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Resumo

O presente protocolo descreve uma estratégia integrada para explorar os principais alvos e mecanismos de Fructus Phyllanthi contra hiperlipidemia baseada na predição de farmacologia de rede e verificação metabolômica.

Resumo

A hiperlipidemia tornou-se um dos principais fatores de risco para doenças cardiovasculares e lesões hepáticas em todo o mundo. Fructus Phyllanthi (FP) é uma droga eficaz contra a hiperlipidemia nas teorias da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) e da Medicina Indiana, porém o mecanismo potencial requer maior exploração. A presente pesquisa tem como objetivo revelar o mecanismo do PF contra hiperlipidemia a partir de uma estratégia integrada combinando predição farmacológica de rede com validação metabolômica. Um modelo de camundongos induzidos por dieta hiperlipídica (DHL) foi estabelecido avaliando os níveis de lipídios plasmáticos, incluindo colesterol total (CT), triglicérides (TG), colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C) e colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C). A farmacologia de rede foi aplicada para descobrir os princípios ativos do PF e potenciais alvos contra a hiperlipidemia. Metabolômica do plasma e fígado foi realizada para identificar metabólitos diferenciais e suas vias correspondentes entre o grupo normal, grupo modelo e grupo intervenção. A relação entre farmacologia de rede e metabolômica foi construída para obter uma visão abrangente do processo de PF contra hiperlipidemia. As proteínas-alvo obtidas foram verificadas por acoplamento molecular. Esses resultados refletiram que o PF melhorou os níveis de lipídios plasmáticos e a lesão hepática da hiperlipidemia induzida por uma DH. Ácido gálico, quercetina e beta-sitosterol em FP foram demonstrados como os principais compostos ativos. Um total de 16 e seis potenciais metabólitos diferenciais no plasma e fígado, respectivamente, foram encontrados envolvidos nos efeitos terapêuticos do PF contra a hiperlipidemia por metabolômica. Além disso, a análise de integração indicou que os efeitos da intervenção estavam associados com CYP1A1, AChE e MGAM, bem como o ajuste de L-quinurenina, corticosterona, acetilcolina e rafinose, envolvendo principalmente a via do metabolismo do triptofano. O acoplamento molecular garantiu que os ingredientes acima atuando em alvos proteicos relacionados à hiperlipidemia desempenhassem um papel fundamental na redução de lipídios. Em síntese, esta pesquisa proporcionou uma nova possibilidade para a prevenção e tratamento da hiperlipidemia.

Introdução

A hiperlipidemia é uma doença metabólica comum e de sérios impactos na saúde humana, sendo também o principal fator de risco para doençascardiovasculares1. Recentemente, tem havido uma tendência de queda relacionada à idade para essa doença, e pessoas mais jovens tornaram-se mais suscetíveis devido a estilos de vida irregulares de longo prazo e hábitos alimentares não saudáveis2. Na clínica, vários medicamentos têm sido utilizados para tratar a hiperlipidemia. Por exemplo, uma das drogas mais comumente usadas para pacientes com hiperlipidemia e distúrbios ateroscleróticos relacionados são as estatinas. Entretanto, o uso prolongado de estatinas apresenta efeitos colaterais que não podem ser negligenciados, os quais levam a um prognóstico ruim, como intolerância, resistência ao tratamento e eventos adversos 3,4. Essas deficiências tornaram-se dores adicionais para pacientes com hiperlipidemia. Portanto, novos tratamentos para eficácia hipolipemiante estável e menos efeitos colaterais devem ser propostos.

A Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento de doenças devido à sua boa eficácia e poucos efeitos colaterais5. Fructus Phyllanthi (FP), fruto seco de Phyllanthus emblica Linn. (popularmente conhecida como amla berry ou groselha indiana), é um famoso medicamento e material homólogo alimentar dos medicamentos tradicionais chineses e indianos 6,7. Este medicamento tem sido utilizado para limpar o calor, resfriar o sangue e promover a digestão, de acordo com as teorias da MTC8. Estudos farmacológicos modernos têm demonstrado que o FP é rico em compostos bioativos como ácidos gálicos, ácidos elágicos e quercetina9, que são responsáveis por uma gama de propriedades biológicas multifacetadas, atuando como antioxidante, anti-inflamatório, proteção hepática, anti-hipolipidaemic, e assim por diante10. Pesquisas recentes também mostraram que o PF poderia efetivamente regular os lipídios sanguíneos de pacientes com hiperlipidemia. Por exemplo, Variya et al.11 demonstraram que o suco de fruta FP e seu principal ingrediente químico ácido gálico podem diminuir o colesterol plasmático e reduzir a infiltração de óleo no fígado e na aorta. A eficácia terapêutica foi relacionada à regulação do PF em aumentar a expressão do receptor alfa ativado por proliferadores de peroxissoma e diminuir a atividade lipogênica hepática. No entanto, o mecanismo subjacente do PF na melhora da hiperlipidemia deve ser mais investigado, pois seus ingredientes bioativos são bastante extensos. Procuramos explorar o mecanismo potencial da eficácia terapêutica do FP, que pode ser benéfico para o desenvolvimento e utilização deste medicamento.

