JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, Fructus Phyllanthi'nin hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini ve mekanizmalarını araştırmak için ağ farmakolojisi tahmini ve metabolomik doğrulamaya dayanan entegre bir stratejiyi tanımlamaktadır.

Özet

Hiperlipidemi tüm dünyada kardiyovasküler hastalıklar ve karaciğer hasarı için önde gelen bir risk faktörü haline gelmiştir. Fructus Phyllanthi (FP), Geleneksel Çin Tıbbı (TCM) ve Hint Tıbbı teorilerinde hiperlipidemiye karşı etkili bir ilaçtır, ancak potansiyel mekanizma daha fazla araştırma gerektirir. Bu araştırma, ağ farmakolojisi tahminini metabolomik validasyon ile birleştiren entegre bir stratejiye dayanarak FP'nin hiperlipidemiye karşı mekanizmasını ortaya koymayı amaçlamaktadır. Toplam kolesterol (TC), trigliserit (TG), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C) ve yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-K) dahil olmak üzere plazma lipid düzeyleri değerlendirilerek yüksek yağlı diyet (HFD) ile indüklenen fareler modeli oluşturulmuştur. FP'nin aktif bileşenlerini ve hiperlipidemiye karşı potansiyel hedefleri bulmak için ağ farmakolojisi uygulandı. Normal grup, model grubu ve müdahale grubu arasındaki diferansiyel metabolitleri ve bunlara karşılık gelen yolları tanımlamak için plazma ve karaciğer metabolomikleri yapıldı. Ağ farmakolojisi ve metabolomik arasındaki ilişki, FP'nin hiperlipidemiye karşı sürecinin kapsamlı bir görünümünü elde etmek için daha da inşa edilmiştir. Elde edilen anahtar hedef proteinler moleküler kenetlenme ile doğrulandı. Bu sonuçlar, FP'nin HFD tarafından indüklenen hiperlipideminin plazma lipid seviyelerini ve karaciğer hasarını iyileştirdiğini yansıtmıştır. FP'de gallik asit, quercetin ve beta-sitosterol, anahtar aktif bileşikler olarak gösterilmiştir. Plazma ve karaciğerde sırasıyla toplam 16 ve altı potansiyel diferansiyel metabolitin, FP'nin metabolomik tarafından hiperlipidemiye karşı terapötik etkilerinde rol oynadığı bulunmuştur. Ayrıca, entegrasyon analizi, müdahale etkilerinin CYP1A1, AChE ve MGAM ile ilişkili olduğunu ve ayrıca esas olarak triptofan metabolizması yolunu içeren L-kinürenin, kortikosteron, asetilkolin ve rafinozun ayarlandığını göstermiştir. Moleküler kenetlenme, hiperlipidemi ile ilişkili protein hedeflerine etki eden yukarıdaki bileşenlerin lipitlerin düşürülmesinde önemli bir rol oynamasını sağlamıştır. Özetle, bu araştırma hiperlipidemi önleme ve tedavi için yeni bir olasılık sağlamıştır.

Giriş

Hiperlipidemi, insan sağlığı üzerinde ciddi etkileri olan yaygın bir metabolik hastalıktır ve aynı zamanda kardiyovasküler hastalıklar için birincil risk faktörüdür1. Son zamanlarda, bu hastalık için yaşa bağlı olarak aşağı doğru bir eğilim olmuştur ve genç insanlar uzun süreli düzensiz yaşam tarzları ve sağlıksız beslenme alışkanlıkları nedeniyle daha duyarlı hale gelmiştir2. Klinikte, hiperlipidemi tedavisinde çeşitli ilaçlar kullanılmıştır. Örneğin, hiperlipidemi ve buna bağlı aterosklerotik bozuklukları olan hastalar için en sık kullanılan ilaçlardan biri statinlerdir. Bununla birlikte, statinlerin uzun süreli kullanımı, ihmal edilemeyecek yan etkilere sahiptir, bu da hoşgörüsüzlük, tedavi direnci ve advers olaylar gibi kötü bir prognoza yol açar 3,4. Bu eksiklikler hiperlipidemi hastaları için ek ağrılar haline gelmiştir. Bu nedenle, stabil lipid düşürücü etkinlik ve daha az yan etki için yeni tedaviler önerilmelidir.

Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), iyi etkinliği ve az sayıda yan etkisi nedeniyle hastalıkları tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır5. Fructus Phyllanthi (FP), Phyllanthus emblica Linn'in kurutulmuş meyvesi. (halk arasında amla berry veya Hint bektaşi üzümü olarak bilinir), geleneksel Çin ve Hindistan ilaçlarının 6,7 ünlü bir ilaç ve gıda homolog malzemesidir. Bu ilaç, TCM teorileri8'e göre, ısıyı temizlemek, kanı soğutmak ve sindirimi teşvik etmek için kullanılmıştır. Modern farmakolojik çalışmalar, FP'nin bir antioksidan, bir anti-enflamatuar, karaciğer koruması, bir anti-hipolipidemik vb. gibi bir dizi çok yönlü biyolojik özellikten sorumlu olan gallik asitler, ellagik asitler ve kuersetin9 gibi biyoaktif bileşikler bakımından zengin olduğunu göstermiştir10. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, FP'nin hiperlipidemili hastaların kan lipitlerini etkili bir şekilde düzenleyebileceğini göstermiştir. Örneğin, Variya ve ark.11, FP meyve suyunun ve gallik asidin ana kimyasal bileşeninin plazma kolesterolünü azaltabileceğini ve karaciğer ve aorttaki yağ infiltrasyonunu azaltabileceğini göstermiştir. Terapötik etkinlik, peroksizom proliferatör-aktive reseptör-alfa ekspresyonunu arttırmada ve hepatik lipojenik aktiviteyi azaltmada FP'nin regülasyonu ile ilişkiliydi. Bununla birlikte, FP'nin hiperlipidemi iyileştirmede altta yatan mekanizması daha fazla araştırılmalıdır, çünkü biyoaktif bileşenleri oldukça geniştir. FP'nin terapötik etkinliğinin potansiyel mekanizmasını keşfetmeye çalıştık, bu da bu ilacın daha da geliştirilmesi ve kullanılması için yararlı olabilir.

Şu anda, ağ farmakolojisi, TCM'nin terapötik mekanizmasını incelemek için bütünsel ve etkili bir teknik olarak kabul edilmektedir. Tek bir hastalığa neden olan genleri ve yalnızca bireysel bir hedefi tedavi eden ilaçları aramak yerine, çok bileşenli ilacın kapsamlı tedavisi ile ilgili çok hedefli mekanizmasını bulmak için eksiksiz bir ilaç-bileşen-gen-hastalıklar ağı inşa edilmiştir12. Bu teknik, kimyasal bileşimleri büyük olduğu için TCM için özellikle uygundur. Ne yazık ki, ağ farmakolojisi yalnızca teorideki kimyasal bileşenlerden etkilenen hedefleri tahmin etmek için kullanılabilir. Ağ farmakolojisinin etkinliğini doğrulamak için hastalık modelindeki endojen metabolitler gözlenmelidir. Sistem biyolojisinin gelişmesiyle ortaya çıkan metabolomik yöntem, endojen metabolitlerdeki değişiklikleri izlemek için önemli bir araçtır13. Metabolitlerdeki değişiklikler, konağın kararlı durum değişikliklerini yansıtır ve bu da iç mekanizmayı incelemek için önemli bir göstergedir. Bazı araştırmacılar, ilaçlar ve hastalıklar arasındaki etkileşim mekanizmasını keşfetmek için ağ farmakolojisi ve metabolomiklerini başarıyla entegre etmişlerdir14,15.

