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요약

이 프로토콜에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 활용하여 갈색 지방 조직(BAT) 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 기술 절차를 설명합니다. 설명된 단계에는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비 및 BAT 로브에 AAV의 미세 주입이 포함됩니다.

초록

갈색 지방 조직(BAT)은 생리 활성 분자의 분비를 통해 내분비 기관 역할도 할 수 있는 에너지 소산에 특화된 지방 저장소입니다. BAT 특이적 녹아웃 마우스의 생성은 BAT 매개 에너지 조절에 대한 관심 유전자의 기여를 이해하기 위한 가장 인기 있는 접근 방식 중 하나입니다. Cre-LoxP 시스템을 활용한 기존의 유전자 표적화 전략은 조직 특이적 녹아웃 마우스를 생성하는 주요 접근 방식이었습니다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고 지루합니다. 여기에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템을 사용하여 BAT에서 관심 유전자를 빠르고 효율적으로 녹아웃하기 위한 프로토콜을 설명합니다. interscapular BAT는 근육 사이의 깊은 층에 위치합니다. 따라서 AAV를 시야 내에서 BAT에 정확하고 직접 주입하기 위해서는 BAT가 노출되어야 합니다. 적절한 외과적 치료는 BAT에 연결되는 Sultzer의 정맥과 같은 교감 신경 및 혈관의 손상을 방지하는 데 중요합니다. 조직 손상을 최소화하기 위해서는 BAT의 3차원 해부학적 위치와 기술 단계에서 요구되는 수술 기술을 이해하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 관심 유전자를 표적으로 하는 sgRNA의 설계, AAV-sgRNA 입자의 준비, BAT에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하는 데 광범위하게 적용될 수 있는 BAT 특이적 녹아웃 마우스를 생성하기 위해 두 BAT 로브에 AAV를 직접 미세주입하는 수술을 포함한 주요 기술 절차를 강조합니다.

서문

비만은 전 세계적으로 상당한 속도로 증가하고 있으며, 이는 광범위한 대사 질환으로 이어진다 1,2,3. 지방 조직은 이러한 병리의 핵심입니다. 존재하는 두 가지 기능적으로 구별되는 유형의 지방 조직은 과도한 칼로리를 저장하는 백색 지방 조직(WAT)과 열 생성을 위해 에너지를 발산하는 갈색 지방 조직(BAT) 및 관련 베이지색/브라이트 지방입니다. BAT는 에너지 소산 기능으로 인정 받았지만 원위 기관의 신진 대사를 조절하는 생리 활성 분자의 생산을 통한 내분비 기능도 가지고 있습니다 4,5. 설치류에 대한 수많은 연구에서 갈색 또는 베이지색 지방의 양이나 활성을 증가시키면 에너지 소비가 증가하고 인슐린 감수성이 향상된다는 사실이 입증되었습니다. 인간의 경우, BAT가 검출되는 사람은 심혈관 질환의 유병률이 현저히 낮다6. 따라서, BAT는 비만 관련 대사 후유증에 대한 우수한 치료 가능성을 보유한다 7,8,9.

BAT 발달 및 기능의 생리학 및 병태생리학을 조사하고 이러한 과정에 관여하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 BAT 특이적 형질전환 마우스 모델을 선택하는 방법10. Cre-LoxP 재조합 시스템은 마우스 게놈을 편집하여 조건부 녹아웃 마우스를 생산하는 데 가장 일반적으로 사용되는 수단입니다. 이 시스템은 조직/세포 특이적 방식으로 관심 유전자의 변형(과발현 또는 녹아웃)을 가능하게 했다11. 또한 선택적 형광 리포터 유전자를 발현하여 특정 세포 유형을 표지하는 데 사용할 수 있습니다.