Atualmente, a farmacologia de redes é considerada uma técnica holística e eficiente para estudar o mecanismo terapêutico da MTC. Em vez de procurar genes causadores de doenças únicas e drogas que tratam apenas um alvo individual, uma rede completa de fármacos-ingredientes-genes-doenças é construída para encontrar o mecanismo multi-alvo do medicamento multiingrediente em relação ao seu tratamento abrangente12. Esta técnica é especialmente adequada para MTC, pois suas composições químicas são maciças. Infelizmente, a farmacologia de rede só pode ser usada para prever alvos afetados por ingredientes químicos em teoria. Os metabólitos endógenos no modelo de doença devem ser observados para validar a eficácia da farmacologia da rede. O método metabolômico, que surge com o desenvolvimento da biologia de sistemas, é uma importante ferramenta para o monitoramento das alterações nos metabólitosendógenos13. As mudanças nos metabólitos refletem as mudanças no estado estacionário do hospedeiro, o que também é um indicador importante para o estudo do mecanismo interno. Alguns pesquisadores conseguiram integrar farmacologia e metabolômica de redes para explorar o mecanismo de interação entre drogas e doenças14,15.

Este artigo explora as bases mecanicistas do PF contra a hiperlipidemia integrando farmacologia de rede e técnicas metabolômicas. A farmacologia de rede foi aplicada para analisar a relação entre os principais princípios ativos do PF e alvos moleculares para hiperlipidemia. Posteriormente, foi realizada metabolômica para observar a alteração de metabólitos endógenos no modelo animal, o que pode explicar as ações da medicina em nível metabólico. Em comparação com a aplicação da farmacologia de rede ou metabonômica isoladamente, esta análise integrada forneceu um mecanismo de pesquisa mais específico e abrangente. Adicionalmente, a estratégia de acoplamento molecular foi utilizada para analisar a interação entre ingredientes ativos e proteínas-chave. Em geral, essa abordagem integrada poderia compensar a falta de evidências experimentais para farmacologia de rede e a falta de um mecanismo endógeno para o método metabolômico, e pode ser usada para a análise do mecanismo terapêutico da medicina natural. O fluxograma esquemático principal do protocolo é mostrado na Figura 1.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo o manuseio de animais foram conduzidos de acordo com o Guia de Medicina Tradicional Chinesa da Universidade de Chengdu para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Ética Institucional da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (Protocolo número 2020-36). Camundongos C57BL/6 machos (20 ± 2 g) foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Predição baseada em farmacologia de rede

NOTA: A farmacologia de rede é usada para prever os ingredientes ativos e seus principais alvos de FP contra hiperlipidemia.