Bu makalede, ağ farmakolojisi ve metabolomik tekniklerini entegre ederek FP'nin hiperlipidemiye karşı mekanik temeli araştırılmaktadır. Ağ farmakolojisi, FP'deki ana aktif bileşenler ile hiperlipidemi için moleküler hedefler arasındaki ilişkiyi analiz etmek için uygulandı. Daha sonra, metabolik düzeyde ilaç eylemlerini açıklayabilen hayvan modelindeki endojen metabolitlerin değişimini gözlemlemek için metabolomik yapıldı. Tek başına ağ farmakolojisi veya metabonomik uygulamasıyla karşılaştırıldığında, bu entegre analiz daha spesifik ve kapsamlı bir araştırma mekanizması sağlamıştır. Ek olarak, moleküler yerleştirme stratejisi, aktif bileşenler ve anahtar proteinler arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılmıştır. Genel olarak, bu entegre yaklaşım, ağ farmakolojisi için deneysel kanıt eksikliğini ve metabolomik yöntem için endojen bir mekanizmanın eksikliğini telafi edebilir ve doğal tıbbın terapötik mekanizma analizi için kullanılabilir. Protokolün ana şematik akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

Protokol

Hayvanların ele alınmasını içeren tüm prosedürler, Chengdu Üniversitesi Geleneksel Çin Tıbbı Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülmüş ve Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası 2020-36). Bu çalışmada erkek C57BL/6 fareler (20 ± 2 g) kullanılmıştır. Fareler ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

1. Ağ farmakolojisine dayalı tahmin

NOT: Ağ farmakolojisi, FP'nin aktif bileşenlerini ve bunların hiperlipidemiye karşı temel hedeflerini tahmin etmek için kullanılır.

  1. Aktif bileşenlerin seçimi ve temel hedefler
    1. FP'nin aday aktif bileşenlerinin ve hedeflerinin listesini elde etmek için Geleneksel Çin Tıbbı sisteminin farmakoloji veritabanında (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) "Phyllanthi Fructus" anahtar kelimesini arayın.
      NOT: Normalde, veritabanında yalnızca oral biyoyararlanım (OB) %≥30 ve ilaç benzeri (DL) değerleri ≥0,18 olan bileşenler aktif bileşenler olarak dahil edilir.
    2. İlgili hiperlipidemi aday hedeflerini elde etmek için GeneCards veritabanında (https://www.genecards.org/), Online Mendel Inheritance in Man veritabanında (OMIM; https://omim.org/) ve terapötik hedef veritabanında (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) "hiperlipidemi" anahtar kelimesini arayın. Hastalık hedeflerinin e-tablolarını indirin. Hiperlipidemi hedefleri listesini elde etmek için yinelenen hedefleri silin.
    3. Bu listeleri 1.1.1 ve 1.1.2 adımlarında yer alan yeni bir e-tabloya kopyalayın. Kesişim hedeflerini almak için araç çubuğundaki "Veri - Yinelenenleri Tanımla" işlevini kullanın. Gen ve protein adlarını standartlaştırmak için kesişim hedef listesini UniProtKB'ye (http://www.uniprot.org/) aktarın.
      NOT: Bu hedefler hem FP hem de hiperlipidemi ile ilişkilidir. Bu nedenle, bu kesişim hedeflerini hiperlipidemiye karşı FP'nin hedefleri olarak tahmin edin.
  2. Protein-protein etkileşim ağının oluşturulması
    1. STRING veritabanı (https://string-db.org/) 11.5'i açın. FP'nin hiperlipidemiye karşı kesişim hedefi listesini "İsim Listesi" iletişim kutusuna yapıştırın. "Organizmalar" bölümünde Homo sapiens'i seçin ve ARA > DEVAM ET'e tıklayın.
      NOT: İnsanlar ve fareler oldukça benzer genlere sahiptir. Bu nedenle, farelerle daha fazla deneysel doğrulama yapılır.
    2. Sonuçlar mevcut olduğunda, "Gelişmiş Ayarlar" da ağdaki bağlantısı kesilmiş düğümleri gizle seçeneğini işaretleyin. "Minimum gerekli etkileşim puanı"nda en yüksek güveni (0,900) ayarlayın ve ardından GÜNCELLE düğmesini tıklayın.
    3. Başlık çubuğundaki Dışa Aktarımlar'a tıklayın ve protein-protein etkileşimi (PPI) ağının kısa tablo metnini PNG ve TSV formatında indirin.
  3. İlaç-bileşen-hastalık-hedef ağının oluşturulması
    1. Cytoscape 3.9.1'i açın (bkz. Adım 1.2.3'ün TSV biçimindeki dosyasını alın. Kontrol panelindeki stil çubuğu aracılığıyla ağ düğümlerinin rengini, yazı tipini ve yan tarafını optimize edin.
    2. Ağ topolojisi analizi için "Ağı Analiz Et" işlevini kullanın. Cytoscape'te CytoHubba ile hub genleri elde edin. İlaç-bileşen-hedef-hastalık ağını kurmak.
  4. GO ve KEGG zenginleştirme analizi
    1. DAVID Bioinformatics Resources'ı (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp) açın. Analizi Başlat'a tıklayın ve hedef listeyi soldaki iletişim kutusuna yapıştırın. "Select Identifier" (Tanımlayıcı Seç) bölümünde OFFICIAL GENE SYMBOL (RESMİ GEN SİMGESİ) öğesini seçin. "Tür seç" bölümünde Homo sapiens'i seçin. "Liste türü" ndeki gen listesini işaretleyin. Listeyi Gönder'e tıklayın.
    2. Sonuçlar mevcut olduğunda, yukarıdaki gen listesini DAVID araçlarından biriyle analiz et'e tıklayın. GO fonksiyon zenginleştirme analizi için GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT "Gen Ontolojisi" nde işaretleyin. KEGG yol zenginleştirme analizi için "Pathways" (Yollar) bölümündeki KEGG_Pathway işaretleyin.
    3. Sonuçları görüntülemek için İşlevsel Ek Açıklama Grafiği'ne tıklayın.
      NOT: Zenginleştirme analizinin istatistiksel anlamlılık eşiğini p < 0,05 olarak ayarlayın.