최근에, Cre-LoxP 시스템 접근법은 CRISPR-Cas9 기술과 아데노 관련 바이러스(AAV) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 시스템(12)을 결합하여 더욱 발전되었다. CRISPR-Cas9 시스템은 게놈13의 정확한 영역을 수정, 조절 또는 표적화하기 위한 구체적이고 효율적인 유전자 편집 도구입니다. CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집은 유전자 표적 벡터와 상동 재조합이 필요하지 않기 때문에 게놈 유전자좌의 신속한 유전자 조작이 가능합니다. Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 AAV-sgRNA 기술을 결합하면 조직/세포에서 원하는 시간에 관심 유전자의 역할을 조사할 수 있으므로 연구자가 유전자 기능을 보다 정확하게 이해할 수 있습니다. 또한, 이러한 결합된 기술은 형질전환 마우스를 생성하는 데 필요한 시간과 노력을 줄이고 유도성 Cre 라인을 사용하는 경우 마우스에서 유도성 게놈 편집을 위한 CRISPR-Cas9 활성의 시간적 제어를 허용합니다14.

AAV 벡터는 안전하고 효과적인 생체 내 유전자 전달 시스템입니다. 그러나 지방 조직을 표적으로 하는 AAV는 뇌, 심장, 간, 근육과 같은 다른 조직에서의 응용에 뒤쳐져 있다15. 상대적으로 낮은 형질도입 효율과 자연적으로 발생하는 혈청형 벡터의 친화성으로 인해 지방 조직으로의 AAV 유도 유전자 전달은 여전히 어려운과제입니다 15. 지난 5년 동안 우리와 다른 사람들은 AAV 유도 유전자를 지방 조직으로 전달하는 효과적이고 최소 침습적인 방법을 성공적으로 확립했으며 BAT 기능 조절에 관여하는 유전자를 이해할 수 있는 마우스 모델을 만들었습니다16,17,18,19. 예를 들어, AAV8을 사용하여 12-리폭시게나제(12-LOX)를 암호화하는 Alox12를 표적으로 하는 sgRNA를 Ucp1-Cre/Cas9 마우스의 BAT에 전달함으로써, 활성화된 BAT가 12-LOX 대사산물, 즉 12-하이드록시-에이코사펜타엔산(12-HEPE) 및 13R, 14S-디하이드록시도코사헥사엔산(maresin 2)을 생성하여 각각 포도당 대사를 조절하고 비만 관련 염증을 해결한다는 것을 발견했습니다16, 17. 여기에서는 결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 AAV-sgRNA 시스템을 사용하여 BAT 특이적 녹아웃 마우스를 생성하기 위한 기술 절차, 특히 BAT 로브에 AAV-sgRNA를 직접 미세주입하는 수술에 대한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

모든 동물 실험 및 관리 절차는 Joslin Diabetes Center의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 배양된 세포에서 효과적인 sgRNA 스크리닝

참고: 비용 효율적인 분석을 위해 sgRNA를 AAV 입자로 패키징하기 전에 Cas9/sgRNA 발현을 위해 렌티바이러스 기반 시스템을 통해 배양된 세포에서 다양한 sgRNA를 테스트하고(그림 1) 생체 내 실험에서 가장 높은 녹다운 효율을 제공하는 sgRNA를 선택하는 것이 좋습니다.

