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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una strategia integrata per esplorare i bersagli e i meccanismi chiave di Fructus Phyllanthi contro l'iperlipidemia basata sulla previsione della farmacologia di rete e sulla verifica metabolomica.

Abstract

L'iperlipidemia è diventata un fattore di rischio leader per le malattie cardiovascolari e le lesioni epatiche in tutto il mondo. Fructus Phyllanthi (FP) è un farmaco efficace contro l'iperlipidemia nelle teorie della medicina tradizionale cinese (MTC) e della medicina indiana, tuttavia il potenziale meccanismo richiede ulteriori esplorazioni. La presente ricerca si propone di rivelare il meccanismo della FP contro l'iperlipidemia sulla base di una strategia integrata che combina la previsione della farmacologia di rete con la validazione metabolomica. Un modello di topi indotti da una dieta ricca di grassi (HFD) è stato stabilito valutando i livelli plasmatici di lipidi, tra cui colesterolo totale (TC), trigliceridi (TG), colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-C) e colesterolo lipoproteico ad alta densità (HDL-C). La farmacologia di rete è stata applicata per scoprire i principi attivi della FP e i potenziali bersagli contro l'iperlipidemia. La metabolomica del plasma e del fegato è stata eseguita per identificare i metaboliti differenziali e i loro percorsi corrispondenti tra il gruppo normale, il gruppo modello e il gruppo di intervento. La relazione tra farmacologia di rete e metabolomica è stata ulteriormente costruita per ottenere una visione completa del processo di FP contro l'iperlipidemia. Le proteine bersaglio chiave ottenute sono state verificate mediante docking molecolare. Questi risultati riflettono che la FP ha migliorato i livelli plasmatici di lipidi e il danno epatico dell'iperlipidemia indotta da un HFD. L'acido gallico, la quercetina e il beta-sitosterolo nella FP sono stati dimostrati come composti attivi chiave. Un totale di 16 e sei potenziali metaboliti differenziali nel plasma e nel fegato, rispettivamente, sono risultati coinvolti negli effetti terapeutici della FP contro l'iperlipidemia da parte della metabolomica. Inoltre, l'analisi di integrazione ha indicato che gli effetti dell'intervento erano associati a CYP1A1, AChE e MGAM, così come l'aggiustamento di L-chinurenina, corticosterone, acetilcolina e raffinosio, coinvolgendo principalmente la via del metabolismo del triptofano. Il docking molecolare ha assicurato che gli ingredienti di cui sopra che agiscono sui bersagli proteici correlati all'iperlipidemia hanno svolto un ruolo chiave nell'abbassare i lipidi. In sintesi, questa ricerca ha fornito una nuova possibilità per prevenire e curare l'iperlipidemia.

Introduzione

L'iperlipidemia è una malattia metabolica comune con gravi impatti sulla salute umana ed è anche il principale fattore di rischio per le malattie cardiovascolari1. Recentemente, c'è stata una tendenza al ribasso legata all'età per questa malattia e i giovani sono diventati più suscettibili a causa di stili di vita irregolari a lungo termine e abitudini alimentari malsane2. Nella clinica, vari farmaci sono stati usati per trattare l'iperlipidemia. Ad esempio, uno dei farmaci più comunemente usati per i pazienti con iperlipidemia e disturbi aterosclerotici correlati sono le statine. Tuttavia, l'uso a lungo termine di statine ha effetti collaterali che non possono essere trascurati, che portano a una prognosi infausta, come intolleranza, resistenza al trattamento ed eventi avversi 3,4. Queste carenze sono diventate ulteriori dolori per i pazienti con iperlipidemia. Pertanto, dovrebbero essere proposti nuovi trattamenti per un'efficacia ipolipemizzante stabile e un minor numero di effetti collaterali.