2. Deneysel tasarım

  1. FP sulu ekstrakt preparatı
    NOT: FP, TCM8 Chengdu Üniversitesi'nde Profesör Lina Xia'nın laboratuvarında işlenir.
    1. Kurutulmuş FP tozunu (90 g) 1 L saf suya temiz bir 2 L hacimsel şişede bekletin. 30 dakika boyunca çözünmeye yardımcı olmak için ultrasonik tedavi kullanın (4 ° C su banyosunda, güç: 250W, frekans: 35 kHz). Ekstraktı çift katmanlı, 1 mm x 1 mm steril tıbbi gazlı bezle elde etmek için çözeltiyi filtreleyin. FP'nin tamamen çözünmesini sağlamak için yukarıdaki işlemi üç kez tekrarlayın.
    2. Daha fazla konsantrasyon için döner evaporasyon yöntemini kullanın. Dönüş hızını 4 saat boyunca 60 °C sıcaklıkta 50 rpm'ye ayarlayın. Sulu ekstraktı 100 mL'ye konsantre edin.
    3. FP'nin ham ekstraktını (0,9 g/mL) eşit olarak iki parçaya (50 mL) bölün. Bir kısmı yüksek doz FP sıvısı (0.9 g / mL) olarak kullanılır. Başka bir parçaya 50 mL saf su ekleyin ve düşük doz FP sıvısı (0.45 g / mL) olarak düşünün. Uygulama için yüksek ve düşük doz FP sulu çözeltileri kullanın. Sıvıyı -20 °C'de kullanıma kadar saklayın.
  2. Hayvan hazırlama
    1. 50 erkek C57BL / 6 fareyi (20 ± 2 g) oda sıcaklığında iyi havalandırılan bir odada, 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü ve yiyecek ve saf suya serbest erişim ile barındırın.
    2. Fareleri rastgele iki gruba atayın: hiperlipidemi indüklemek için normal bir diyetle 10 fareyi ve yüksek yağlı bir diyetle 40 fareyi besleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: 8 hafta boyunca beslendikten sonra, fareler daha fazla ilaç müdahalesi için tarandı.
    3. 8. haftada, her fare yörüngesinden yaklaşık 200 μL kan çekin. Plazma örnekleri almak için kanı 4 ° C'de 5.733 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. TC ve TG seviyelerini ticari olarak temin edilebilen tahlil kitleri ile belirleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
    4. Tedavi edilmeyen kontrol (NC) grubu olarak en normal lipit seviyelerine sahip altı fare seçin. Yüksek yağlı diyet grubu olarak önemli ölçüde daha yüksek lipit seviyesine sahip 24 fare seçin ve bunları rastgele dört gruba ayırın: yüksek yağlı diyet (HFD) grubu, düşük doz FP (FP_L) grubu, yüksek doz FP (FP_H) grubu ve pozitif kontrol (PC) grubu.
    5. FP_L ve FP_H gruplarına sırasıyla iki doz FP (düşük doz, 4.5 g / kg ve yüksek doz, 9 g / kg) ile gastrik irrigasyon uygulayın; simvastatin tabletleri ile PC grubuna gastrik irrigasyon (5 mg / kg; bakınız Malzeme Tablosu); ve NC ve HFD gruplarına 4 hafta boyunca günde bir kez aynı miktarda fizyolojik salin ile gastrik irrigasyon.
      NOT: Mevcut çalışmada tedavi için FP ve simvastatinin sulu çözeltileri kullanılmıştır.
    6. 12. haftada,% 1 pentobarbital sodyum (30 mg / kg) ile anesteziden sonra, tüm grupların farelerini kurban edin. Her farenin orbital damarından ~ 400 μL kan örnekleri toplayın.
      NOT: Farelerin ayak parmaklarını ve tabanlarını cımbızla uyarın. Reaksiyon yoksa, yeterli anesteziyi kanıtlar.
    7. Plazma örnekleri elde etmek için kanı 4 ° C'de 5.733 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve ticari olarak temin edilebilen tahlil kitleriyle TC, TG, LDL-C ve HDL-C seviyelerini belirleyin (bkz. Karaciğer dokusu örnekleri16 alın ve histopatolojik analize tabi tutun. Metabolomik analiz için kalan plazma ve karaciğer örneklerini kullanın (adım 3).