  1. Seleção de ingredientes ativos e alvos-chave
    1. Pesquise a palavra-chave "Phyllanthi Fructus" no banco de dados de farmacologia do sistema de Medicina Tradicional Chinesa (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) para obter a lista dos ingredientes ativos candidatos e alvos do PF.
      NOTA: Normalmente, apenas ingredientes com biodisponibilidade oral (OB) ≥30% e valores semelhantes a medicamentos (DL) ≥0,18 na base de dados são incluídos como ingredientes ativos.
    2. Pesquise a palavra-chave "hyperlipidemia" na base de dados GeneCards (https://www.genecards.org/), na base de dados Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; https://omim.org/) e na base de dados de alvos terapêuticos (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) para obter os respectivos alvos candidatos de hiperlipidemia. Faça o download das planilhas de alvos da doença. Exclua os alvos repetidos para obter a lista de alvos de hiperlipidemia.
    3. Copie essas listas das etapas 1.1.1 e 1.1.2 para uma nova planilha. Use a função "Dados - Identificar duplicatas" na barra de ferramentas para obter destinos de interseção. Importe a lista de destino de interseção para UniProtKB (http://www.uniprot.org/) para padronizar os nomes de genes e proteínas.
      NOTA: Esses alvos estão relacionados tanto ao FP quanto à hiperlipidemia. Portanto, predizer esses alvos de intersecção como alvos de PF contra hiperlipidemia.
  2. Construção de uma rede de interação proteína-proteína
    1. Abra o banco de dados STRING (https://string-db.org/) 11.5. Cole a lista de destino de interseção de PF contra hiperlipidemia na caixa de diálogo "Lista de nomes". Selecione Homo sapiens em "Organismos" e clique no botão PESQUISAR > CONTINUAR.
      NOTA: Humanos e camundongos têm genes muito semelhantes. Portanto, novas verificações experimentais são realizadas com camundongos.
    2. Quando os resultados estiverem disponíveis, marque a opção ocultar nós desconectados na rede em "Configurações avançadas". Defina a maior confiança (0,900) em "pontuação mínima de interação necessária" e clique no botão ATUALIZAR .
    3. Clique em Exportações na barra de título e baixe o pequeno texto tabular da rede de interação proteína-proteína (PPI) nos formatos PNG e TSV.
  3. Construção de uma rede droga-componente-doença-alvo
    1. Abra o Cytoscape 3.9.1 (ver Tabela de Materiais). Importe o arquivo de formato TSV da etapa 1.2.3. Otimize a cor, a fonte e o lado dos nós de rede por meio da barra de estilos no painel de controle.
    2. Use a função "Analisar rede" para análise de topologia de rede. Obter genes hub pelo CytoHubba no Cytoscape. Estabelecer a rede medicamento-ingrediente-doença-alvo.
  4. Análise de enriquecimento GO e KEGG
    1. Abra os Recursos de Bioinformática DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Clique em Iniciar análise e cole a lista de destino na caixa de diálogo à esquerda. Selecione SÍMBOLO OFICIAL DO GENE em "Selecionar identificador". Selecione Homo sapiens em "Selecionar espécies". Lista de Genes de Carrapato em "Tipo de Lista". Clique em Enviar lista.
    2. Quando os resultados estiverem disponíveis, clique em Analisar acima da lista de genes com uma das ferramentas DAVID. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT em "Gene Ontology" para análise de enriquecimento da função GO. Tick KEGG_Pathway em "Pathways" para análise de enriquecimento da via KEGG.
    3. Clique em Gráfico de Anotação Funcional para exibir os resultados.
      NOTA: Defina o limiar de significância estatística da análise de enriquecimento em p < 0,05.

