et d’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu et ont été approuvées par le Comité d’éthique institutionnel de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (protocole numéro 2020-36). Des souris C57BL/6 mâles (20 ± 2 g) ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Prédiction basée sur la pharmacologie en réseau

REMARQUE: La pharmacologie du réseau est utilisée pour prédire les ingrédients actifs et leurs principales cibles de PF contre l’hyperlipidémie.

  1. Sélection des ingrédients actifs et des cibles clés
    1. Recherchez le mot-clé « Phyllanthi Fructus » dans la base de données pharmacologiques du système de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) pour obtenir la liste des ingrédients actifs candidats et des cibles de la PF.
      REMARQUE : Normalement, seuls les ingrédients ayant une biodisponibilité orale (BO) ≥30 % et des valeurs semblables à celles d’un médicament (DL) ≥0,18 dans la base de données sont inclus comme ingrédients actifs.
    2. Recherchez le mot-clé « hyperlipidémie » dans la base de données GeneCards (https://www.genecards.org/), la base de données Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; https://omim.org/) et la base de données de cibles thérapeutiques (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) pour obtenir les cibles candidates respectives de l’hyperlipidémie. Téléchargez les feuilles de calcul des cibles de la maladie. Supprimer les cibles répétées pour obtenir la liste des cibles d’hyperlipidémie.
    3. Copiez ces listes des étapes 1.1.1 et 1.1.2 dans une nouvelle feuille de calcul. Utilisez la fonction « Données - Identifier les doublons » de la barre d’outils pour obtenir des cibles d’intersection. Importez la liste des cibles d’intersection dans UniProtKB (http://www.uniprot.org/) pour normaliser les noms des gènes et des protéines.
      REMARQUE: Ces cibles sont liées à la fois à la PF et à l’hyperlipidémie. Par conséquent, prédire ces cibles d’intersection comme cibles de la PF contre l’hyperlipidémie.
  2. Construction d’un réseau d’interaction protéine-protéine
    1. Ouvrez la base de données STRING (https://string-db.org/) 11.5. Collez la liste des cibles d’intersection de FP contre l’hyperlipidémie dans la boîte de dialogue « Liste des noms ». Sélectionnez Homo sapiens dans « Organismes » et cliquez sur le bouton RECHERCHER > CONTINUER.
      REMARQUE: Les humains et les souris ont des gènes très similaires. Par conséquent, une vérification expérimentale supplémentaire est effectuée avec des souris.
    2. Lorsque les résultats sont disponibles, cochez la case Masquer les nœuds déconnectés du réseau dans « Paramètres avancés ». Définissez la confiance la plus élevée (0,900) dans le « score d’interaction minimum requis », puis cliquez sur le bouton METTRE À JOUR .
    3. Cliquez sur Exportations dans la barre de titre et téléchargez le court texte tabulaire du réseau d’interaction protéine-protéine (PPI) au format PNG et TSV.
  3. Construction d’un réseau médicament-composant-maladie-cible
    1. Ouvrez Cytoscape 3.9.1 (voir le tableau des matériaux). Importez le fichier au format TSV de l’étape 1.2.3. Optimisez la couleur, la police et le côté des nœuds réseau via la barre de style du panneau de configuration.
    2. Utilisez la fonction « Analyser le réseau » pour l’analyse de la topologie du réseau. Obtenir des gènes de hub par CytoHubba dans Cytoscape. Établir le réseau médicament-ingrédient-cible-maladie.
  4. Analyse d’enrichissement GO et KEGG
    1. Ouvrez DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Cliquez sur Démarrer l’analyse et collez la liste des cibles dans la boîte de dialogue de gauche. Sélectionnez SYMBOLE OFFICIEL DU GÈNE dans « Sélectionner l’identifiant ». Sélectionnez Homo sapiens dans « Sélectionner une espèce ». Liste des gènes de tiques dans « Type de liste ». Cliquez sur Soumettre la liste.
    2. Lorsque les résultats sont disponibles, cliquez sur Analyser la liste des gènes ci-dessus avec l’un des outils DAVID. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT dans « Gene Ontology » pour l’analyse de l’enrichissement de la fonction GO. Cochez KEGG_Pathway dans « Voies » pour l’analyse de l’enrichissement des voies KEGG.
    3. Cliquez sur Tableau d’annotation fonctionnel pour afficher les résultats.
      REMARQUE : Définissez le seuil de signification statistique de l’analyse d’enrichissement à p < 0,05.

