Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems

Tadataka Tsuji; Yang Zhang; Yu-Hua Tseng

doi:10.3791/65083

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

Method Article

Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems

DOI:

10.3791/65083

⸱

March 24th, 2023

Tadataka Tsuji¹, Yang Zhang¹, Yu-Hua Tseng¹

¹Section on Integrative Physiology and Metabolism, Research Division, Joslin Diabetes Center, Harvard Medical School

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir die technischen Verfahren zur Erzeugung von braunem Fettgewebe (BAT)-spezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV) Single-Guide RNA (sgRNA)-Systems. Die beschriebenen Schritte umfassen das Design der sgRNAs, die Herstellung der AAV-sgRNA-Partikel und die Mikroinjektion von AAV in die BAT-Lappen.

Zusammenfassung

Braunes Fettgewebe (BAT) ist ein auf Energiedissipation spezialisiertes Fettdepot, das über die Sekretion bioaktiver Moleküle auch als endokrines Organ dienen kann. Die Züchtung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen ist einer der populärsten Ansätze, um den Beitrag eines Gens von Interesse zur BVT-vermittelten Energieregulation zu verstehen. Die konventionelle Gen-Targeting-Strategie unter Verwendung des Cre-LoxP-Systems war der Hauptansatz, um gewebespezifische Knockout-Mäuse zu erzeugen. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändig und mühsam. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für den schnellen und effizienten Knockout eines Gens, das für BAT von Interesse ist, unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Single-Guide-RNA (sgRNA)-Systems. Die BAT interscapularis befindet sich in der tiefen Schicht zwischen den Muskeln. Daher muss die BVT freigelegt werden, um die AAV präzise und direkt in die BVT innerhalb des Gesichtsfeldes zu injizieren. Eine angemessene chirurgische Behandlung ist entscheidend, um Schäden an den sympathischen Nerven und Gefäßen zu vermeiden, wie z. B. der Sultzer-Vene, die mit dem BAT verbunden ist. Um Gewebeschäden zu minimieren, ist es von entscheidender Bedeutung, die dreidimensionale anatomische Lage des BVT und die chirurgischen Fähigkeiten, die in den technischen Schritten erforderlich sind, zu verstehen. Dieses Protokoll hebt die wichtigsten technischen Verfahren hervor, einschließlich des Designs von sgRNAs, die auf das interessierende Gen abzielen, der Herstellung von AAV-sgRNA-Partikeln und der Operation für die direkte Mikroinjektion von AAV in beide BAT-Lappen zur Erzeugung von BVT-spezifischen Knockout-Mäusen, die breit angewendet werden können, um die biologischen Funktionen von Genen in BAT zu untersuchen.

Einleitung

Adipositas nimmt weltweit deutlich zu und führt zu einem breiten Spektrum von Stoffwechselerkrankungen ^1,2,3. Das Fettgewebe ist der Schlüssel zu diesen Pathologien. Die beiden funktionell unterschiedlichen Arten von Fettgewebe, die es gibt, sind weißes Fettgewebe (WAT), das überschüssige Kalorien speichert, und braunes Fettgewebe (BAT) und das damit verbundene beige/britische Fett, das Energie für die Thermogenese abführt. Während BAT für seine energieableitende Funktion anerkannt ist, hat es auch endokrine Funktionen durch die Produktion bioaktiver Moleküle, die de....