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Method Article
在该协议中,我们描述了利用组合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和腺相关病毒(AAV)单向导RNA(sgRNA)系统生成棕色脂肪组织(BAT)特异性敲除小鼠的技术程序。所描述的步骤包括sgRNA的设计,AAV-sgRNA颗粒的制备以及将AAV显微注射到BAT叶中。
棕色脂肪组织(BAT)是一种专门用于能量耗散的脂肪库,也可以通过分泌生物活性分子 作为 内分泌器官。创建BAT特异性敲除小鼠是了解目的基因对BAT介导的能量调节的贡献的最流行方法之一。利用Cre-LoxP系统的传统基因靶向策略一直是产生组织特异性敲除小鼠的主要方法。但是,这种方法既耗时又乏味。在这里,我们描述了一种使用组合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和腺相关病毒(AAV)单向导RNA(sgRNA)系统快速有效地敲除BAT中目的基因的方案。肩胛间蝙蝠位于肌肉之间的深层。因此,必须对BAT进行曝光,以便将AAV精确地直接注入视野内的BAT。适当的手术处理对于防止交感神经和血管受损至关重要,例如连接到BAT的Sultzer静脉。为了尽量减少组织损伤,迫切需要了解BAT的三维解剖位置以及技术步骤中所需的手术技能。该协议重点介绍了关键技术程序,包括靶向目的基因的sgRNA的设计,AAV-sgRNA颗粒的制备,以及将AAV直接显微注射到两个BAT叶中以产生BAT特异性敲除小鼠的手术,可广泛应用于研究BAT中基因的生物学功能。
肥胖症在世界范围内以显着的速度增加,导致广泛的代谢疾病1,2,3。脂肪组织是这些病理的关键。存在的两种功能不同的脂肪组织类型是储存多余卡路里的白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)及其相关的米色/盐渍脂肪,它们消耗能量以进行产热。虽然BAT因其耗能功能而得到认可,但它也通过产生调节远端器官代谢的生物活性分子而具有内分泌功能4,5。对啮齿动物的大量研究表明,增加棕色或米色脂肪的数量或活性会导致能量消耗增加和胰岛素敏感性提高。在人类中,可检测到BAT的人心脏代谢疾病的患病率显着降低6。因此,BAT对肥胖相关的代谢后遗症具有极好的治疗潜力7,8,9。
为了研究BAT发育和功能的生理学和病理生理学,并阐明这些过程中涉及的分子机制,BAT特异性转基因小鼠模型是选择的方法10。Cre-LoxP重组系统是通过编辑小鼠基因组来产生条件敲除小鼠的最常用手段。该系统能够以组织/细胞特异性方式修饰(过表达或敲除)感兴趣的基因11。它还可用于通过表达选择性荧光报告基因来标记特定细胞类型。
最近,通过结合CRISPR-Cas9技术和腺相关病毒(AAV)单向导RNA(sgRNA)系统12,进一步发展了Cre-LoxP系统方法。CRISPR-Cas9系统是一种特异性且高效的基因编辑工具,用于修饰,调节或靶向基因组的精确区域13。基于CRISPR-Cas9的基因组编辑允许对基因组位点进行快速遗传操作,因为它不需要与基因靶向载体进行同源重组。结合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和AAV-sgRNA技术使研究人员能够通过研究目标基因在组织/细胞中所需时间的作用来更精确地了解基因功能。此外,如果使用诱导的Cre系,这些组合技术减少了产生转基因小鼠所需的时间和精力,并允许对CRISPR-Cas9活性进行时间控制,以便在小鼠中进行诱导基因组编辑14。
AAV载体是安全有效的体内基因递送系统。然而,靶向脂肪组织的AAV落后于其他组织的应用,例如大脑,心脏,肝脏和肌肉15。由于天然血清型载体的转导效率和嗜性相对较低,AAV引导的基因递送到脂肪组织仍然具有挑战性15。在过去的5年中,我们和其他人已经成功地建立了有效的微创方法,将AAV引导的基因递送到脂肪组织中,并创建了小鼠模型,使我们能够了解参与调节BAT功能的基因16,17,18,19。例如,通过使用AAV8将编码12-脂氧合酶(12-LOX)的靶向Alox12的sgRNA递送到Ucp1-Cre / Cas9小鼠的BAT中,我们发现活化的BAT产生12-LOX代谢物,即12-羟基二十碳五烯酸(12-HEPE)和13R,14S-二羟基二十二碳六烯酸(maresin 2),分别调节葡萄糖代谢和解决肥胖相关炎症16,17.在这里,我们提供了关于技术程序的分步方案,特别是将AAV-sgRNA直接显微注射到BAT叶中的手术,以使用组合的Cre-LoxP,CRISPR-Cas9和AAV-sgRNA系统产生BAT特异性敲除小鼠。
所有动物实验和护理程序都得到了乔斯林糖尿病中心机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 筛选培养细胞中的有效sgRNA
注意:为了使测定具有成本效益,在将sgRNA包装成AAV颗粒之前,我们建议通过基于慢病毒的系统 在 培养细胞中测试不同的sgRNA,用于Cas9 / sgRNA表达(图1),并选择为 体内 实验提供最高敲低效率的sgRNA。
2. AAV-sgRNA质粒的构建
注意:在此步骤中,从上述筛选中鉴定的有效sgRNA被克隆到pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP载体28 中(图2)。同时,不识别小鼠基因组中任何序列的非靶向sgRNA(例如TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29)也被克隆到同一载体中以作为非编辑对照。
3. AAV包装
4. Ucp1 Cre/Cas9小鼠的制备
5.小鼠AAV注射到BAT中的手术
在上述程序中,AAV-sgRNA精确递送到BAT对于协议的成功至关重要。为了最大限度地提高AAV-sgRNA的效果并最大限度地减少手术过程中的组织损伤,了解BAT的三维(3D)解剖位置至关重要。如图3E所示,在不暴露组织的情况下很难确定BAT的精确位置。然而,过量的BAT暴露可能会损害组织(图3H,I);因此,应执行该程序以在有限的解剖空间内注射AAV...
现有已发表的AAV介导的基因递送至肩胛间BAT的方法不包含详细的图片和视频,描述将AAV直接注射到BAT中的手术技术和方法。在大多数已发表的方法33,34中,AAV被注射到肩胛间BAT周围的脂肪组织中,而不是BAT本身。因此,该协议中有几个关键步骤决定了研究的成功。这些包括sgRNA的设计,AAV包装和浓度,BAT特异性Cas9小鼠的产生以及外科手术。完成体内...
作者没有什么可透露的。
这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH)拨款R01DK122808,R01DK102898和R01DK132469(给Y.-H.T.)以及P30DK036836(给乔斯林糖尿病中心的糖尿病研究中心)的部分支持。T.T.得到了SUNSTAR研究奖学金(日本Sunstar基金会Hiroo Kaneda奖学金)和美国心脏协会赠款903968的支持。Y. Z.得到了Charles A. King Trust Fellowship的支持。我们感谢Sean D. Kodani友好地校对手稿。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
Recombinant DNA | |||
lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
Experimental Models: Cell Lines | |||
HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
Experimental Models: Organisms/Strains | |||
Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
Others | |||
Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
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