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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine integrierte Strategie zur Erforschung der wichtigsten Ziele und Mechanismen von Fructus Phyllanthi gegen Hyperlipidämie, basierend auf der Vorhersage der Netzwerkpharmakologie und der Verifizierung der Metabolomik.

Zusammenfassung

Hyperlipidämie ist weltweit zu einem der führenden Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Leberschäden geworden. Fructus Phyllanthi (FP) ist ein wirksames Medikament gegen Hyperlipidämie in den Theorien der Traditionellen Chinesischen Medizin (TCM) und der Indischen Medizin, der potenzielle Mechanismus muss jedoch weiter erforscht werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, den Mechanismus der FP gegen Hyperlipidämie aufzudecken, basierend auf einer integrierten Strategie, die die Vorhersage der Netzwerkpharmakologie mit der Validierung der Metabolomik kombiniert. Ein durch fettreiche Diät (HFD) induziertes Mäusemodell wurde durch die Auswertung der Plasmalipidspiegel erstellt, einschließlich Gesamtcholesterin (TC), Triglycerid (TG), Low-Density-Lipoprotein-Cholesterin (LDL-C) und High-Density-Lipoprotein-Cholesterin (HDL-C). Die Netzwerkpharmakologie wurde angewendet, um die Wirkstoffe von FP und mögliche Angriffspunkte gegen Hyperlipidämie herauszufinden. Metabolomik von Plasma und Leber wurde durchgeführt, um differentielle Metaboliten und ihre entsprechenden Signalwege zwischen der Normalgruppe, der Modellgruppe und der Interventionsgruppe zu identifizieren. Die Beziehung zwischen Netzwerkpharmakologie und Metabolomik wurde weiter konstruiert, um einen umfassenden Überblick über den Prozess der FP gegen Hyperlipidämie zu erhalten. Die erhaltenen Schlüsselzielproteine wurden durch molekulares Andocken verifiziert. Diese Ergebnisse spiegelten wider, dass FP die Plasmalipidspiegel und die Leberschädigung der durch eine HFD induzierten Hyperlipidämie verbesserte. Gallussäure, Quercetin und Beta-Sitosterol in FP wurden als die wichtigsten Wirkstoffe nachgewiesen. Insgesamt wurden 16 bzw. sechs potentielle differentielle Metaboliten im Plasma bzw. in der Leber gefunden, die an den therapeutischen Effekten von FP gegen Hyperlipidämie durch Metabolomik beteiligt sind. Darüber hinaus zeigte die Integrationsanalyse, dass die Interventionseffekte mit CYP1A1, AChE und MGAM sowie mit der Anpassung von L-Kynurenin, Corticosteron, Acetylcholin und Raffinose assoziiert waren, wobei hauptsächlich der Tryptophan-Stoffwechselweg beteiligt war. Molekulares Docking stellte sicher, dass die oben genannten Inhaltsstoffe, die auf Hyperlipidämie-bedingte Proteinziele wirken, eine Schlüsselrolle bei der Senkung der Lipide spielen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Forschung eine neue Möglichkeit zur Vorbeugung und Behandlung von Hyperlipidämie bietet.