2. Delineamento experimental

  1. A preparação do extrato aquoso FP
    NOTA: FP é processado no laboratório da professora Lina Xia na Universidade de Chengdu de TCM8.
    1. Mergulhe o pó seco de FP (90 g) em 1 L de água pura num balão volumétrico limpo de 2 L. Use tratamento ultra-sônico (em banho-maria de 4 °C, potência: 250W, frequência: 35 kHz) para ajudar a dissolver por 30 min. Filtrar a solução para obter o extracto com uma gaze médica estéril de camada dupla, 1 mm x 1 mm. Repita a operação acima três vezes para garantir a dissolução completa do FP.
    2. Use o método de evaporação rotativa para maior concentração. Ajuste a velocidade de rotação para 50 rpm com uma temperatura de 60 °C durante 4 horas. Concentrar o extracto aquoso a 100 ml.
    3. Divida o extrato bruto de FP (0,9 g/mL) uniformemente em duas partes (50 mL). Uma parte é usada como líquido de alta dose de FP (0,9 g/mL). Adicionar 50 mL de água pura em outra parte e considerá-la como o líquido FP de baixa dose (0,45 g/mL). Use as soluções aquosas FP de alta e baixa dose para administração. Conservar o líquido a -20 °C até à utilização.
  2. Preparo animal
    1. Abrigar 50 camundongos C57BL/6 machos (20 ± 2 g) em uma sala bem ventilada à temperatura ambiente, com um ciclo claro-escuro de 12 h e livre acesso a alimentos e água pura.
    2. Atribua aleatoriamente os camundongos a dois grupos: alimente 10 camundongos com uma dieta normal e 40 camundongos com uma dieta rica em gordura (veja Tabela de Materiais) para induzir hiperlipidemia.
      NOTA: Após a alimentação por 8 semanas, os camundongos foram triados para posterior intervenção medicamentosa.
    3. Na 8ª semana, retirar cerca de 200 μL de sangue de cada órbita de camundongo. Centrifugar o sangue durante 10 min a 5,733 x g a 4 °C para obter amostras de plasma. Determine os níveis de CT e TG com kits de ensaio disponíveis comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
    4. Selecionar seis camundongos com os níveis lipídicos mais normais como o grupo controle sem tratamento (NC). Selecione 24 camundongos com um nível lipídico significativamente mais alto como o grupo de dieta rica em gordura e divida aleatoriamente em quatro grupos: grupo dieta rica em gordura (HFD), grupo FP (FP_L em baixas doses, grupo FP em altas doses (FP_H) e grupo controle positivo (PC).
    5. Administrar irrigação gástrica aos grupos FP_L e FP_H com duas doses de PF (dose baixa, 4,5 g/kg e dose alta, 9 g/kg), respectivamente; irrigação gástrica para o grupo PC com comprimidos de sinvastatina (5 mg/kg; ver Tabela de Materiais); e irrigação gástrica para os grupos CP e DHL com o mesmo volume de soro fisiológico uma vez ao dia durante 4 semanas.
      OBS: O presente estudo utilizou as soluções aquosas de FP e sinvastatina para o tratamento.
    6. Na 12ª semana, após anestesia com pentobarbital sódico a 1% (30 mg/kg), sacrificar os camundongos de todos os grupos. Coletar ~400 μL de amostras de sangue da veia orbital de cada camundongo.
      NOTA: Estimule os dedos dos pés e as solas dos ratos com uma pinça. Se não houver reação, a anestesia é adequada.
    7. Centrifugar o sangue por 10 min a 5.733 x g a 4 °C para obter amostras de plasma e determinar os níveis de CT, TG, LDL-C e HDL-C com kits de ensaio disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais). Obter amostras de tecido hepático16 e submetê-las à análise histopatológica. Utilizar as restantes amostras de plasma e fígado para análise metabolómica (passo 3).
      NOTA: Todas as amostras são armazenadas a -80 °C até à utilização.
  3. Exame histopatológico do fígado
    1. Fixar os tecidos hepáticos frescos com solução de paraformaldeído a 4% durante mais de 24 horas. Retire o tecido do fixador e alise os tecidos alvo com um bisturi. Coloque o tecido e a etiqueta correspondente no desidratador.
    2. Desidratar em um gradiente de etanol: álcool 75% por 4 h, álcool 85% por 2 h, álcool 90% por 2 h, álcool 95% por 1 h, etanol absoluto por 1 h, xileno por 30 min. Coloque o de tecido em um molde de tecido em cera de parafina por três lavagens, 30 min cada16.
    3. Coloque os tecidos embebidos em cera no embutidor de tecidos (ver Tabela de Materiais). Antes que a cera se solidifique, remova os tecidos do desidratador, coloque-os na caixa embutida e fixe a etiqueta correspondente.
    4. Resfriar os blocos de cera em uma mesa de congelamento de -20 °C, removê-los da estrutura embutida e aparar o bloco de cera.
    5. Corte os blocos de cera aparados em seções de 3 μm de espessura usando um micrótomo (ver Tabela de Materiais). Flutue as seções em água a 40 °C, retire-as das lâminas e leve ao forno a 60 °C. Depois de assar com água e cera seca, retire-o e mantenha-o em temperatura ambiente.
    6. Colocar sucessivamente os cortes em xileno I por 10 min, xileno II por 10 min, xileno III por 10 min, etanol absoluto I por 5 min, etanol absoluto II por 5 min, álcool 75% por 5 min e lavar em água16.