      NOT: Tüm numuneler kullanıma kadar -80 °C'de saklanır.
  3. Karaciğer histopatolojik incelemesi
    1. Taze karaciğer dokularını 24 saatten fazla bir süredir% 4 paraformaldehit çözeltisi ile sabitleyin. Dokuyu fiksatiften çıkarın ve hedef dokuları bir neşterle pürüzsüzleştirin. Dokuyu ve ilgili etiketi kurutucuya yerleştirin.
    2. Bir etanol gradyanında dehidrat: 4 saat boyunca% 75 alkol, 2 saat boyunca% 85 alkol, 2 saat boyunca% 90 alkol, 1 saat boyunca% 95 alkol, 1 saat boyunca mutlak etanol, 30 dakika boyunca ksilen. Doku kasetini parafin balmumu içinde bir doku kalıbına üç yıkama için yerleştirin, her biri 30 dakika16.
    3. Balmumu ile ıslatılmış dokuları doku gömücüye koyun (bkz. Balmumu katılaşmadan önce, dokuları kurutucudan çıkarın, gömülü kutuya koyun ve ilgili etiketi takın.
    4. Balmumu bloklarını -20 °C dondurma masasında soğutun, gömülü çerçeveden çıkarın ve balmumu bloğunu kırpın.
    5. Kesilmiş balmumu bloklarını bir mikrotom kullanarak 3 μm kalınlığında kesitler halinde kesin (bkz. Bölümleri 40 °C suda yüzdürün, slaytlardan çıkarın ve 60 °C fırında pişirin. Su ve kuru balmumu ile pişirdikten sonra, çıkarın ve oda sıcaklığında saklayın.
    6. Bölümleri art arda 10 dakika boyunca ksilen I'e, 10 dakika boyunca ksilen II'ye, 10 dakika boyunca ksilen III'e, 5 dakika boyunca mutlak etanol I'e, 5 dakika boyunca mutlak etanol II'ye, 5 dakika boyunca% 75 alkole yerleştirin ve suda yıkayın16.
    7. Bölümleri 4 dakika boyunca hematoksilin boyama çözeltisi, farklılaşma için% 1 hidroklorik asit alkol çözeltisi (% 75 alkol), % 1 amonyak su çözeltisi ile maviye boyayın ve suyla yıkayın.
    8. Bölümleri 2 dakika boyunca eozin boyama çözeltisi ile lekeleyin ve suyla yıkayın.
    9. Bölümleri 200x ve 400x büyütmeli optik bir mikroskop kullanarak gözlemleyin.
  4. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi )LC-MS) analizi
    1. FP'nin içerik tanımlaması
      NOT: Analiz, hibrid kuadrupol-orbitrap yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; bakınız Malzeme Tablosu) ile birleştirilmiş ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilir.
      1. 1 g kurutulmuş FP tozunu hassas bir şekilde ölçün ve temiz bir 50 mL hacimsel şişeye koyun.
      2. Volumetrik şişeye 25 mL% 70 metanol ekleyin ve doğru şekilde tartın. Çözünmeye yardımcı olmak için 30 dakika boyunca ultrasonik tedavi (4 ° C su banyosunda, güç: 250 W, frekans: 35 kHz) kullanın. Çözünmeden sonraki kaybı kesin olarak belirlemek için tekrar doğru bir şekilde tartın ve kaybı telafi etmek için% 70 metanol kullanın.
        NOT: Hacimsel şişenin ölçeği, özellikle 4 °C su banyosundan sonra doğru olmadığından, hacmi ölçmeyin.
      3. Tamamen karıştırmak için çalkalayın. Filtrelemek için 0,22 μm mikro gözenekli bir membran kullanın.
    2. Plazma numunesi hazırlama
      1. 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde çift hacimli (200 μL) asetonitril içine 100 μL plazmayı (adım 2.2.7) hassas bir şekilde ekleyin ve en az 30 s boyunca bir vorteks vibratörü ile vorteks edin. Tüm örnekler için bu yordamı izleyin.
      2. Tüm numuneleri 17.200 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra süpernatantları yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Süpernatantları azot altında kurutun. 200 μL ekstraksiyon çözücüsü ile yeniden oluşturun (asetonitril:su = 4:1 [v/v]).