  1. CRISPR-Cas9 sgRNA 디자인
    1. Broad sgRNA 설계 도구(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)20,21, CRISPOR 온라인 도구(http://crispor.tefor.net/)22 및 기타 사용 가능한 도구와 같은 온라인 도구를 사용하여 sgRNA를 설계합니다.
    2. 유전자 이름 상자에 유전자 이름 또는 DNA 표적 염기서열을 입력하고, 잠재적인 sgRNA 염기서열을 생성하기 위한 SpCas9의 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)로 NGG 를 선택합니다.
    3. 높은 예측 on-target 효율과 낮은 off-target 활성을 가진 sgRNA를 선택합니다. 예를 들어, CRISPOR 출력에서 특이도 점수가 50 이상인 sgRNA를 사용하는 것이 좋습니다. 필터를 통과하는 특정 sgRNA 중에서 효율 점수가 높은 sgRNA를 선택하십시오23.
      참고: 일반적으로 효과적인 sgRNA의 식별을 보장하기 위해 3개 또는 4개의 sgRNA를 선택합니다.
  2. CRISPR-Cas9 sgRNA 플라스미드 구축
    1. DNA 합성 플랫폼을 통해 BsmBI 제한 부위(표 1)에서 돌출부(5' 및 3' 모두)가 있는 20개의 뉴클레오티드(nt) 표적 서열을 암호화하는 sgRNA 올리고 쌍을 합성합니다.
    2. Ligate 어닐링된 올리고는 BsmBI-선형화된 lentiCRISPR v2 벡터와 쌍을 이룹니다.
    3. 결찰 산물을 Stbl3 E. coli 균주로 형질전환하고 U6 정방향 프라이머를 사용하여 Sanger DNA 시퀀싱으로 sgRNA 삽입을 확인합니다.
      참고: LentiCRISPRv2 및 lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 및 single guide RNA24라는 Addgene의 프로토콜에서 자세한 클로닝 절차를 참조하십시오.
  3. 렌티바이러스 입자 생성
    1. 형질감염 약 24시간 전, 6cm 조직 배양 플레이트에서 4mL의 완전한 성장 배지에 7 x 105 HEK-293 세포를 플레이트합니다.
    2. 15μL의 LT1 형질주입 시약을 250μL의 무혈청 배지에 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 표 2에 따라 각 sgRNA에 대한 형질주입 칵테일을 250 μL의 무혈청 배지에서 준비한다. 단계 1.3.2에서 제조된 형질주입 시약을 플라스미드 칵테일과 혼합하고, 실온에서 20-30분 동안 인큐베이션한다.
    4. 완전한 성장 배지를 HEK-293 세포용 3.5mL의 신선한 성장 배지로 교체한 다음 3.5mL의 신선한 성장 배지에서 배양된 HEK-293 세포에 DNA 형질주입 시약 혼합물을 적가합니다.
    5. 형질감염 12-15시간 후, 배지를 교체하여 형질주입 시약을 제거하고, 이를 4mL의 신선한 성장 배지로 교체한다.
    6. 24시간 배양 후 렌티바이러스 입자가 포함된 세포 배양 배지를 수집하고 0.45μm 필터를 통해 배지를 여과하여 HEK-293 세포를 제거합니다. 바이러스는 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다. 장기 보관을 위해서는 바이러스를 -80 °C에서 냉동해야 합니다.
      알림: 렌티바이러스 입자를 준비할 때 생물 안전 지침을 따르고 렌티바이러스 취급에 적합한 환경(예: BL2+)에서 작업하십시오. 자세한 렌티바이러스 준비 절차는 Addgene의 프로토콜인 pLKO.1 - TRC Cloning Vector(https://www.addgene.org/protocols/plko/#G)를 참조하십시오.
  4. 갈색 지방전구세포의 감염 및 sgRNA 매개 녹다운 결정
    1. 플레이트 1 x 10 6 마우스는6 -웰 플레이트에서 웰당 8 μg/mL 폴리브렌을 함유하는 신선한 배지 1 mL에 불멸화된 갈색 지방전구세포를 넣었다.
      참고: 이 연구에서는 SV40 T 항원25를 사용하여 불멸화된 갈색 지방전구세포를 생성했습니다. 갈색 지방전구세포는 10% FBS를 갖는 고혈당 DMEM에서 배양됩니다.
    2. 1.3단계의 렌티바이러스 입자 용액 1mL를 추가하여 세포를 감염시킵니다. 항생제 선택 대조군으로서 기능하기 위해 병렬로 하나의 감염되지 않은 세포 웰을 유지한다.
    3. 감염 후 24시간 후에 새로운 배지로 교체하십시오. 해당 항생제(예: 최종 농도가 1μg/mL인 퓨로마이신)를 배지에 추가하여 감염되지 않은 세포를 죽이고 감염된 세포를 선택합니다. 감염되지 않은 모든 대조군 세포가 죽을 때까지 격일로 선택된 항생제가 포함된 새로운 배지로 교체하십시오.
    4. 바이러스에 감염된 세포에서 단백질을 수집하고, 웨스턴 블롯 분석을 통해 sgRNAs의 녹다운 효율을 측정한다. Eslami 및 Lujan26의 자세한 웨스턴 블로팅 절차를 따르십시오. 단백질 간의 회전율이 다양하기 때문에 여러 시점(예: 바이러스 감염 후 6일차부터 12일차까지)을 테스트하여 단백질 신호 손실을 관찰합니다.
      참고: 관심 유전자에 의해 암호화된 단백질을 인식하는 항체를 사용할 수 없는 경우, Sanger 염기서열 분석을 통해 각 sgRNA의 게놈 편집 효율을 측정할 수 있습니다. 간단히 말해서, sgRNA 표적 영역 측면에 있는 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 증폭하여 ~700bp 길이의 PCR 앰플리콘을 생성합니다. 예상 파단 부위는 바람직하게는 시퀀싱 시작 부위로부터 ~200bp 하류에 있어야 합니다. 그런 다음 PCR 산물을 Sanger 시퀀싱에 적용합니다. TIDE(Tracking of Indels by DEcomposition)와 같은 온라인 도구를 사용하여 시퀀싱 결과를 분석하여 세포 풀에서 각 sgRNA에 의해 생성된 작은 indel의 빈도를 결정합니다27.