    7. Manchar os cortes com solução corante de hematoxilina por 4 min, solução de álcool de ácido clorídrico a 1% (álcool a 75%) para diferenciação, solução de água de amônia a 1% de volta azul, e lavá-los com água.
    8. Manchar os cortes com solução corante de eosina por 2 min e lavá-los com água.
    9. Observe os cortes em microscópio óptico com aumento de 200x e 400x.
  4. Análise por cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS)
    1. Identificação do ingrediente do PF
      NOTA: A análise é realizada usando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas híbrida quadrupolo-orbitrap de alta resolução (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; ver Tabela de Materiais).
      1. Meça com precisão 1 g de pó seco de FP e coloque-o num balão volumétrico limpo de 50 ml.
      2. Adicionar 25 ml de metanol a 70% no balão volumétrico e pesar com precisão. Use tratamento ultra-sônico (em banho-maria de 4 °C, potência: 250 W, frequência: 35 kHz) por 30 min para ajudar na dissolução. Pese novamente com precisão para determinar com precisão a perda após a dissolução e use metanol a 70% para compensar a perda.
        NOTA: Não meça o volume, pois a escala do frasco volumétrico não é precisa, especialmente após o banho-maria de 4 °C.
      3. Agite para misturar totalmente. Use uma membrana microporosa de 0,22 μm para filtrar.
    2. Preparação da amostra de plasma
      1. Adicionar precisamente 100 μL de plasma (passo 2.2.7) num volume duplo (200 μL) de acetonitrila num tubo de centrífuga de 1,5 ml e agitá-lo com um vibrador de vórtice durante, pelo menos, 30 s. Siga este procedimento para todas as amostras.
      2. Centrifugar todas as amostras a 17.200 x g durante 10 min a 4 °C. Transfira os sobrenadantes após a centrifugação para um novo tubo centrífugo de 1,5 mL. Secar os sobrenadantes sob nitrogênio. Reconstituir com 200 μL de solvente de extração (acetonitrila:água = 4:1 [v/v]).
      3. Vórtice a solução reconstituída durante, pelo menos, 30 s e utilizar tratamento ultra-sónico durante 10 minutos (em banho-maria a 4 °C, potência: 250 W, frequência: 35 kHz). Centrifugar a 17.200 x g por 10 min a 4 °C.
      4. Filtrar os sobrenadantes com membranas filtrantes de 0,22 μm e mantê-los a 4 °C para análise.
    3. Preparação da amostra de fígado
      1. Homogeneizar 90 mg de tecido hepático (passo 2.2.7) durante 1 min em água de metanol gelada (1:1, v/v, 1 ml) e centrifugar-os a 21.500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Transfira o sobrenadante para tubos de centrífuga de 1,5 mL. Siga este procedimento para todas as amostras.
      2. Extrair os precipitados novamente seguindo o mesmo procedimento e agrupar os sobrenadantes em novos tubos de centrífuga de 1,5 mL. Secar os sobrenadantes sob nitrogênio. Reconstituir com 300 μL do solvente de extracção (metanol:água = 4:1 [v/v]).
      3. Vórtice a solução reconstituída durante, pelo menos, 30 s e utilizar tratamento ultra-sónico durante 10 minutos (em banho-maria a 4 °C, potência: 250 W, frequência: 35 kHz). Centrifugar a 17.200 x g por 15 min a 4 °C.
      4. Filtrar os sobrenadantes com membranas filtrantes de 0,22 μm e mantê-los a 4 °C para análise.
        NOTA: As amostras de controle de qualidade agrupadas (CQ) foram preparadas misturando alíquotas de 10 μL de cada amostra de plasma e fígado (uma para cada seis amostras).
    4. Parâmetros de análise da LC-MS
      NOTA: A fase móvel é constituída por 0,1% de ácido fórmico (solvente A) e acetonitrila (solvente B). Transfira esses solventes para uma garrafa de vidro limpa e conecte-os ao sistema LC-MS.
      1. Definir os programas de gradiente das amostras de plasma no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), manter em 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min) e manter em 1% B até 27 min.
      2. Definir as condições do amostrador automático das amostras de plasma no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: o volume de injeção, 2 μL; e fluxo, 0,3 mL/min, para cada análise.
      3. Defina o programa de gradiente das amostras de fígado no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min), e mantenha em 1% B até 45 min.
      4. Defina as condições do amostrador automático das amostras de fígado no "arquivo de entrada" do sistema LC-MS da seguinte forma: volume de injeção, 5 μL; e fluxo, 0,3 mL/min, para cada análise.
      5. Defina as condições de detecção de MS das amostras de plasma e fígado no "arquivo de ajuste MS" do sistema LC-MS. Realizar a aquisição de MS utilizando os modos de ionização positivo e negativo.
        NOTA: Os parâmetros de ionização por eletrospray aquecido são os seguintes: tensão de pulverização: 3,5 kV para ionização positiva e 3,8 kV para ionização negativa; fluxo de gás da bainha: 55 arb; fluxo de gás auxiliar: 15 arb; temperatura do aquecedor de sonda: 300 °C; e temperatura capilar: 350 °C.
      6. Importe os dados brutos coletados para o software Compound Discoverer e defina o modelo de método seguindo as instruções do fabricante (consulte Tabela de materiais).