      3. Vorteks en az 30 s için yeniden yapılandırılmış çözelti ve 10 dakika boyunca ultrasonik tedavi kullanın (4 ° C su banyosunda, güç: 250 W, frekans: 35 kHz). 4 °C'de 10 dakika boyunca 17.200 x g'de santrifüj.
      4. Süpernatantları 0,22 μm filtre membranları ile filtreleyin ve analiz için 4 °C'de tutun.
    3. Karaciğer örneği hazırlama
      1. 90 mg karaciğer dokusunu (adım 2.2.7) buz gibi soğuk metanol suyunda (1:1, v/v, 1 mL) 1 dakika homojenize edin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 21.500 x g'de santrifüj edin. Süpernatantı 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. Tüm örnekler için bu yordamı izleyin.
      2. Aynı prosedürü izleyerek çökeltileri tekrar çıkarın ve süpernatantları yeni 1,5 mL santrifüj tüplerinde bir araya getirin. Süpernatantları azot altında kurutun. 300 μL ekstraksiyon çözücüsü ile yeniden oluşturun (metanol:su = 4:1 [v/v]).
      3. Vorteks en az 30 s için yeniden yapılandırılmış çözelti ve 10 dakika boyunca ultrasonik tedavi kullanın (4 ° C su banyosunda, güç: 250 W, frekans: 35 kHz). 4 °C'de 15 dakika boyunca 17.200 x g'de santrifüj.
      4. Süpernatantları 0,22 μm filtre membranları ile filtreleyin ve analiz için 4 °C'de tutun.
        NOT: Havuza alınmış kalite kontrol (QC) numuneleri, her plazma ve karaciğer numunesinden (altı numuneden biri) 10 μL alikot karıştırılarak hazırlanmıştır.
    4. LC-MS analiz parametreleri
      NOT: Mobil faz %0.1 formik asit (çözücü A) ve asetonitrilden (çözücü B) oluşur. Bu çözücüleri temiz bir cam şişeye aktarın ve LC-MS sistemine bağlayın.
      1. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" plazma örneklerinin gradyan programlarını şu şekilde ayarlayın: %1 B (0-1,5 dk), %1-%60 B (1,5-13,0 dk), %60-%99 B (13,0-20,0 dk), %99 B (20,0-25,0 dk), %99-%1 B (25,0-25,1 dk) ve %1 B'de 27 dk'ya kadar muhafaza edin.
      2. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" plazma numunelerinin otomatik numune alma cihazı koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: enjeksiyon hacmi, 2 μL; ve her analiz için akış hızı, 0,3 mL/dak.
      3. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" karaciğer örneklerinin gradyan programını şu şekilde ayarlayın: %1 B (0-1 dk), %1-%53 B (1-15 dk), %53-%70 B (15-30 dk), %70-%90 B (30-32 dk), %90-%95 B (32-40 dk), %95-%1 B (40-42 dk) ve 45 dakikaya kadar %1 B'de tutun.
      4. LC-MS sisteminin "giriş dosyasında" karaciğer örneklerinin otomatik örnekleyici koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: enjeksiyon hacmi, 5 μL; ve her analiz için akış hızı, 0,3 mL/dak.
      5. LC-MS sisteminin "MS tune dosyasında" hem plazma hem de karaciğer örneklerinin MS algılama koşullarını ayarlayın. MS edinimini hem pozitif hem de negatif iyonizasyon modlarını kullanarak gerçekleştirin.
        NOT: Isıtılmış elektrosprey iyonizasyon parametreleri aşağıdaki gibidir: püskürtme gerilimi: pozitif iyonizasyon için 3,5 kV ve negatif iyonizasyon için 3,8 kV; kılıf gazı akışı: 55 arb; yardımcı gaz akışı: 15 arb; prob ısıtıcı sıcaklığı: 300 °C; ve kılcal sıcaklık: 350 °C.
      6. Toplanan ham verileri Compound Discoverer yazılımına aktarın ve üreticinin talimatlarını izleyerek yöntem şablonunu ayarlayın (bkz.