Einleitung

Hyperlipidämie ist eine häufige Stoffwechselerkrankung mit schwerwiegenden Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und auch der Hauptrisikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen1. In jüngster Zeit ist ein altersbedingter Abwärtstrend für diese Krankheit zu beobachten, und jüngere Menschen sind aufgrund eines langfristig unregelmäßigen Lebensstils und ungesunder Essgewohnheiten anfälliger geworden2. In der Klinik wurden verschiedene Medikamente zur Behandlung von Hyperlipidämie eingesetzt. Eines der am häufigsten verwendeten Medikamente für Patienten mit Hyperlipidämie und verwandten atherosklerotischen Störungen sind beispielsweise Statine. Die langfristige Einnahme von Statinen hat jedoch nicht zu vernachlässigende Nebenwirkungen, die zu einer schlechten Prognose führen, wie z. B. Unverträglichkeit, Therapieresistenz und unerwünschte Ereignisse 3,4. Diese Unzulänglichkeiten sind für Hyperlipidämie-Patienten zu zusätzlichen Schmerzen geworden. Daher sollten neuartige Behandlungen für eine stabile lipidsenkende Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen vorgeschlagen werden.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) wird aufgrund ihrer guten Wirksamkeit und ihrer geringen Nebenwirkungen häufig zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt5. Fructus Phyllanthi (FP), die Trockenfrucht von Phyllanthus emblica Linn. (im Volksmund als Amla-Beere oder indische Stachelbeere bekannt), ist ein berühmtes Medizin- und Lebensmittel-homologes Material der traditionellen chinesischen und indischen Medizin 6,7. Dieses Arzneimittel wurde gemäß den TCM-Theorien8 verwendet, um Hitze zu beseitigen, das Blut zu kühlen und die Verdauung zu fördern. Moderne pharmakologische Studien haben gezeigt, dass FP reich an bioaktiven Verbindungen wie Gallussäuren, Ellagsäuren und Quercetin9 ist, die für eine Reihe facettenreicher biologischer Eigenschaften verantwortlich sind, indem sie als Antioxidans, entzündungshemmend, leberschützend, antihypolipidämisch usw. wirken10. Neuere Forschungen haben auch gezeigt, dass FP die Blutfette von Patienten mit Hyperlipidämie effektiv regulieren kann. Zum Beispiel haben Variya et al.11 gezeigt, dass FP-Fruchtsaft und sein chemischer Hauptbestandteil Gallussäure den Plasmacholesterinspiegel senken und das Eindringen von Öl in Leber und Aorta verringern können. Die therapeutische Wirksamkeit hing mit der Regulation von FP zusammen, die Expression von Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor-alpha zu erhöhen und die hepatische lipogene Aktivität zu verringern. Der zugrunde liegende Mechanismus von FP bei der Verbesserung der Hyperlipidämie sollte jedoch weiter untersucht werden, da seine bioaktiven Inhaltsstoffe recht umfangreich sind. Wir haben versucht, den potenziellen Mechanismus der therapeutischen Wirksamkeit von FP zu untersuchen, der für die weitere Entwicklung und Anwendung dieses Arzneimittels von Vorteil sein könnte.

Gegenwärtig wird die Netzwerkpharmakologie als ganzheitliche und effiziente Technik angesehen, um den therapeutischen Mechanismus der TCM zu untersuchen. Anstatt nach einzelnen krankheitsverursachenden Genen und Medikamenten zu suchen, die nur ein einzelnes Ziel behandeln, wird ein vollständiges Netzwerk von Arzneimitteln, Inhaltsstoffen, Genen und Krankheiten aufgebaut, um den Multi-Zielmechanismus des Arzneimittels mit mehreren Inhaltsstoffen in Bezug auf ihre umfassende Behandlung zu finden12. Diese Technik eignet sich besonders für die TCM, da ihre chemische Zusammensetzung massiv ist. Leider kann die Netzwerkpharmakologie nur theoretisch zur Vorhersage von Zielen verwendet werden, die von chemischen Inhaltsstoffen beeinflusst werden. Die endogenen Metaboliten im Krankheitsmodell sollten beobachtet werden, um die Wirksamkeit der Netzwerkpharmakologie zu validieren. Die Metabolomik-Methode, die mit der Entwicklung der Systembiologie auftaucht, ist ein wichtiges Werkzeug zur Überwachung der Veränderungen in endogenen Metaboliten13. Die Veränderungen der Metaboliten spiegeln die stationären Zustandsänderungen des Wirts wider, was auch ein wichtiger Indikator für die Untersuchung des internen Mechanismus ist. Einigen Forschern ist es gelungen, Netzwerkpharmakologie und Metabolomik zu integrieren, um den Interaktionsmechanismus zwischen Medikamenten und Krankheiten zu erforschen14,15.