3. Validação metabolômica

NOTA: Os dados de perfil metabolômico de metabólitos de plasma e fígado são importados para o software Compound Discoverer para executar a extração de características metabólicas adotando um algoritmo de extração de características moleculares. Defina os parâmetros da seguinte forma: desvio de massa, 5 x 10-6; faixa de massa, 100-1.500; limiar da relação sinal/ruído (S/R), 3; e desvio no tempo de retenção, 0,05. Avaliar a estabilidade e repetibilidade da metabolômica pelo desvio padrão relativo (RSD) das áreas dos picos de QC.

  1. Utilizar o software SIMCA-P (ver Tabela de Materiais) para análise estatística multivariada dos valores integrais obtidos a partir dos achados do LC-MS. Utilizar a análise discriminante ortogonal de mínimos quadrados parciais (OPLS-DA) para os dados centrados na média e a modelagem das classes amostrais.
  2. Após o teste OPLS-DA, considere-se os metabólitos, com integral com importância variável na projeção (VIP) valores de >1 e p-valor de <0,05 do teste t de Student como potenciais metabólitos diferenciais.
  3. Identificar os metabólitos perturbados e vias metabólicas por fontes de banco de dados abertas, incluindo Metaboloma Humano (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG; https://www.kegg.jp/) e MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualize as visualizações dos resultados pelo MetaboAnalyst5.0 e pela plataforma 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Acoplamento molecular

  1. Faça o download da estrutura 3D dos ingredientes FP selecionados do banco de dados TCMSP, respectivamente. Pesquise os nomes dos ingredientes na caixa de pesquisa 'Nome químico' e baixe os arquivos de estrutura 3D correspondentes no formato mol2.
  2. Faça o download das estruturas cristalinas dos principais alvos do AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Pesquise os nomes de destino na caixa de pesquisa e baixe os arquivos de estruturas de cristal correspondentes no formato pdb.
  3. Importe ingredientes e arquivos de estruturas de destino para o software AutoDockTools. Clique em Editar > Excluir Água para excluir moléculas de água. Clique em Editar > Hidrogênios > Adicionar para adicionar hidrogênios. Defina os ingredientes como o 'ligante' e realize o acoplamento cego selecionando todos os alvos como o 'receptor'17.
  4. Digite um valor na caixa atrás de "centro" e "tamanho" para ajustar o espaço recém-desenvolvido, tornando possível abranger totalmente o ligante e o receptor. Salve os arquivos ligante e receptor no formato pdbqt.
  5. Use o AutoDock Vina para realizar o encaixe molecular. Defina a barra "Receptor" para o nome do 'receptor.pdbqt', e a barra "Ligand" para o nome do 'ligand.pdbqt'. Obter o local ideal para a ligação do ligante ao receptor. Registre o valor de energia de ligação na posição ideal.
    OBS: O processo de atracação foi calculado pelo Algoritmo Genético14. Todas as opções de execução de encaixe eram valores padrão. Os quadros de encaixe serão automaticamente classificados da energia de ligação mais alta para a mais baixa.
  6. Importe os arquivos de encaixe para o PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) para obter o modelo visual do sistema. Baixe os arquivos de modelo no formato pse e importe-os para o software PyMOL (consulte Tabela de Materiais) para construir uma visualização adicional.

5. Análise estatística

NOTA: Use o software estatístico SPSS (consulte a Tabela de Materiais) para análise de dados. Considere-se estatisticamente significante o valor de p < 0,05.

  1. Expresse os valores como média ± desvio padrão (DP).
  2. Realizar uma ANOVA one-way seguida de post hoc least significant difference (LSD), Dunnett (em caso de variância igual) ou T3 de Dunnett (em caso de variância desigual) para testar a significância estatística entre os grupos.

Resultados

Farmacologia de rede
Um total de 18 ingredientes potenciais em FP foram triados de acordo com suas propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas a partir do banco de dados e análise de LC-MS (os cromatogramas de íons totais são mostrados na Figura Suplementar 1). Através da literatura pertinente, o teor de ácido gálico é muito superior ao de outros ingredientes e é eficaz na redução de lipídios 9,11. Portanto, ...

Discussão

Nos últimos anos, a taxa de incidência de hiperlipidemia vem aumentando, principalmente devido a hábitos alimentares não saudáveis a longo prazo. A MTC e seus ingredientes químicos possuem diversas atividades farmacológicas, as quais têm sido amplamente estudadas nos últimos anos37,38. O PF é um tipo de recurso frutífero, utilizado tanto como medicamento quanto como alimento, e tem um importante potencial para o tratamento da hiperlipidemia. Entretanto...

Divulgações

Todos os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela Equipe de Desenvolvimento e Inovação de Produtos da TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) e Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

Referências

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