3. Metabolomik doğrulama

NOT: Plazma ve karaciğer metabolitlerinin metabolomik profilleme verileri, moleküler özellik ekstraksiyon algoritması benimseyerek metabolik özellik ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için Compound Discoverer yazılımına aktarılır. Parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: kütle sapması, 5 x 10-6; kütle aralığı, 100-1.500; sinyal-gürültü oranı (SNR) eşiği, 3; ve tutma süresi sapması, 0,05. Metabolomiklerin stabilitesini ve tekrarlanabilirliğini, QC tepe alanlarının göreceli standart sapması (RSD) ile değerlendirin.

  1. LC-MS bulgularından elde edilen integral değerlerin çok değişkenli istatistiksel analizi için SIMCA-P yazılımını kullanın (bkz. Ortalama merkezli veriler ve örnek sınıfların modellenmesi için ortogonal kısmi en küçük kareler diskriminant analizini (OPLS-DA) kullanın.
  2. OPLS-DA testinden sonra, potansiyel diferansiyel metabolitler olarak >1'lik projeksiyon (VIP) değerlerinde değişken öneme sahip integral ve Student'ın t-testinden <0.05'lik bir p-değeri olan metabolitleri göz önünde bulundurun.
  3. İnsan Metabolomu (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG; https://www.kegg.jp/) ve MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/) dahil olmak üzere açık veritabanı kaynakları ile bozulmuş metabolitleri ve metabolik yolları tanımlayın.
  4. MetaboAnalyst5.0 ve 'Wu Kong' platformu (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/) tarafından sonuç görünümlerini görselleştirin.