2. Conception expérimentale

  1. La préparation d’extrait aqueux FP
    NOTE: La PF est traitée dans le laboratoire du professeur Lina Xia à l’Université de Chengdu de TCM8.
    1. Faire tremper la poudre séchée de FP (90 g) dans 1 L d’eau pure dans une fiole jaugée propre de 2 L. Utilisez un traitement par ultrasons (au bain-marie à 4 °C, puissance: 250W, fréquence: 35 kHz) pour aider à dissoudre pendant 30 min. Filtrer la solution pour obtenir l’extrait avec une gaze médicale stérile à double couche de 1 mm x 1 mm. Répétez l’opération ci-dessus trois fois pour assurer la dissolution complète de FP.
    2. Utilisez la méthode d’évaporation rotative pour une concentration supplémentaire. Réglez la vitesse de rotation à 50 tr/min avec une température de 60 °C pendant 4 h. Concentrer l’extrait aqueux à 100 mL.
    3. Répartir uniformément l’extrait brut de PF (0,9 g/mL) en deux parties (50 mL). Une partie est utilisée comme liquide FP à forte dose (0,9 g/mL). Ajouter 50 mL d’eau pure dans une autre partie et la considérer comme le liquide FP à faible dose (0,45 g / mL). Utilisez les solutions aqueuses FP à forte et faible dose pour l’administration. Conserver le liquide à -20 °C jusqu’à utilisation.
  2. Préparation des animaux
    1. Hébergez 50 souris C57BL/6 mâles (20 ± 2 g) dans une pièce bien ventilée à température ambiante, avec un cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès gratuit à la nourriture et à l’eau pure.
    2. Assignez au hasard les souris à deux groupes: nourrir 10 souris avec un régime alimentaire normal et 40 souris avec un régime riche en graisses (voir le tableau des matériaux) pour induire une hyperlipidémie.
      REMARQUE: Après avoir nourri pendant 8 semaines, les souris ont été examinées pour une intervention médicamenteuse supplémentaire.
    3. Au cours de la 8e semaine, prélevez environ 200 μL de sang de chaque orbite de souris. Centrifuger le sang pendant 10 min à 5 733 x g à 4 °C pour obtenir des échantillons de plasma. Déterminer les niveaux de CT et de TG à l’aide de trousses d’essai disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
    4. Sélectionnez six souris avec les niveaux de lipides les plus normaux comme groupe témoin sans traitement (NC). Sélectionnez 24 souris avec un taux de lipides significativement plus élevé comme groupe de régime riche en graisses et divisez-les au hasard en quatre groupes: groupe régime riche en graisses (HFD), groupe PF à faible dose (FP_L), groupe PF à forte dose (FP_H) et groupe témoin positif (PC).
    5. Administrer une irrigation gastrique aux groupes FP_L et FP_H avec deux doses de PF (faible dose, 4,5 g / kg et dose élevée, 9 g / kg), respectivement; irrigation gastrique vers le groupe PC avec des comprimés de simvastatine (5 mg/kg; voir tableau des matières); et l’irrigation gastrique vers les groupes NC et HFD avec le même volume de solution saline physiologique une fois par jour pendant 4 semaines.
      NOTE: L’étude actuelle a utilisé les solutions aqueuses de PF et de simvastatine pour le traitement.
    6. Dans la 12ème semaine, après anesthésie par 1% de pentobarbital sodique (30 mg / kg), sacrifiez les souris de tous les groupes. Prélever des échantillons de sang de ~400 μL dans la veine orbitaire de chaque souris.
      REMARQUE: Stimulez les orteils et la plante des souris avec une pince à épiler. S’il n’y a pas de réaction, cela prouve une anesthésie adéquate.
    7. Centrifuger le sang pendant 10 minutes à 5 733 x g à 4 °C pour obtenir des échantillons de plasma et déterminer les taux de TC, TG, LDL-C et HDL-C à l’aide de trousses de dosage disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Obtenir des échantillons de tissus hépatiques16 et les soumettre à une analyse histopathologique. Utilisez les échantillons de plasma et de foie restants pour l’analyse métabolomique (étape 3).