Dieser Artikel untersucht die mechanistischen Grundlagen der FP gegen Hyperlipidämie durch die Integration von Netzwerkpharmakologie und Metabolomik-Techniken. Die Netzwerkpharmakologie wurde angewendet, um die Beziehung zwischen den Hauptwirkstoffen in FP und molekularen Zielen für Hyperlipidämie zu analysieren. Anschließend wurde eine Metabolomik durchgeführt, um die Veränderung der endogenen Metaboliten im Tiermodell zu beobachten, was die Arzneimittelwirkung auf metabolischer Ebene erklären kann. Verglichen mit der alleinigen Anwendung der Netzwerkpharmakologie oder Metabonomik bot diese integrierte Analyse einen spezifischeren und umfassenderen Forschungsmechanismus. Darüber hinaus wurde die molekulare Docking-Strategie verwendet, um die Interaktion zwischen Wirkstoffen und Schlüsselproteinen zu analysieren. Im Allgemeinen könnte dieser integrierte Ansatz den Mangel an experimenteller Evidenz für die Netzwerkpharmakologie und das Fehlen eines endogenen Mechanismus für die Metabolomik-Methode kompensieren und für die Analyse des therapeutischen Mechanismus der Naturheilkunde verwendet werden. Das schematische Hauptflussdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

Protokoll

Alle Verfahren, die den Umgang mit Tieren betreffen, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Chengdu durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission der Universität für Traditionelle Chinesische Medizin Chengdu genehmigt (Protokollnummer 2020-36). Für die vorliegende Studie wurden männliche C57BL/6-Mäuse (20 ± 2 g) verwendet. Die Mäuse wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle).

1. Netzwerkpharmakologie-basierte Vorhersage

HINWEIS: Die Netzwerkpharmakologie wird verwendet, um die Wirkstoffe und ihre Hauptziele von FP gegen Hyperlipidämie vorherzusagen.

  1. Auswahl der Wirkstoffe und der wichtigsten Ziele
    1. Suchen Sie nach dem Stichwort "Phyllanthi Fructus" in der pharmakologischen Datenbank (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) des Systems der Traditionellen Chinesischen Medizin, um die Liste der Wirkstoffkandidaten und Ziele von FP zu erhalten.
      HINWEIS: Normalerweise werden nur Inhaltsstoffe mit oraler Bioverfügbarkeit (OB) ≥30% und wirkstoffähnlichen (DL) Werten ≥0,18 in der Datenbank als Wirkstoffe aufgenommen.
    2. Suchen Sie nach dem Stichwort "Hyperlipidämie" in der GeneCards-Datenbank (https://www.genecards.org/), der Online Mendelian Inheritance in Man Datenbank (OMIM; https://omim.org/) und der therapeutischen Zieldatenbank (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/), um die jeweiligen Kandidaten für Hyperlipidämie zu erhalten. Laden Sie die Tabellen mit den Krankheitszielen herunter. Löschen Sie die wiederholten Ziele, um die Liste der Hyperlipidämieziele zu erhalten.
    3. Kopieren Sie diese Listen aus den Schritten 1.1.1 und 1.1.2 in eine neue Tabelle. Verwenden Sie die Funktion "Daten - Duplikate identifizieren" in der Symbolleiste, um Schnittpunkte zu erhalten. Importieren Sie die Kreuzungszielliste in UniProtKB (http://www.uniprot.org/), um die Gen- und Proteinnamen zu standardisieren.
      HINWEIS: Diese Ziele beziehen sich sowohl auf FP als auch auf Hyperlipidämie. Sagen Sie daher diese Schnittziele als Ziele der FP gegen Hyperlipidämie voraus.
  2. Aufbau eines Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks
    1. Öffnen Sie die STRING-Datenbank (https://string-db.org/) 11.5. Fügen Sie die Schnittpunktzielliste von FP gegen Hyperlipidämie in das Dialogfeld "Liste der Namen" ein. Wählen Sie unter "Organismen" Homo sapiens aus und klicken Sie auf SUCHEN > WEITER.
      HINWEIS: Menschen und Mäuse haben sehr ähnliche Gene. Daher wird eine weitere experimentelle Verifizierung mit Mäusen durchgeführt.
    2. Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, aktivieren Sie unter "Erweiterte Einstellungen" das Kontrollkästchen Getrennte Knoten im Netzwerk ausblenden . Legen Sie die höchste Konfidenz (0,900) für "Minimum required interaction score" fest und klicken Sie dann auf die Schaltfläche AKTUALISIEREN .
    3. Klicken Sie in der Titelleiste auf Exporte und laden Sie den kurzen Tabellentext des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) im PNG- und TSV-Format herunter.
  3. Aufbau eines Drug-Component-Disease-Target-Netzwerks
    1. Öffnen Sie Cytoscape 3.9.1 (siehe Materialtabelle). Importieren Sie die TSV-Formatdatei aus Schritt 1.2.3. Optimieren Sie die Farbe, die Schriftart und die Seite der Netzwerkknoten über die Stilleiste in der Systemsteuerung.
    2. Verwenden Sie die Funktion "Netzwerk analysieren" für die Analyse der Netzwerktopologie. Erhalten Sie Hub-Gene von CytoHubba in Cytoscape. Etablieren Sie das Netzwerk aus Arzneimitteln, Inhaltsstoffen und Zielkrankheiten.
  4. GO- und KEGG-Anreicherungsanalyse
    1. Öffnen Sie DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Klicken Sie auf Analyse starten und fügen Sie die Zielliste in das linke Dialogfeld ein. Wählen Sie unter "Kennung auswählen" die Option OFFIZIELLES GENSYMBOL aus. Wählen Sie Homo sapiens unter "Spezies auswählen" aus. Setzen Sie ein Häkchen bei Genliste unter "Listentyp". Klicken Sie auf Liste senden.
    2. Wenn die Ergebnisse verfügbar sind, klicken Sie auf Analysieren Sie die obige Genliste mit einem der DAVID-Tools. Setzen Sie ein Häkchen bei GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT in "Gene Ontology" für die Analyse der GO-Funktionsanreicherung. Kreuzen Sie KEGG_Pathway in "Pathways" für die KEGG-Pathway-Anreicherungsanalyse an.
    3. Klicken Sie auf Functional Annotation Chart , um die Ergebnisse anzuzeigen.
      HINWEIS: Legen Sie den Schwellenwert für die statistische Signifikanz der Anreicherungsanalyse auf p < 0,05 fest.