2. AAV-sgRNA 플라스미드의 구성

참고: 이 단계에서는 위의 화면에서 확인된 유효 sgRNA를 pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP 벡터28 에 클로닝합니다(그림 2). 한편, 마우스 게놈에서 어떠한 서열도 인식하지 못하는 비표적 sgRNA(예: TCTGATAGCGTAGGAGTGAT29)도 동일한 벡터에 클로닝되어 편집되지 않은 대조군의 역할을 합니다.

  1. 합성된 sgRNA 올리고와 동일한 오버행을 생성하는 BbsI를 사용하여 pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP 백본을 선형화합니다.
  2. 어닐링된 올리고 쌍을 선형화된 pAAV 벡터로 라이게이트하고, 단계 1.2에 설명된 대로 sgRNA 삽입을 확인합니다.
    참고: lentiCRISPRv2-sgRNA에 대한 클로닝 절차는 AAV-sgRNA 플라스미드 구성에도 적용됩니다.

3. AAV 포장

  1. 섹션 2에서 생성된 AAV 벡터를 AAV 혈청형 8로 패키징합니다. 이전 프로토콜30에 따라 고역가 AAV를 준비하거나 바이러스 코어 또는 상용 서비스에서 AAV 패키징 서비스를 요청하십시오. 바이러스 역가를 1 x 1013 게놈 사본/mL로 희석합니다.
    참고: sgRNA를 발현하는 변형된 AAV2 게놈은 AAV 혈청형 8로 패키징됩니다. 이 혈청형은 지방 조직18,31에 대한 높은 효율 때문에 선택되었습니다. 세포 파편 및 소량의 배지 성분과 같은 오염 물질에 의해 유도되는 면역 반응을 방지하기 위해 생체 내 주입을 위해 초정제 AAV가 필요합니다. 초-정제는 요오드딕사놀 구배 및 초원심분리에 의해 달성될 수 있다30.