4. Moleküler yerleştirme

  1. Seçilen FP bileşenlerinin 3B yapısını sırasıyla TCMSP veritabanından indirin. 'Kimyasal adı' arama kutusundaki bileşen adlarını arayın ve ilgili 3D yapı dosyalarını mol2 formatında indirin.
  2. Anahtar hedeflerin kristal yapılarını AlphaFold Protein Yapısı Veritabanı'ndan indirin (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Arama kutusundaki hedef adlarını arayın ve ilgili kristal yapı dosyalarını pdb formatında indirin.
  3. İçeriği ve hedef yapıları AutoDockTools yazılımına aktarın. Su moleküllerini silmek için Düzenle > Suyu Sil'e tıklayın. Hidrojen eklemek > Hidrojen > Düzenle'ye tıklayın. Malzemeleri 'ligand' olarak ayarlayın ve tüm hedefleri 'reseptör' olarak seçerek kör kenetlenme gerçekleştirin17.
  4. Yeni geliştirilen alanı ayarlamak için "merkez" ve "boyut" un arkasındaki kutuya bir değer girin, böylece ligand ve reseptörü tamamen kuşatmayı mümkün kılar. Ligand ve reseptör dosyalarını pdbqt formatında kaydedin.
  5. Moleküler yerleştirme gerçekleştirmek için AutoDock Vina'yı kullanın. "Reseptör" çubuğunu 'receptor.pdbqt' adına ve 'Ligand' çubuğunu 'ligand.pdbqt' adına ayarlayın. Reseptöre ligand bağlanması için en uygun yeri elde edin. Bağlama enerjisi değerini optimum konumda kaydedin.
    NOT: Yerleştirme işlemi Genetik Algoritma14 tarafından hesaplanmıştır. Tüm yerleştirme çalıştırma seçenekleri varsayılan değerlerdi. Yerleştirme çerçeveleri otomatik olarak en yüksekten en düşük bağlanma enerjisine doğru sıralanacaktır.
  6. Görsel sistem modelini elde etmek için yerleştirme dosyalarını PILP'ye (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) aktarın. Model dosyalarını pse formatında indirin ve daha fazla görselleştirme oluşturmak için bunları PyMOL yazılımına aktarın (bkz.

5. İstatistiksel analiz

NOT: Veri analizi için SPSS istatistik yazılımını kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). p < 0,05 değerini istatistiksel olarak anlamlı olarak düşünün.

  1. Değerleri standart sapma (SD) ± araç olarak ifade edin.
  2. Gruplar arasında istatistiksel anlamlılığı test etmek için tek yönlü bir ANOVA ve ardından post hoc en az anlamlı fark (LSD), Dunnett (eşit varyans durumunda) veya Dunnett'in T3'ünü (eşit olmayan varyans durumunda) gerçekleştirin.

Sonuçlar

Ağ farmakolojisi
FP'deki toplam 18 potansiyel bileşen, veritabanından ve LC-MS analizinden farmakokinetik ve farmakodinamik özelliklerine göre taranmıştır (toplam iyon kromatogramları Ek Şekil 1'de gösterilmiştir). İlgili literatür sayesinde, gallik asit içeriği diğer bileşenlerden çok daha yüksektir ve lipitlerin düşürülmesinde etkilidir 9,11. Bu nedenle, bu bileşen de potansiyel bir bileşen olarak k...

Tartışmalar

Son yıllarda, hiperlipidemi insidansı oranı, esas olarak uzun süreli sağlıksız beslenme alışkanlıkları nedeniyle artmaktadır. TCM ve kimyasal bileşenleri, son yıllarda yaygın olarak çalışılan çeşitli farmakolojik aktivitelere sahiptir37,38. FP, hem ilaç hem de gıda olarak kullanılan bir tür meyve kaynağıdır ve hiperlipidemi tedavisinde önemli bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, FP'nin hiperlipidemiye karşı potansiyel terapö...

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, TCM Sağlık Koruma ve Rehabilitasyon Ürün Geliştirme ve İnovasyon Ekibi (2022C005) ve "Sağlığın Korunması ve Rehabilitasyonu +" nın Yeni İş Sınır Ötesi Entegrasyonu Araştırması tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

Referanslar

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360 (2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628 (2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122 (2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791 (2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848 (2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587 (2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920 (2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665 (2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839 (2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871 (2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318 (2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273 (2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504 (2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238 (2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518 (2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579 (2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287 (2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278 (2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572 (2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713 (2022).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geri ekmeSay 194

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır