Generazione di topi knockout specifici per il grasso bruno utilizzando un sistema combinato di RNA a guida singola Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato

Riepilogo

In questo protocollo, descriviamo le procedure tecniche per generare topi knockout specifici per il tessuto adiposo bruno (BAT) sfruttando un sistema combinato di Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA a guida singola (sgRNA) del virus adeno-associato (AAV). I passaggi descritti includono la progettazione degli sgRNA, la preparazione delle particelle AAV-sgRNA e la microiniezione di AAV nei lobi BAT.

Abstract

Il tessuto adiposo bruno (BAT) è un deposito adiposo specializzato nella dissipazione di energia che può anche servire come organo endocrino attraverso la secrezione di molecole bioattive. La creazione di topi knockout specifici per BAT è uno degli approcci più popolari per comprendere il contributo di un gene di interesse alla regolazione dell'energia mediata da BAT. La strategia convenzionale di targeting genico che utilizza il sistema Cre-LoxP è stato l'approccio principale per generare topi knockout tessuto-specifici. Tuttavia, questo approccio richiede tempo e noia. Qui, descriviamo un protocollo per il knockout rapido ed efficiente di un gene di interesse in BAT utilizzando un sistema combinato Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e virus adeno-associato (AAV) a guida singola (sgRNA). Il BAT interscapolare si trova nello strato profondo tra i muscoli. Pertanto, il BAT deve essere esposto per iniettare l'AAV in modo preciso e diretto nel BAT all'interno del campo visivo. Una corretta manipolazione chirurgica è fondamentale per prevenire danni ai nervi e ai vasi simpatici, come la vena di Sultzer che si collega al BAT. Per ridurre al minimo il danno tissutale, vi è una necessità critica di comprendere la posizione anatomica tridimensionale del BAT e le competenze chirurgiche richieste nelle fasi tecniche. Questo protocollo evidenzia le procedure tecniche chiave, tra cui la progettazione di sgRNA mirati al gene di interesse, la preparazione di particelle AAV-sgRNA e l'intervento chirurgico per la microiniezione diretta di AAV in entrambi i lobi BAT per generare topi knockout specifici per BAT, che possono essere ampiamente applicati per studiare le funzioni biologiche dei geni nelle BAT.

Introduzione

L'obesità sta aumentando a un ritmo significativo in tutto il mondo, portando a un ampio spettro di malattie metaboliche ^1,2,3. Il tessuto adiposo è fondamentale per queste patologie. I due tipi funzionalmente distinti di tessuto adiposo che esistono sono il tessuto adiposo bianco (WAT), che immagazzina calorie in eccesso, e il tessuto adiposo bruno (BAT) e il relativo grasso beige / brite, che dissipa energia per la termogenesi. Mentre il BAT è stato riconosciuto per la sua funzione di dissipazione dell'energia, ha anche funzioni endocrine attraverso la produzione di molecole bioattive che regolano il metabolismo negli organi distali ^4,5. Numerosi studi sui roditori hanno dimostrato che aumentare la quantità o l'attività del grasso bruno o beige porta ad un aumento del dispendio energetico e una migliore sensibilità all'insulina. Nell'uomo, le persone con BAT rilevabile hanno una prevalenza significativamente inferiore di malattie cardiometaboliche⁶. Pertanto, la BAT ha un eccellente potenziale terapeutico per le sequele metaboliche correlate all'obesità ^7,8,9.

Per studiare la fisiologia e la fisiopatologia dello sviluppo e della funzione delle BAT e per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti in questi processi, il modello murino transgenico specifico per BAT è un metodo di scelta¹⁰. Il sistema di ricombinazione Cre-LoxP è il mezzo più comunemente usato per produrre topi knockout condizionali modificando il genoma del topo. Questo sistema ha permesso la modifica (sovraespressione o knockout) di geni di interesse in modo tessuto/cellula-specifico¹¹. Può anche essere utilizzato per marcare un tipo di cellula specifico esprimendo un gene reporter fluorescente selettivo.

Recentemente, l'approccio sistemico Cre-LoxP è stato ulteriormente sviluppato combinando la tecnologia CRISPR-Cas9 e il sistema di RNA a guida singola (sgRNA) del virus adeno-associato (AAV)¹². Il sistema CRISPR-Cas9 è uno strumento di modifica genetica specifico ed efficiente per modificare, regolare o indirizzare regioni precise del genoma¹³. L'editing del genoma basato su CRISPR-Cas9 consente una rapida manipolazione genetica dei loci genomici perché non richiede una ricombinazione omologa con un vettore di targeting genico. Le tecniche combinate Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA consentono ai ricercatori di comprendere le funzioni geniche in modo più preciso consentendo lo studio del ruolo dei geni di interesse nei momenti desiderati nei tessuti / cellule. Inoltre, queste tecniche combinate riducono il tempo e lo sforzo necessari per generare topi transgenici e consentono il controllo temporale dell'attività di CRISPR-Cas9 per l'editing del genoma inducibile nei topi se viene utilizzata una linea Cre inducibile¹⁴.