4. Ucp1 Cre/Cas9 마우스의 제조

  1. Ucp1 프로모터의 제어 하에 Cre 재조합효소를 발현하는 Ucp1-Cre 마우스 균주( 재료 표 참조)를 구입하십시오. Cas9의 발현이 Cre 재조합효소 의존적 방식으로 조절되는 동형접합체 Rosa26-floxed STOP-Cas9 knock-in 마우스32 ( 재료 표 참조)를 구입하십시오.
  2. 앞서 설명한 바와 같이 이러한 균주를 교배하여 Ucp1-Cre/Cas9 마우스를 생성합니다(16,17). 모든 마우스를 온도 및 습도가 조절되는 방(23°C, 30% 습도)에 12시간 명암 주기(오전 6시 30분에 켜짐, 오후 6시 30분에 꺼짐)에 보관하고 차우 식단과 물을 무료로 이용할 수 있습니다.
  3. 생성된 Ucp1-Cre/Cas9 마우스를 아래에 설명된 방법을 통해 관심 유전자를 표적으로 하는 대조군 sgRNA 또는 sgRNA를 운반하는 AAV로 처리합니다. 이 연구에서는 체중이 약 30g인 12-15주령의 수컷 Ucp1-Cre/Cas9 마우스를 사용했습니다.

5. 생쥐의 BAT에 AAV 주사 수술

  1. 유도 및 유지를 위해 2.5% 이소플루란을 지속적으로 흡입하여 마우스를 마취합니다.
  2. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 윤활유를 바릅니다. 그런 다음 진통제(바나민, 2.5mg/kg 체중[BW], 피하 주사, 재료 표 참조)를 생쥐에게 투여하여 수술 후 통증과 고통을 최소화하고 예방합니다.
  3. 면도기를 사용하여 견갑간 부위의 마우스 털을 면도하고 요오드 기반 또는 클로르헥시딘 기반 스크럽을 최소 3회 번갈아 가며 수술 부위를 소독한 다음 70% 에탄올을 사용합니다. 그런 다음 절개 부위 주위에 멸균 수술용 드레이프를 적용합니다.
  4. 메스를 사용하여 견갑골 사이의 피부를 절개한 다음(그림 3A-B), 면도한 피부를 벗겨내어 수술용 가위를 사용하여 목의 지방 조직을 노출시킵니다(그림 3C-D). 절개 부위의 크기는 신체 크기에 따라 다르지만 일반적으로 절개 부위는 견갑간 부위의 지방 조직을 노출시키기 위해 약 2cm가 되어야 합니다.
  5. 단일 절개를 이용하여 지방조직과 근육의 원위부 사이의 경계에 있는 지방조직을 절단한다(도 3E-F). 절개 부위의 크기는 지방 조직의 무딘 박리를 위해 수술 용 가위를 삽입하기 위해 입구를 여는 데 약 1cm 여야합니다.
  6. 주로 사용하는 손을 사용하여 수술용 가위로 지방 조직을 수직으로 뭉툭하게 떼어내어 BAT를 노출시키고 BAT를 제외한 지방 조직을 비주로 꼬집습니다(그림 3G). Sultzer의 정맥을 랜드마크로 사용하여 정확한 BAT 위치를 나타냅니다.
    참고: 그림 3H의 BAT는 사진 시연을 위해 완전히 노출되었습니다. 과도한 절개는 주변 BAT의 신경에 손상을 줄 수 있습니다. 가위의 잘못된 방향은 주변 근육과 BAT를 배출하는 Sultzer의 정맥을 손상시키고 과도한 출혈을 유발할 수 있습니다.
  7. 각 마우스에 대해 해밀턴 주사기(100 μL, 재료 표 참조)에 연결된 날카로운 바늘(32G, 재료 표 참조)을 사용하여 두 BAT 로브(BAT 1개 로브당 20μL)에 AAV 40μL를 천천히 주입합니다. 그림 3I). AAV 투여 중 주입 부위에서 누출이 없는 것으로 표시된 대로 성공적인 주입을 확인하십시오.
    참고: 그림 3I의 BAT는 사진 시연을 위해 완전히 노출되었습니다. BAT 로브에 투여되는 AAV 용액의 부피는 수용자 마우스의 BAT의 크기에 의해 결정됩니다. 우리는 20μL의 AAV 용액이 무게가 0.05g인 일반 C57BL6/J 마우스에서 약 30g 무게의 BAT 로브 하나에 적합하다고 결정했습니다. 필요한 경우 원하는 부피를 얻기 위해 바이러스 용액을 농축해야 할 수도 있습니다.
  8. 주입된 BAT 또는 주변 조직에서 출혈이 없는지 확인합니다. 과산화수소 용액 ( 재료 표 참조)에 적신 거즈를 출혈 부위에 눌러 지혈합니다.
  9. 노출된 지방 조직을 정상 위치로 되돌립니다. 5-0 흡수성 모노필라멘트 실을 사용하여 지방 조직과 근육의 가장자리를 꿰매십시오(그림 3J). 5-0 코팅된 비크릴 염색되지 않은 꼰 실로 열린 피부를 봉합합니다(그림 3K-L).
    참고: 그림 4 는 벗겨진 지방 조직과 근육을 꿰매는 단계를 설명합니다.
  10. 완전히 회복 될 때까지 수술 후 동물을 가열 패드에 유지하십시오. 동물들에게 음식, 물, 둥지를 틀 수 있는 충분한 침구를 제공하십시오. 실험 시작 전 회복 7일 동안 고통이나 질병의 징후가 있는지 정기적으로 모니터링하십시오.
  11. Sugimoto et al.16에서와 같이 마우스에서 해부된 BAT에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 표적 유전자 결실의 효율을 확인하였다.