La medicina tradizionale cinese (MTC) è stata ampiamente utilizzata per trattare le malattie a causa della sua buona efficacia e pochi effetti collaterali5. Fructus Phyllanthi (FP), il frutto secco di Phyllanthus emblica Linn. (popolarmente conosciuta come bacca di amla o uva spina indiana), è una famosa medicina e materiale omologo alimentare delle medicine tradizionali cinesi e indiane 6,7. Questo medicinale è stato utilizzato per eliminare il calore, raffreddare il sangue e promuovere la digestione, secondo le teorie TCM8. I moderni studi farmacologici hanno dimostrato che la FP è ricca di composti bioattivi come acidi gallici, acidi ellagici e quercetina9, che sono responsabili di una serie di proprietà biologiche sfaccettate, agendo come antiossidante, antinfiammatorio, protettivo del fegato, anti-ipolipidemia e così via10. Recenti ricerche hanno anche dimostrato che la FP potrebbe regolare efficacemente i lipidi nel sangue dei pazienti con iperlipidemia. Ad esempio, Variya et al.11 hanno dimostrato che il succo di frutta FP e il suo principale ingrediente chimico dell'acido gallico possono ridurre il colesterolo plasmatico e ridurre l'infiltrazione di olio nel fegato e nell'aorta. L'efficacia terapeutica era correlata alla regolazione della FP nell'aumentare l'espressione del recettore-alfa attivato dal proliferatore dei perossisomi e nel diminuire l'attività lipogenica epatica. Tuttavia, il meccanismo alla base della FP nel migliorare l'iperlipidemia dovrebbe essere ulteriormente studiato, perché i suoi ingredienti bioattivi sono piuttosto estesi. Abbiamo cercato di esplorare il potenziale meccanismo di efficacia terapeutica della FP, che può essere utile per l'ulteriore sviluppo e utilizzo di questo farmaco.

Attualmente, la farmacologia di rete è considerata una tecnica olistica ed efficiente per studiare il meccanismo terapeutico della MTC. Invece di cercare singoli geni che causano malattie e farmaci che trattano esclusivamente un bersaglio individuale, viene costruita una rete completa di farmaci-ingredienti-geni-malattie per trovare il meccanismo multi-target del farmaco multi-ingrediente per quanto riguarda il loro trattamento completo12. Questa tecnica è particolarmente adatta per la MTC, poiché le loro composizioni chimiche sono massicce. Sfortunatamente, la farmacologia di rete può essere utilizzata solo per prevedere obiettivi influenzati da ingredienti chimici in teoria. I metaboliti endogeni nel modello di malattia devono essere osservati per convalidare l'efficacia della farmacologia di rete. Il metodo della metabolomica, che emerge con lo sviluppo della biologia dei sistemi, è uno strumento importante per monitorare i cambiamenti nei metaboliti endogeni13. I cambiamenti nei metaboliti riflettono i cambiamenti dello stato stazionario dell'ospite, che è anche un indicatore importante per studiare il meccanismo interno. Alcuni ricercatori hanno integrato con successo la farmacologia di rete e la metabolomica per esplorare il meccanismo di interazione tra farmaci e malattie14,15.

Questo articolo esplora le basi meccanicistiche della FP contro l'iperlipidemia integrando tecniche di farmacologia di rete e metabolomica. La farmacologia di rete è stata applicata per analizzare la relazione tra i principali principi attivi nella FP e i bersagli molecolari per l'iperlipidemia. Successivamente, è stata eseguita la metabolomica per osservare il cambiamento dei metaboliti endogeni nel modello animale, che può spiegare le azioni della medicina a livello metabolico. Rispetto all'applicazione della sola farmacologia di rete o della sola metabonomica, questa analisi integrata ha fornito un meccanismo di ricerca più specifico e completo. Inoltre, la strategia di docking molecolare è stata utilizzata per analizzare l'interazione tra principi attivi e proteine chiave. In generale, questo approccio integrato potrebbe compensare la mancanza di prove sperimentali per la farmacologia di rete e la mancanza di un meccanismo endogeno per il metodo metabolomico, e può essere utilizzato per l'analisi del meccanismo terapeutico della medicina naturale. Il diagramma di flusso schematico principale del protocollo è mostrato nella Figura 1.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con la Guida alla medicina tradizionale cinese dell'Università di Chengdu per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e sono state approvate dal Comitato etico istituzionale dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (numero di protocollo 2020-36). Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 (20 ± 2 g). I topi sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Predizione basata sulla farmacologia di rete

NOTA: La farmacologia di rete viene utilizzata per prevedere i principi attivi e i loro obiettivi chiave della FP contro l'iperlipidemia.

  1. Selezione dei principi attivi e obiettivi chiave
    1. Cerca la parola chiave "Phyllanthi Fructus" nel database farmacologico del sistema di medicina tradizionale cinese (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) per ottenere l'elenco dei principi attivi candidati e dei bersagli della FP.
      NOTA: Normalmente, solo gli ingredienti con biodisponibilità orale (OB) ≥30% e valori farmaco-simili (DL) ≥0,18 nel database sono inclusi come principi attivi.
    2. Cerca la parola chiave "iperlipidemia" nel database GeneCards (https://www.genecards.org/), nel database Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; https://omim.org/) e nel database degli obiettivi terapeutici (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) per ottenere i rispettivi bersagli candidati di iperlipidemia. Scarica i fogli di calcolo degli obiettivi di malattia. Eliminare gli obiettivi ripetuti per ottenere l'elenco degli obiettivi di iperlipidemia.
    3. Copiare questi elenchi dai passaggi 1.1.1 e 1.1.2 in un nuovo foglio di calcolo. Utilizzare la funzione "Dati - Identifica duplicati" nella barra degli strumenti per ottenere obiettivi di intersezione. Importare l'elenco degli obiettivi di intersezione in UniProtKB (http://www.uniprot.org/) per standardizzare i nomi dei geni e delle proteine.
      NOTA: Questi obiettivi sono correlati sia alla FP che all'iperlipidemia. Pertanto, prevedere questi obiettivi di intersezione come bersagli della FP contro l'iperlipidemia.
  2. Costruzione di una rete di interazione proteina-proteina
    1. Aprire il database STRING (https://string-db.org/) 11.5. Incollare l'elenco degli obiettivi di intersezione di FP contro l'iperlipidemia nella finestra di dialogo "Elenco dei nomi". Seleziona Homo sapiens in "Organismi" e clicca su CERCA > CONTINUA.
      NOTA: Gli esseri umani e i topi hanno geni molto simili. Pertanto, un'ulteriore verifica sperimentale viene effettuata con i topi.
    2. Quando i risultati sono disponibili, selezionare il nascondi nodi disconnessi nella rete in "Impostazioni avanzate". Impostare la massima confidenza (0,900) in "punteggio minimo di interazione richiesto", quindi fare clic sul pulsante AGGIORNA .
    3. Fare clic su Esportazioni nella barra del titolo e scaricare il breve testo tabellare della rete di interazione proteina-proteina (PPI) in formato PNG e TSV.
  3. Costruzione di una rete farmaco-componente-malattia-bersaglio
    1. Aprire Cytoscape 3.9.1 (vedere Tabella dei materiali). Importare il file in formato TSV del passaggio 1.2.3. Ottimizza il colore, il carattere e il lato dei nodi di rete tramite la barra di stile nel pannello di controllo.
    2. Utilizzare la funzione "Analizza rete" per l'analisi della topologia di rete. Ottenere i geni hub da CytoHubba in Cytoscape. Stabilire la rete farmaco-ingrediente-bersaglio-malattia.
  4. Analisi dell'arricchimento GO e KEGG
    1. Apri DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Fare clic su Avvia analisi e incollare l'elenco di destinazione nella finestra di dialogo di sinistra. Selezionare SIMBOLO UFFICIALE DEL GENE in "Seleziona identificatore". Seleziona Homo sapiens in "Seleziona specie". Elenco dei geni di spunta in "Tipo di elenco". Fai clic su Invia elenco.
    2. Quando i risultati sono disponibili, fare clic su Analizza sopra l'elenco dei geni con uno degli strumenti DAVID. Tick GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT in "Ontologia genica" per l'analisi dell'arricchimento della funzione GO. Spuntare KEGG_Pathway in "Pathways" per l'analisi dell'arricchimento del pathway KEGG.
    3. Fare clic su Grafico di annotazione funzionale per visualizzare i risultati.
      NOTA: impostare la soglia di significatività statistica dell'analisi di arricchimento a p < 0,05.