2. Versuchsplanung

  1. Das wässrige Extraktpräparat FP
    HINWEIS: FP wird im Labor von Professor Lina Xia an der Chengdu University of TCM8 verarbeitet.
    1. Das getrocknete FP-Pulver (90 g) in 1 l reinem Wasser in einem sauberen 2-Liter-Messkolben einweichen. Verwenden Sie eine Ultraschallbehandlung (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz), um die Auflösung für 30 Minuten zu unterstützen. Filtern Sie die Lösung, um den Extrakt zu erhalten, mit einer doppelschichtigen, 1 mm x 1 mm sterilen medizinischen Gaze. Wiederholen Sie den obigen Vorgang dreimal, um die vollständige Auflösung von FP sicherzustellen.
    2. Verwenden Sie die Rotationsverdampfungsmethode für eine weitere Konzentration. Stellen Sie die Drehzahl auf 50 U/min mit einer Temperatur von 60 °C für 4 h ein. Konzentrieren Sie den wässrigen Extrakt auf 100 ml.
    3. Den Rohextrakt von FP (0,9 g/ml) gleichmäßig in zwei Teile (50 ml) teilen. Ein Teil wird als hochdosierte FP-Flüssigkeit (0,9 g/ml) verwendet. Geben Sie 50 ml reines Wasser in einen anderen Teil und betrachten Sie es als niedrig dosierte FP-Flüssigkeit (0,45 g/ml). Verwenden Sie für die Verabreichung die hoch- und niedrig dosierten wässrigen FP-Lösungen. Lagern Sie die Flüssigkeit bis zur Verwendung bei -20 °C.
  2. Tiervorbereitung
    1. Unterbringe 50 männliche C57BL/6 Mäuse (20 ± 2 g) in einem gut belüfteten Raum bei Raumtemperatur, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Futter und reinem Wasser.
    2. Ordnen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip zwei Gruppen zu: Füttern Sie 10 Mäuse mit normaler Ernährung und 40 Mäuse mit einer fettreichen Diät (siehe Materialtabelle), um eine Hyperlipidämie zu induzieren.
      HINWEIS: Nach 8-wöchiger Fütterung wurden die Mäuse auf weitere medikamentöse Interventionen untersucht.
    3. In der 8. Woche werden etwa 200 μl Blut aus jeder Maushöhle entnommen. Zentrifugieren Sie das Blut 10 Minuten lang bei 5.733 x g bei 4 °C, um Plasmaproben zu erhalten. Bestimmen Sie die TC- und TG-Gehalte mit handelsüblichen Assay-Kits (siehe Materialtabelle).
    4. Wählen Sie sechs Mäuse mit den normalsten Lipidwerten als Kontrollgruppe ohne Behandlung (NC) aus. Wählen Sie 24 Mäuse mit einem signifikant höheren Lipidspiegel als Gruppe mit fettreicher Diät aus und teilen Sie sie nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen ein: Gruppe mit fettreicher Diät (HFD), Gruppe mit niedrig dosiertem FP (FP_L), Gruppe mit hochdosiertem FP (FP_H) und Gruppe mit Positivkontrolle (PC).
    5. Verabreichen Sie der FP_L- und FP_H Gruppe eine Magenspülung mit zwei Dosierungen von FP (niedrige Dosis, 4,5 g/kg bzw. hohe Dosis, 9 g/kg); Magenspülung in der PC-Gruppe mit Simvastatin-Tabletten (5 mg/kg; siehe Materialtabelle); und Magenspülung in die NC- und HFD-Gruppen mit der gleichen Menge an physiologischer Kochsalzlösung einmal täglich für 4 Wochen.
      HINWEIS: In der aktuellen Studie wurden die wässrigen Lösungen von FP und Simvastatin zur Behandlung verwendet.
    6. In der 12. Woche, nach Narkose mit 1% Pentobarbitalnatrium (30 mg/kg), die Mäuse aller Gruppen opfern. Sammeln Sie ~400 μl Blutproben aus der Orbitalvene jeder Maus.
      Anmerkungen: Stimulieren Sie die Zehen und Fußsohlen der Mäuse mit einer Pinzette. Wenn keine Reaktion auftritt, erweist sich eine ausreichende Anästhesie.
    7. Zentrifugieren Sie das Blut 10 Minuten lang bei 5.733 x g bei 4 °C, um Plasmaproben zu erhalten, und bestimmen Sie die TC-, TG-, LDL-C- und HDL-C-Spiegel mit handelsüblichen Assay-Kits (siehe Materialtabelle). Es werden Lebergewebeproben16 entnommen und histopathologisch analysiert. Verwenden Sie die verbleibenden Plasma- und Leberproben für die Metabolomik-Analyse (Schritt 3).
      HINWEIS: Alle Proben werden bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.
  3. Histopathologische Untersuchung der Leber
    1. Fixieren Sie frisches Lebergewebe mit 4%iger Paraformaldehydlösung für mehr als 24 Stunden. Nehmen Sie das Gewebe aus dem Fixiermittel und glätten Sie das Zielgewebe mit einem Skalpell. Legen Sie das Taschentuch und das dazugehörige Etikett in den Dörrautomaten.
    2. Dörren in einem Ethanolgradienten: 75% Alkohol für 4 h, 85% Alkohol für 2 h, 90% Alkohol für 2 h, 95% Alkohol für 1 h, absolutes Ethanol für 1 h, Xylol für 30 min. Legen Sie die Gewebekassette für drei Waschgänge von je 30 Minuten in eine Gewebeform aus Paraffinwachs16 Minuten.
    3. Legen Sie die wachsgetränkten Tücher in den Tissue-Embedder (siehe Materialtabelle). Bevor das Wachs erstarrt, nehmen Sie die Taschentücher aus dem Dörrgerät, legen Sie sie in die eingebettete Schachtel und bringen Sie das entsprechende Etikett an.
    4. Kühlen Sie die Wachsblöcke in einem -20 °C Gefriertisch ab, entfernen Sie sie aus dem eingebetteten Rahmen und schneiden Sie den Wachsblock ab.
    5. Schneiden Sie die beschnittenen Wachsblöcke mit einem Mikrotom in 3 μm dicke Abschnitte (siehe Materialtabelle). Die Stücke in 40 °C heißem Wasser schwimmen lassen, von den Objektträgern nehmen und bei 60 °C backen. Nach dem Backen mit Wasser und Trockenwachs herausnehmen und bei Raumtemperatur aufbewahren.
    6. Legen Sie die Abschnitte nacheinander 10 Minuten lang in Xylol I, 10 Minuten in Xylol II, 10 Minuten in Xylol III, 5 Minuten in absolutes Ethanol I, 5 Minuten in absolutes Ethanol II, 5 Minuten in 75%igen Alkohol und waschen Sie sie in Wasser16.
    7. Färben Sie die Abschnitte 4 Minuten lang mit Hämatoxylin-Färbelösung, 1 % Salzsäurealkohollösung (75 % Alkohol) zur Differenzierung, 1 % Ammoniakwasserlösung blau zurück und waschen Sie sie mit Wasser.
    8. Färben Sie die Abschnitte 2 Minuten lang mit Eosin-Färbelösung und waschen Sie sie mit Wasser.
    9. Betrachten Sie die Schnitte mit einem Lichtmikroskop mit einer 200- und 400-fachen Vergrößerung.
  4. Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Analyse
    1. Identifizierung der Inhaltsstoffe von FP
      HINWEIS: Die Analyse wird mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit hochauflösender Hybrid-Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometrie (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; siehe Materialtabelle) durchgeführt.
      1. Messen Sie genau 1 g getrocknetes FP-Pulver ab und geben Sie es in einen sauberen 50-ml-Messkolben.
      2. Geben Sie 25 ml 70%iges Methanol in den Messkolben und wiegen Sie genau. Verwenden Sie eine Ultraschallbehandlung (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz) für 30 min, um die Auflösung zu unterstützen. Wiegen Sie erneut genau, um den Verlust nach der Auflösung genau zu bestimmen, und verwenden Sie 70 % Methanol, um den Verlust auszugleichen.
        Anmerkungen: Messen Sie nicht das Volumen, da die Skala des Messkolbens nicht genau ist, insbesondere nach dem 4 °C warmen Wasserbad.
      3. Schütteln, um vollständig zu mischen. Verwenden Sie zum Filtern eine mikroporöse Membran von 0,22 μm.
    2. Vorbereitung von Plasmaproben
      1. Präzise 100 μl Plasma (Schritt 2.2.7) in ein doppeltes Volumen (200 μl) Acetonitril in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben und mindestens 30 s lang mit einem Vortex-Vibrator vortexieren. Befolgen Sie dieses Verfahren für alle Proben.