결과

위의 절차 전반에 걸쳐 AAV-sgRNA를 BAT에 정확하게 전달하는 것이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. AAV-sgRNA의 효과를 극대화하고 수술 중 조직 손상을 최소화하기 위해서는 BAT의 3차원(3D) 해부학적 위치를 이해하는 것이 필수적입니다. 도 3E에 나타난 바와 같이, 조직을 노출시키지 않고는 BAT의 정확한 위치를 식별하기 어렵다. 그러나 과도한 BAT 노출은 조직을 손상시킬 수 ?...

토론

견갑간 BAT에 대한 AAV 매개 유전자 전달을 위해 기존에 발표된 방법에는 BAT에 AAV를 직접 주입하기 위한 수술 기술과 접근 방식을 설명하는 자세한 사진과 비디오가 포함되어 있지 않습니다. 공개된 대부분의 방법(33,34)에서, AAV는 BAT 자체 대신에 견갑간 BAT를 둘러싼 지방 조직에 주입된다. 따라서 이 프로토콜에는 연구의 성공을 결정하는 몇 가지 주요 단...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 미국 국립 보건원 (NIH) 보조금 R01DK122808, R01DK102898 및 R01DK132469 (Y.-HT에)와 P30DK036836 (Joslin Diabetes Center의 당뇨병 연구 센터에)에 의해 부분적으로 지원되었습니다. T.T.는 SUNSTAR Research Fellowship (Hiroo Kaneda Scholarship, Sunstar Foundation, Japan)과 미국 심장 협회 (American Heart Association) 보조금 903968의 지원을 받았습니다. Y. Z.는 Charles A. King Trust Fellowship의 지원을 받았습니다. 원고를 친절하게 교정해 주신 Sean D. Kodani에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
OPTI-MEM serum-free mediumInvitrogen31985
Polybrene Infection / Transfection ReagentSigmaTR-1003-G
TransIT-LT1 Transfection ReagentMirusMIR 2300
Recombinant DNA
lentiCRISPR v2 vector Addgene52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFPAddgene89060
pMD2.G envelope plasmidAddgene12259
psPAX2 packaging plasmidAddgene12260
Experimental Models: Cell Lines
HEK-293 cellsATCCCRL-1573
WT-1 cellsDeveloped in Tseng labPMID: 14966273
Experimental Models: Organisms/Strains
Cas9 knockin miceJackson Laboratories24857
Ucp1-CRE miceJackson Laboratories24670
Others
BanaminePatterson07-859-1323
Hamilton syringeHamiltonModel 710 RN Syringe
Hydrogen peroxide solutionFisher ScientificH325-500
NeedleHamilton32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/BxHenry Schein1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/BxHenry Schein1294522

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