      NOTE: Tous les échantillons sont conservés à -80 ° C jusqu’à utilisation.
  3. Examen histopathologique du foie
    1. Fixer les tissus frais du foie avec une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant plus de 24 h. Retirez le tissu du fixateur et lissez les tissus cibles avec un scalpel. Placez le mouchoir et l’étiquette correspondante dans le déshydrateur.
    2. Déshydrater dans un gradient d’éthanol : 75% d’alcool pendant 4 h, 85% d’alcool pendant 2 h, 90% d’alcool pendant 2 h, 95% d’alcool pendant 1 h, éthanol absolu pendant 1 h, xylène pendant 30 min. Placer la cassette de tissu dans un moule en tissu dans de la cire de paraffine pendant trois lavages, 30 min chacun16.
    3. Mettez les mouchoirs imbibés de cire dans l’encastrement de tissu (voir le tableau des matériaux). Avant que la cire ne se solidifie, retirez les tissus du déshydrateur, placez-les dans la boîte intégrée et collez l’étiquette correspondante.
    4. Refroidissez les blocs de cire dans une table de congélation à -20 °C, retirez-les du cadre encastré et coupez le bloc de cire.
    5. Couper les blocs de cire coupés en sections de 3 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome (voir le tableau des matériaux). Faire flotter les sections dans de l’eau à 40 °C, les retirer des lames et les cuire dans un four à 60 °C. Après avoir cuit avec de l’eau et de la cire sèche, sortez-le et conservez-le à température ambiante.
    6. Placer successivement les sections dans le xylène I pendant 10 min, le xylène II pendant 10 min, le xylène III pendant 10 min, l’éthanol absolu I pendant 5 min, l’éthanol absolu II pendant 5 min, l’alcool à 75% pendant 5 min, et laver à l’eau16.
    7. Colorer les sections avec une solution de coloration à l’hématoxyline pendant 4 min, une solution d’alcool d’acide chlorhydrique à 1% (alcool à 75%) pour la différenciation, une solution d’eau ammoniacale à 1% en bleu et les laver à l’eau.
    8. Colorer les sections avec une solution de coloration à l’éosine pendant 2 min et les laver à l’eau.
    9. Observez les coupes à l’aide d’un microscope optique avec un grossissement de 200x et 400x.
  4. Chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) analyse
    1. Identification des ingrédients de la PF
      REMARQUE : L’analyse est effectuée à l’aide d’une chromatographie liquide à ultra-haute performance couplée à une spectrométrie de masse hybride quadripôle-orbitrap à haute résolution (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; voir le tableau des matériaux).
      1. Mesurer précisément 1 g de poudre séchée de FP et la mettre dans une fiole jaugée propre de 50 mL.
      2. Ajouter 25 ml de méthanol à 70 % dans la fiole jaugée et peser avec précision. Utiliser un traitement par ultrasons (au bain-marie à 4 °C, puissance : 250 W, fréquence : 35 kHz) pendant 30 min pour faciliter la dissolution. Pesez à nouveau avec précision pour déterminer avec précision la perte après dissolution et utilisez 70% de méthanol pour compenser la perte.
        NOTE: Ne mesurez pas le volume, car l’échelle de la fiole jaugée n’est pas précise, surtout après le bain-marie à 4 ° C.
      3. Secouer pour bien mélanger. Utilisez une membrane microporeuse de 0,22 μm pour filtrer.
    2. Préparation d’échantillons de plasma
      1. Ajouter précisément 100 μL de plasma (étape 2.2.7) dans un double volume (200 μL) d’acétonitrile dans un tube centrifuge de 1,5 mL, et le vorter avec un vibrateur vortex pendant au moins 30 s. Suivez cette procédure pour tous les échantillons.
      2. Centrifuger tous les échantillons à 17 200 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer les surnageants après centrifugation dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL. Sécher les surnageants sous azote. Reconstituer avec 200 μL de solvant d’extraction (acétonitrile:eau = 4:1 [v/v]).
      3. Faire tourbillonner la solution reconstituée pendant au moins 30 s et utiliser un traitement par ultrasons pendant 10 min (au bain-marie à 4 °C, puissance : 250 W, fréquence : 35 kHz). Centrifuger à 17 200 x g pendant 10 min à 4 °C.
      4. Filtrer les surnageants avec des membranes filtrantes de 0,22 μm et les maintenir à 4 °C pour analyse.
    3. Préparation d’échantillons de foie
      1. Homogénéiser 90 mg de tissu hépatique (étape 2.2.7) pendant 1 min dans du méthanol-eau glacée (1:1, v/v, 1 mL) et les centrifuger à 21 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans des tubes centrifugés de 1,5 mL. Suivez cette procédure pour tous les échantillons.
      2. Extraire à nouveau les précipités en suivant la même procédure et regrouper les surnageants dans de nouveaux tubes à centrifuger de 1,5 mL. Sécher les surnageants sous azote. Reconstituer avec 300 μL du solvant d’extraction (méthanol:eau = 4:1 [v/v]).
      3. Faire tourbillonner la solution reconstituée pendant au moins 30 s et utiliser un traitement par ultrasons pendant 10 min (au bain-marie à 4 °C, puissance : 250 W, fréquence : 35 kHz). Centrifuger à 17 200 x g pendant 15 min à 4 °C.
      4. Filtrer les surnageants avec des membranes filtrantes de 0,22 μm et les maintenir à 4 °C pour analyse.
        REMARQUE : Les échantillons groupés de contrôle de la qualité (CQ) ont été préparés en mélangeant 10 μL d’aliquotes provenant de chaque échantillon de plasma et de foie (un échantillon pour six).
    4. Paramètres d’analyse de LC-MS
      NOTE: La phase mobile se compose de 0,1% d’acide formique (solvant A) et d’acétonitrile (solvant B). Transférez ces solvants dans une bouteille en verre propre et connectez-les au système LC-MS.
      1. Réglez les programmes de gradient des échantillons de plasma dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : 1 % B (0-1,5 min), 1 %-60 % B (1,5-13,0 min), 60 %-99 % B (13,0-20,0 min), maintenir à 99 % B (20,0-25,0 min), 99 %-1 % B (25,0-25,1 min) et maintenir à 1 % B jusqu’à 27 min.
      2. Réglez les conditions de l’échantillonneur automatique des échantillons de plasma dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : le volume d’injection, 2 μL ; et le débit, 0,3 mL/min, pour chaque analyse.
      3. Définir le programme de gradient des échantillons de foie dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : 1 % B (0-1 min), 1 %-53 % B (1-15 min), 53 %-70 % B (15-30 min), 70 %-90 % B (30-32 min), 90 %-95 % B (32-40 min), 95 %-1 % B (40-42 min), et maintenir à 1 % B jusqu’à 45 min.
      4. Réglez les conditions de l’échantillonneur automatique des échantillons de foie dans le « fichier d’entrée » du système LC-MS comme suit : volume d’injection, 5 μL; et le débit, 0,3 mL/min, pour chaque analyse.
      5. Réglez les conditions de détection de la SEP des échantillons de plasma et de foie dans le « fichier de réglage MS » du système LC-MS. Effectuez l’acquisition MS en utilisant les modes d’ionisation positive et négative.
        NOTE: Les paramètres d’ionisation par électropulvérisation chauffée sont les suivants: tension de pulvérisation: 3,5 kV pour l’ionisation positive et 3,8 kV pour l’ionisation négative; Débit de gaz de gaine: 55 arb; débit de gaz auxiliaire: 15 arb; température du chauffage de la sonde: 300 °C; et température capillaire : 350 °C.
      6. Importez les données brutes collectées dans le logiciel Compound Discoverer et définissez le modèle de méthode en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).

3. Validation métabolomique

REMARQUE: Les données de profilage métabolomique des métabolites plasmatiques et hépatiques sont importées dans le logiciel Compound Discoverer pour effectuer l’extraction des caractéristiques métaboliques en adoptant un algorithme d’extraction de caractéristiques moléculaires. Réglez les paramètres comme suit: écart de masse, 5 x 10-6; gamme de masse, 100-1 500; seuil du rapport signal sur bruit (SNR), 3; et écart de temps de rétention, 0,05. Évaluer la stabilité et la répétabilité de la métabolomique par l’écart-type relatif (DSR) des zones de pics de CQ.

  1. Utiliser le logiciel SIMCA-P (voir le tableau des matières) pour l’analyse statistique multivariée des valeurs intégrales obtenues à partir des résultats de la LC-MS. Utiliser l’analyse discriminante des moindres carrés partiels orthogonaux (OPLS-DA) pour les données centrées sur la moyenne et la modélisation des classes d’échantillons.
  2. Après le test OPLS-DA, considérez les métabolites, avec une importance intégrale variable dans les valeurs de projection (VIP) de >1 et une valeur p de <0,05 du test t de Student comme métabolites différentiels potentiels.
  3. Identifier les métabolites perturbés et les voies métaboliques par des sources de bases de données ouvertes, y compris Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) et MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualisez les vues des résultats par MetaboAnalyst5.0 et la plateforme 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Amarrage moléculaire

  1. Téléchargez la structure 3D des ingrédients PF sélectionnés à partir de la base de données TCMSP, respectivement. Recherchez les noms des ingrédients dans le champ de recherche « Nom chimique » et téléchargez les fichiers de structure 3D correspondants au format mol2.
  2. Téléchargez les structures cristallines des cibles clés à partir de la base de données AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Recherchez les noms des cibles dans la zone de recherche et téléchargez les fichiers de structures cristallines correspondants au format pdb.
  3. Importez le fichier des ingrédients et des structures cibles dans le logiciel AutoDockTools. Cliquez sur Modifier > Supprimer l’eau pour supprimer les molécules d’eau. Cliquez sur Modifier > Hydrogènes > Ajouter pour ajouter des hydrogène. Définissez les ingrédients comme « ligand » et effectuez un amarrage aveugle en sélectionnant les cibles entières comme « récepteur »17.
  4. Entrez une valeur dans la case derrière « centre » et « taille » pour ajuster l’espace nouvellement développé, ce qui permet d’englober complètement le ligand et le récepteur. Enregistrez les fichiers de ligand et de récepteur au format pdbqt.
  5. Utilisez AutoDock Vina pour effectuer un amarrage moléculaire. Définissez la barre « Receptor » sur le nom du 'receptor.pdbqt', et la barre « Ligand » sur le nom du 'ligand.pdbqt'. Obtenir l’emplacement optimal pour la liaison du ligand au récepteur. Enregistrez la valeur de l’énergie de liaison à la position optimale.
    REMARQUE: Le processus d’amarrage a été calculé par l’algorithme génétique14. Toutes les options d’exécution de l’ancrage étaient des valeurs par défaut. Les cadres d’amarrage seront automatiquement classés de l’énergie de liaison la plus élevée à la plus faible.
  6. Importez les fichiers d’ancrage dans PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) pour obtenir le modèle visuel du système. Téléchargez les fichiers de modèle au format pse et importez-les dans le logiciel PyMOL (voir le tableau des matériaux) pour construire une visualisation plus poussée.

5. Analyse statistique

REMARQUE : Utilisez le logiciel statistique SPSS (voir le tableau des matières) pour l’analyse des données. Considérez la valeur de p < 0,05 comme statistiquement significative.

  1. Exprimer les valeurs sous forme de moyennes ±écart type (ET).
  2. Effectuer une ANOVA unidirectionnelle suivie de la différence la moins significative (LSD) post-hoc, de Dunnett (en cas de variance égale) ou de la T3 de Dunnett (en cas de variance inégale) pour tester la signification statistique entre les groupes.

Résultats

Pharmacologie de réseau
Au total, 18 ingrédients potentiels dans la PF ont été examinés en fonction de leurs propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques à partir de la base de données et de l’analyse LC-MS (les chromatogrammes ioniques totaux sont présentés dans la figure supplémentaire 1). Grâce à la littérature pertinente, la teneur en acide gallique est beaucoup plus élevée que les autres ingrédients et est efficace pour abaisser...

Discussion

Au cours des dernières années, le taux d’incidence de l’hyperlipidémie a augmenté, principalement en raison d’habitudes alimentaires malsaines à long terme. La MTC et ses ingrédients chimiques ont diverses activités pharmacologiques, qui ont été largement étudiées ces dernières années37,38. La PF est une sorte de ressource fruitière, utilisée à la fois comme médicament et comme aliment, et a un potentiel important pour traiter l’hyperlipi...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par l’équipe de développement de produits et d’innovation de TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) et Research on New Business Cross-border Integration of « Health Preservation and Rehabilitation + ».

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

Références

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