2. Progettazione sperimentale

  1. La preparazione dell'estratto acquoso FP
    NOTA: FP viene elaborato nel laboratorio della professoressa Lina Xia presso l'Università di Chengdu di TCM8.
    1. Immergere la polvere essiccata di FP (90 g) in 1 L di acqua pura in un matraccio tarato pulito da 2 L. Utilizzare il trattamento ad ultrasuoni (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz) per aiutare a dissolvere per 30 minuti. Filtrare la soluzione per ottenere l'estratto con una garza medica sterile a doppio strato, 1 mm x 1 mm. Ripetere l'operazione di cui sopra tre volte per garantire la completa dissoluzione di FP.
    2. Utilizzare il metodo di evaporazione rotativa per un'ulteriore concentrazione. Impostare la velocità di rotazione a 50 giri/min con una temperatura di 60 °C per 4 ore. Concentrare l'estratto acquoso a 100 ml.
    3. Dividere uniformemente l'estratto grezzo di FP (0,9 g/ml) in due parti (50 ml). Una parte viene utilizzata come liquido FP ad alte dosi (0,9 g/ml). Aggiungere 50 ml di acqua pura in un'altra parte e considerarlo come il liquido FP a basso dosaggio (0,45 g / ml). Utilizzare le soluzioni acquose FP ad alto e basso dosaggio per la somministrazione. Conservare il liquido a -20 °C fino all'uso.
  2. Preparazione degli animali
    1. Ospitare 50 topi maschi C57BL/6 (20 ± 2 g) in una stanza ben ventilata a temperatura ambiente, con un ciclo luce-buio di 12 ore e libero accesso al cibo e all'acqua pura.
    2. Assegnare in modo casuale i topi a due gruppi: nutrire 10 topi con una dieta normale e 40 topi con una dieta ricca di grassi (vedi Tabella dei materiali) per indurre iperlipidemia.
      NOTA: Dopo aver mangiato per 8 settimane, i topi sono stati sottoposti a screening per ulteriori interventi farmacologici.
    3. Nell'8a settimana, prelevare circa 200 μL di sangue da ciascuna orbita del topo. Centrifugare il sangue per 10 minuti a 5.733 x g a 4 °C per ottenere campioni di plasma. Determinare i livelli di TC e TG con kit di analisi disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali).
    4. Selezionare sei topi con i livelli lipidici più normali come gruppo di controllo senza trattamento (NC). Seleziona 24 topi con un livello lipidico significativamente più alto come gruppo di dieta ad alto contenuto di grassi e dividili casualmente in quattro gruppi: gruppo dieta ricca di grassi (HFD), gruppo FP a basso dosaggio (FP_L), gruppo FP ad alte dosi (FP_H) e gruppo di controllo positivo (PC).
    5. Somministrare l'irrigazione gastrica ai gruppi FP_L e FP_H con due dosaggi di FP (dose bassa, 4,5 g / kg e dose alta, 9 g / kg), rispettivamente; irrigazione gastrica al gruppo PC con compresse di simvastatina (5 mg/kg; vedere Tabella dei materiali); e irrigazione gastrica ai gruppi NC e HFD con lo stesso volume di soluzione fisiologica una volta al giorno per 4 settimane.
      NOTA: Il presente studio ha utilizzato le soluzioni acquose di FP e simvastatina per il trattamento.
    6. Nella 12a settimana, dopo l'anestesia con pentobarbital sodico all'1% (30 mg/kg), sacrificare i topi di tutti i gruppi. Raccogliere ~ 400 μL di campioni di sangue dalla vena orbitale di ciascun topo.
      NOTA: Stimolare le dita dei piedi e le piante dei topi con una pinzetta. Se non c'è reazione, dimostra un'anestesia adeguata.
    7. Centrifugare il sangue per 10 minuti a 5.733 x g a 4 °C per ottenere campioni di plasma e determinare i livelli di TC, TG, LDL-C e HDL-C con kit di analisi disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali). Ottenere campioni di tessuto epatico16 e sottoporli ad analisi istopatologica. Utilizzare i restanti campioni di plasma ed epato per l'analisi metabolomica (fase 3).
      NOTA: Tutti i campioni vengono conservati a -80 °C fino all'uso.
  3. Esame istopatologico del fegato
    1. Fissare i tessuti epatici freschi con una soluzione di paraformaldeide al 4% per più di 24 ore. Estrarre il tessuto dal fissativo e levigare i tessuti bersaglio con un bisturi. Inserire il fazzoletto e l'etichetta corrispondente nell'essiccatore.
    2. Disidratazione in un gradiente di etanolo: 75% di alcol per 4 ore, 85% di alcol per 2 ore, 90% di alcol per 2 ore, 95% di alcol per 1 ora, etanolo assoluto per 1 ora, xilene per 30 min. Mettere la cassetta di tessuto in uno stampo di tessuto in cera di paraffina per tre lavaggi, 30 min ciascuno16.
    3. Inserire i tessuti imbevuti di cera nell'incastonatore di tessuto (vedere Tabella dei materiali). Prima che la cera si solidifichi, rimuovere i tessuti dall'essiccatore, inserirli nella scatola incorporata e attaccare l'etichetta corrispondente.
    4. Raffreddare i blocchi di cera in un tavolo di congelamento a -20 °C, rimuoverli dal telaio incorporato e tagliare il blocco di cera.
    5. Tagliare i blocchi di cera tagliati in sezioni spesse 3 μm usando un microtomo (vedi Tabella dei materiali). Far galleggiare le sezioni in acqua a 40 °C, toglierle dai vetrini e cuocere in forno a 60 °C. Dopo la cottura con acqua e cera asciutta, estrarlo e tenerlo a temperatura ambiente.
    6. Successivamente posizionare le sezioni in xilene I per 10 min, xilene II per 10 min, xilene III per 10 min, etanolo assoluto I per 5 min, etanolo assoluto II per 5 min, alcool al 75% per 5 minuti e lavare in acqua16.
    7. Macchiare le sezioni con una soluzione colorante di ematossilina per 4 minuti, una soluzione di alcol acido cloridrico all'1% (alcol al 75%) per la differenziazione, una soluzione di acqua di ammoniaca all'1% di blu e lavarle con acqua.
    8. Macchiare le sezioni con una soluzione colorante di eosina per 2 minuti e lavarle con acqua.
    9. Osservare le sezioni utilizzando un microscopio ottico con un ingrandimento di 200x e 400x.
  4. Analisi cromatografia-spettrometria di massa liquida LC-MS)
    1. Identificazione degli ingredienti del FP
      NOTA: L'analisi viene eseguita utilizzando cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata con spettrometria di massa ibrida quadrupolo-orbitrap ad alta risoluzione (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; vedere Tabella dei materiali).
      1. Misurare con precisione 1 g di polvere essiccata di FP e metterla in un matraccio tarato pulito da 50 ml.
      2. Aggiungere 25 ml di metanolo al 70% nel matraccio tarato e pesare accuratamente. Utilizzare il trattamento ad ultrasuoni (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz) per 30 minuti per favorire la dissoluzione. Pesare di nuovo con precisione per determinare con precisione la perdita dopo la dissoluzione e utilizzare il 70% di metanolo per compensare la perdita.
        NOTA: Non misurare il volume, poiché la scala del matraccio volumetrico non è accurata, specialmente dopo il bagno d'acqua a 4 °C.
      3. Agitare fino a mescolare completamente. Utilizzare una membrana microporosa da 0,22 μm per filtrare.
    2. Preparazione del campione di plasma
      1. Aggiungere con precisione 100 μL di plasma (fase 2.2.7) in un doppio volume (200 μL) di acetonitrile in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e farlo vortice con un vibratore a vortice per almeno 30 s. Seguire questa procedura per tutti i campioni.
      2. Centrifugare tutti i campioni a 17.200 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire i surnatanti dopo centrifugazione in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 ml. Asciugare i surnatanti sotto azoto. Ricostituire con 200 μL di solvente da estrazione (acetonitrile:acqua = 4:1 [v/v]).
      3. Vortice la soluzione ricostituita per almeno 30 s e utilizzare il trattamento ad ultrasuoni per 10 minuti (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz). Centrifugare a 17.200 x g per 10 minuti a 4 °C.
      4. Filtrare i surnatanti con membrane filtranti da 0,22 μm e mantenerli a 4 °C per l'analisi.
    3. Preparazione del campione di fegato
      1. Omogeneizzare 90 mg di tessuto epatico (fase 2.2.7) per 1 minuto in acqua metanolo ghiacciata (1:1, v/v, 1 mL) e centrifugarli a 21.500 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in provette da centrifuga da 1,5 ml. Seguire questa procedura per tutti i campioni.
      2. Estrarre nuovamente i precipitati seguendo la stessa procedura e raggruppare i surnatanti in nuove provette da centrifuga da 1,5 ml. Asciugare i surnatanti sotto azoto. Ricostituire con 300 μL del solvente di estrazione (metanolo:acqua = 4:1 [v/v]).
      3. Vortice la soluzione ricostituita per almeno 30 s e utilizzare il trattamento ad ultrasuoni per 10 minuti (a bagnomaria a 4 °C, potenza: 250 W, frequenza: 35 kHz). Centrifugare a 17.200 x g per 15 minuti a 4 °C.
      4. Filtrare i surnatanti con membrane filtranti da 0,22 μm e mantenerli a 4 °C per l'analisi.
        NOTA: I campioni aggregati di controllo di qualità (QC) sono stati preparati miscelando 10 μL di aliquote da ciascun campione di plasma e fegato (uno su sei campioni).
    4. Parametri di analisi di LC-MS
      NOTA: La fase mobile è costituita da acido formico allo 0,1% (solvente A) e acetonitrile (solvente B). Trasferire questi solventi in una bottiglia di vetro pulita e collegarli al sistema LC-MS.
      1. Impostare i programmi di gradiente dei campioni di plasma nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), mantenere al 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min) e mantenere all'1% B fino a 27 min.
      2. Impostare le condizioni dell'autocampionatore dei campioni di plasma nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: il volume di iniezione, 2 μL; e la portata, 0,3 ml/min, per ogni analisi.
      3. Impostare il programma di gradiente dei campioni di fegato nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min) e mantenere all'1% B fino a 45 min.
      4. Impostare le condizioni dell'autocampionatore dei campioni di fegato nel "file di ingresso" del sistema LC-MS come segue: volume di iniezione, 5 μL; e la portata, 0,3 ml/min, per ogni analisi.
      5. Impostare le condizioni di rilevamento MS dei campioni di plasma e fegato nel "MS tune file" del sistema LC-MS. Eseguire l'acquisizione MS utilizzando sia la modalità di ionizzazione positiva che negativa.
        NOTA: I parametri di ionizzazione elettrospray riscaldata sono i seguenti: tensione di spruzzo: 3,5 kV per ionizzazione positiva e 3,8 kV per ionizzazione negativa; Flusso gas guaina: 55 arb; flusso di gas ausiliario: 15 arb; temperatura del riscaldatore della sonda: 300 °C; e temperatura capillare: 350 °C.
      6. Importare i dati grezzi raccolti nel software Compound Discoverer e impostare il modello di metodo seguendo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).

3. Validazione metabolomica

NOTA: I dati di profilazione metabolomica dei metaboliti plasmatici ed epatici vengono importati nel software Compound Discoverer per eseguire l'estrazione delle caratteristiche metaboliche adottando un algoritmo di estrazione delle caratteristiche molecolari. Impostare i parametri come segue: deviazione di massa, 5 x 10-6; gamma di massa, 100-1.500; soglia del rapporto segnale/rumore (SNR), 3; e deviazione del tempo di ritenzione, 0,05. Valutare la stabilità e la ripetibilità della metabolomica mediante la deviazione standard relativa (RSD) delle aree di picco QC.

  1. Utilizzare il software SIMCA-P (vedi Tabella dei Materiali) per l'analisi statistica multivariata dei valori integrali ottenuti dai risultati LC-MS. Utilizzare l'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) per i dati centrati sulla media e la modellazione delle classi campione.
  2. Dopo il test OPLS-DA, considerare i metaboliti, con integrale con importanza variabile nei valori di proiezione (VIP) di >1 e un valore p di <0,05 dal t-test di Student come potenziali metaboliti differenziali.
  3. Identificare i metaboliti disturbati e le vie metaboliche da fonti di database aperte, tra cui Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) e MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualizza le visualizzazioni dei risultati di MetaboAnalyst5.0 e della piattaforma 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Docking molecolare

  1. Scarica rispettivamente la struttura 3D degli ingredienti FP selezionati dal database TCMSP. Cerca i nomi degli ingredienti nella casella di ricerca "Nome chimico" e scarica i file di struttura 3D corrispondenti in formato mol2.
  2. Scarica le strutture cristalline dei target chiave dall'AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Cerca i nomi di destinazione nella casella di ricerca e scarica i file delle strutture cristalline corrispondenti in formato pdb.
  3. Importare gli ingredienti e il file delle strutture di destinazione nel software AutoDockTools. Fare clic su Modifica > Elimina acqua per eliminare le molecole d'acqua. Fare clic su Modifica > idrogeni > Aggiungi per aggiungere idrogeni . Imposta gli ingredienti come "ligando" ed esegui l'attracco cieco selezionando l'intero bersaglio come "recettore"17.
  4. Inserisci un valore nella casella dietro "center" e "size" per regolare lo spazio appena sviluppato, rendendo possibile comprendere completamente il ligando e il recettore. Salvare i file ligando e recettore in formato pdbqt.
  5. Utilizzare AutoDock Vina per eseguire l'aggancio molecolare. Impostare la barra "Receptor" sul nome del 'receptor.pdbqt' e la barra "Ligand" sul nome del 'ligand.pdbqt'. Ottenere la posizione ottimale per il legame del ligando al recettore. Registrare il valore dell'energia di legame nella posizione ottimale.
    NOTA: il processo di attracco è stato calcolato dall'algoritmo genetico14. Tutte le opzioni di esecuzione dell'ancoraggio erano valori predefiniti. I telai di ancoraggio verranno automaticamente classificati dall'energia di legame più alta a quella più bassa.
  6. Importare i file di docking in PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) per ottenere il modello visivo del sistema. Scarica i file del modello in formato pse e importali nel software PyMOL (vedi Tabella dei materiali) per costruire un'ulteriore visualizzazione.

5. Analisi statistica

NOTA: utilizzare il software statistico SPSS (vedere la tabella dei materiali) per l'analisi dei dati. Considera il valore di p < 0,05 come statisticamente significativo.

  1. Esprimere i valori come media ± deviazione standard (SD).
  2. Eseguire un ANOVA unidirezionale seguito da differenza meno significativa post hoc (LSD), Dunnett (in caso di varianza uguale) o T3 di Dunnett (in caso di varianza disuguale) per testare la significatività statistica tra i gruppi.

Risultati

Farmacologia di rete
Un totale di 18 potenziali ingredienti in FP sono stati sottoposti a screening in base alle loro proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche dal database e dall'analisi LC-MS (i cromatogrammi ionici totali sono mostrati nella Figura supplementare 1). Attraverso la letteratura pertinente, il contenuto di acido gallico è molto più alto di altri ingredienti ed è efficace nel ridurre i lipidi 9,11. Perta...

Discussione

Negli ultimi anni, il tasso di incidenza di iperlipidemia è aumentato, principalmente a causa di abitudini alimentari malsane a lungo termine. La MTC e i suoi ingredienti chimici hanno varie attività farmacologiche, che sono state ampiamente studiate negli ultimi anni37,38. FP è una sorta di risorsa di frutta, utilizzata sia come medicina che come cibo, e ha un potenziale importante per il trattamento dell'iperlipidemia. Tuttavia, il potenziale meccanismo tera...

Divulgazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata supportata dal Product Development and Innovation Team di TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) e Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

Riferimenti

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