      2. Alle Proben werden bei 17.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände nach der Zentrifugation in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Trocknen Sie die Überstände unter Stickstoff. Rekonstituieren Sie mit 200 μl Extraktionslösungsmittel (Acetonitril:Wasser = 4:1 [v/v]).
      3. Die rekonstituierte Lösung wird mindestens 30 s lang gewirbelt und 10 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz). Bei 17.200 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren.
      4. Filtrieren Sie die Überstände mit 0,22 μm Filtermembranen und halten Sie sie zur Analyse bei 4 °C.
    3. Vorbereitung von Leberproben
      1. 90 mg Lebergewebe (Schritt 2.2.7) werden 1 min in eiskaltem Methanol-Wasser (1:1, v/v, 1 mL) homogenisiert und bei 21.500 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Übertragen Sie den Überstand in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Befolgen Sie dieses Verfahren für alle Proben.
      2. Extrahieren Sie die Ausfällungen nach dem gleichen Verfahren erneut und fassen Sie die Überstände in neuen 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zusammen. Trocknen Sie die Überstände unter Stickstoff. Rekonstituieren Sie mit 300 μl des Extraktionslösungsmittels (Methanol:Wasser = 4:1 [v/v]).
      3. Die rekonstituierte Lösung wird mindestens 30 s lang gewirbelt und 10 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (im 4 °C warmen Wasserbad, Leistung: 250 W, Frequenz: 35 kHz). Bei 17.200 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren.
      4. Filtrieren Sie die Überstände mit 0,22 μm Filtermembranen und halten Sie sie zur Analyse bei 4 °C.
        HINWEIS: Die gepoolten Qualitätskontrollproben (QC) wurden durch Mischen von 10-μl-Aliquoten aus jeder Plasma- und Leberprobe (eine pro sechs Proben) hergestellt.
    4. Analyseparameter der LC-MS
      HINWEIS: Die mobile Phase besteht aus 0,1 % Ameisensäure (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B). Füllen Sie diese Lösungsmittel in eine saubere Glasflasche und verbinden Sie sie mit dem LC-MS-System.
      1. Stellen Sie die Gradientenprogramme von Plasmaproben in der "Einlassdatei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: 1 % B (0-1,5 min), 1 %-60 % B (1,5-13,0 min), 60 %-99 % B (13,0-20,0 min), bei 99 % B (20,0-25,0 min), 99 %-1 % B (25,0-25,1 min) und bei 1 % B bis 27 min halten.
      2. Stellen Sie die Autosampler-Bedingungen der Plasmaproben in der "Einlassdatei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: das Injektionsvolumen, 2 μl; und die Flussrate von 0,3 ml/min für jede Analyse.
      3. Stellen Sie das Gradientenprogramm der Leberproben in der "Einlassdatei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: 1 % B (0-1 min), 1 %-53 % B (1-15 min), 53 %-70 % B (15-30 min), 70 %-90 % B (30-32 min), 90 %-95 % B (32-40 min), 95 %-1 % B (40-42 min) und bis 45 min bei 1 % B halten.
      4. Stellen Sie die Autosampler-Bedingungen der Leberproben in der "Inlet-Datei" des LC-MS-Systems wie folgt ein: Injektionsvolumen, 5 μL; und die Flussrate von 0,3 ml/min für jede Analyse.
      5. Stellen Sie die MS-Detektionsbedingungen sowohl der Plasma- als auch der Leberprobe in der "MS-Tune-Datei" des LC-MS-Systems ein. Führen Sie die MS-Erfassung sowohl im positiven als auch im negativen Ionisationsmodus durch.
        Anmerkungen: Die Parameter für die Ionisation des beheizten Elektrosprays sind wie folgt: Sprühspannung: 3,5 kV für positive Ionisation und 3,8 kV für negative Ionisation; Mantelgasdurchfluss: 55 Arb; Hilfsgasstrom: 15 Arb; Temperatur der Sondenheizung: 300 °C; und Kapillartemperatur: 350 °C.
      6. Importieren Sie die gesammelten Rohdaten in die Compound Discoverer-Software und legen Sie die Methodenvorlage gemäß den Anweisungen des Herstellers fest (siehe Materialtabelle).

3. Metabolomische Validierung

HINWEIS: Die metabolomischen Profiling-Daten von Plasma- und Lebermetaboliten werden in die Compound Discoverer-Software importiert, um die Extraktion metabolischer Merkmale durchzuführen, indem ein Algorithmus zur Extraktion molekularer Merkmale verwendet wird. Stellen Sie die Parameter wie folgt ein: Massenabweichung, 5 x 10-6; Massenbereich, 100-1.500; Schwellenwert für das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR), 3; und Retentionszeitabweichung 0,05. Bewerten Sie die Stabilität und Wiederholbarkeit der Metabolomik anhand der relativen Standardabweichung (RSD) der QC-Peakbereiche.

  1. Verwenden Sie die SIMCA-P-Software (siehe Materialtabelle) für die multivariate statistische Analyse der Integralwerte, die aus LC-MS-Befunden gewonnen wurden. Verwenden Sie die orthogonale partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminanzanalyse (OPLS-DA) für die mittelwertzentrierten Daten und die Modellierung von Stichprobenklassen.
  2. Betrachten Sie nach dem OPLS-DA-Test die Metaboliten mit Integral mit variabler Bedeutung in der Projektion (VIP) von >1 und einem p-Wert von <0,05 aus dem Student-t-Test als potenzielle differentielle Metaboliten.
  3. Identifizieren Sie die gestörten Metaboliten und Stoffwechselwege anhand offener Datenbankquellen, einschließlich Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) und MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualisieren Sie die Ergebnisansichten von MetaboAnalyst5.0 und der Plattform 'Wu Kong' (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Molekulares Andocken

  1. Laden Sie die 3D-Struktur der ausgewählten FP-Inhaltsstoffe aus der TCMSP-Datenbank herunter. Suchen Sie die Namen der Inhaltsstoffe im Suchfeld "Chemischer Name" und laden Sie die entsprechenden 3D-Strukturdateien im mol2-Format herunter.
  2. Laden Sie die Kristallstrukturen der wichtigsten Targets aus der AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/) herunter. Suchen Sie die Zielnamen im Suchfeld und laden Sie die entsprechenden Kristallstrukturdateien im PDB-Format herunter.
  3. Importieren Sie die Datei mit Zutaten und Zielstrukturen in die AutoDockTools-Software. Klicken Sie auf Bearbeiten > Wasser löschen, um Wassermoleküle zu löschen. Klicken Sie auf Bearbeiten > Wasserstoffe > Hinzufügen , um Wasserstoff hinzuzufügen. Legen Sie die Inhaltsstoffe als "Liganden" fest und führen Sie ein blindes Andocken durch, indem Sie die gesamten Ziele als "Rezeptor" auswählen17.
  4. Geben Sie einen Wert in das Feld hinter "center" und "size" ein, um den neu entwickelten Raum so anzupassen, dass der Ligand und der Rezeptor vollständig umschlossen werden können. Speichern Sie die Liganden- und Rezeptordateien im pdbqt-Format.
  5. Verwenden Sie AutoDock Vina, um molekulares Docking durchzuführen. Setzen Sie den Balken "Rezeptor" auf den Namen der Datei "receptor.pdbqt" und den Balken "Ligand" auf den Namen der Datei "ligand.pdbqt". Ermitteln Sie die optimale Position für die Bindung des Liganden an den Rezeptor. Notieren Sie den Bindungsenergiewert an der optimalen Position.
    HINWEIS: Der Andockvorgang wurde mit dem genetischen Algorithmus14 berechnet. Bei allen Optionen für die Dockingausführung handelte es sich um Standardwerte. Das Andocken von Frames wird automatisch von der höchsten zur niedrigsten Bindungsenergie gereiht.
  6. Importieren Sie die Docking-Dateien in PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index), um das visuelle Systemmodell zu erhalten. Laden Sie die Modelldateien im PSE-Format herunter und importieren Sie sie in die PyMOL-Software (siehe Materialtabelle), um weitere Visualisierungen zu erstellen.

5. Statistische Analyse

HINWEIS: Verwenden Sie für die Datenanalyse die Statistiksoftware SPSS (siehe Materialtabelle). Betrachten Sie den Wert von p < 0,05 als statistisch signifikant.

  1. Drücken Sie die Werte als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) aus.
  2. Führen Sie eine einfaktorielle ANOVA durch, gefolgt von einer Post-hoc-LSD-Analyse (Least Significant Difference), Dunnett (bei gleicher Varianz) oder Dunnetts T3 (bei ungleicher Varianz), um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu testen.

Ergebnisse

Netzwerk Pharmakologie
Insgesamt wurden 18 potentielle Inhaltsstoffe in FP nach ihren pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften aus der Datenbank und der LC-MS-Analyse gescreent (die Gesamtionenchromatogramme sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt). In der einschlägigen Literatur wird darauf hingewiesen, dass der Gehalt an Gallussäure viel höher ist als bei anderen Inhaltsstoffen und die Lipide wirksam senkt 9,11

Diskussion

In den letzten Jahren ist die Inzidenzrate von Hyperlipidämien gestiegen, was vor allem auf langfristige ungesunde Essgewohnheiten zurückzuführen ist. Die TCM und ihre chemischen Inhaltsstoffe haben verschiedene pharmakologische Aktivitäten, die in den letzten Jahren umfassend untersucht wurden37,38. FP ist eine Art Fruchtressource, die sowohl als Medizin als auch als Lebensmittel verwendet wird und ein wichtiges Potenzial zur Behandlung von Hyperlipidämie h...

Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das Produktentwicklungs- und Innovationsteam der TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) und Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+" unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Version 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Version 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
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HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
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JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Version 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Version 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Version 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

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