I vettori AAV sono sistemi di veicolazione genica in vivo sicuri ed efficaci. Tuttavia, gli AAV che prendono di mira il tessuto adiposo sono rimasti indietro rispetto alle applicazioni in altri tessuti, come cervello, cuore, fegato e muscolo¹⁵. A causa dell'efficienza di trasduzione relativamente bassa e del tropismo con vettori di sierotipo presenti in natura, la consegna genica guidata da AAV al tessuto adiposo è ancora impegnativa¹⁵. Negli ultimi 5 anni, noi e altri abbiamo stabilito con successo modi efficaci e minimamente invasivi per fornire geni guidati da AAV nel tessuto adiposo e creato modelli murini che ci permettono di acquisire una comprensione dei geni coinvolti nella regolazione della funzione BAT^16,17,18,19. Ad esempio, utilizzando AAV8 per veicolare sgRNA targeting Alox12, che codifica per la 12-lipossigenasi (12-LOX), nel BAT dei topi Ucp1-Cre/Cas9, abbiamo scoperto che il BAT attivato produce 12-LOX metaboliti, vale a dire acido 12-idrossi-eicosapentaenoico (12-HEPE) e acido 13R, 14S-diidrossi docosaesaenoico (maresina 2), per regolare il metabolismo del glucosio e risolvere l'infiammazione associata all'obesità, rispettivamente^{16, 17}. Qui, forniamo un protocollo passo-passo sulle procedure tecniche, in particolare la chirurgia per la microiniezione diretta di AAV-sgRNA nei lobi BAT, per generare topi knockout specifici per BAT utilizzando il sistema combinato Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali e le procedure di cura sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Joslin Diabetes Center.

1. Screening di sgRNA efficaci in cellule in coltura

NOTA: Per rendere il test economicamente vantaggioso, prima di confezionare gli sgRNA in particelle AAV, si consiglia di testare diversi sgRNA in cellule coltivate tramite un sistema basato su lentivirus per l'espressione di Cas9/sgRNA (Figura 1) e selezionare gli sgRNA che danno la massima efficienza di knockdown per esperimenti in vivo .

1. Design sgRNA CRISPR-Cas9
   1. Progetta sgRNA utilizzando strumenti online, come lo strumento di progettazione Broad sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)^20,21, lo strumento online CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)²² e altri strumenti disponibili.
   2. Immettere i nomi dei geni o le sequenze target del DNA nella casella del nome del gene e selezionare NGG come motivo adiacente al protospaziatore (PAM) per SpCas9 per generare potenziali sequenze di sgRNA.
   3. Seleziona gli sgRNA con un'elevata efficienza prevista sul bersaglio e una bassa attività off-target. Ad esempio, si raccomandano per l'uso sgRNA con un punteggio di specificità di almeno 50 sull'output di CRISPOR. Tra gli sgRNA specifici che passano il filtro, scegli quelli con punteggi ad alta efficienza²³.
      NOTA: In generale, vengono selezionati tre o quattro sgRNA per garantire l'identificazione di sgRNA efficaci.
2. Costruzione del plasmide sgRNA CRISPR-Cas9
   1. Sintetizzare coppie di oligo sgRNA codificanti 20 sequenze mirate a nucleotidi (nt) con sporgenze (sia 5' che 3') dal sito di restrizione BsmBI (Tabella 1) attraverso una piattaforma di sintesi del DNA.
   2. Ligate ricotto oligo coppie con vettore lentiCRISPR v2 linearizzato BsmBI.
   3. Trasformare il prodotto di legatura nel ceppo Stbl3 E. coli e confermare le inserzioni di sgRNA mediante sequenziamento del DNA Sanger utilizzando il primer U6 in avanti.
      NOTA: Vedere la procedura di clonazione dettagliata nel protocollo di Addgene intitolato LentiCRISPRv2 e lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR / Cas9 e RNA guida singola²⁴.
3. Produzione di particelle lentivirali
   1. Circa 24 ore prima della trasfezione, piastra 7 x 10⁵ cellule HEK-293 in 4 ml di terreno di coltura completo in una piastra di coltura tissutale di 6 cm.
   2. Aggiungere 15 μL di reagente di trasfezione LT1 a 250 μL di mezzo privo di siero e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
   3. Preparare un cocktail di trasfezione per ogni sgRNA come da Tabella 2 in 250 μL di terreno privo di siero. Mescolare il reagente di trasfezione preparato al punto 1.3.2 con il cocktail plasmidico e incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente.
   4. Sostituire il terreno di coltura completo con 3,5 ml di terreno di crescita fresco per le cellule HEK-293, quindi aggiungere la miscela di reagenti di trasfezione del DNA goccia a goccia alle cellule HEK-293 coltivate nei 3,5 ml di terreno di crescita fresco.
   5. Dopo 12-15 ore di trasfezione, cambiare il terreno per rimuovere il reagente di trasfezione e sostituirlo con 4 ml di terreno di coltura fresco.
   6. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere il terreno di coltura cellulare che contiene particelle lentivirali e filtrare il mezzo attraverso un filtro da 0,45 μm per rimuovere eventuali cellule HEK-293. I virus possono essere conservati a 4 °C per alcuni giorni. Per la conservazione a lungo termine, i virus devono essere congelati a -80 °C.
      NOTA: Seguire le linee guida sulla biosicurezza quando si preparano particelle lentivirali e lavorare in un ambiente (ad esempio, BL2+) adatto alla gestione del lentivirus. Vedere la procedura dettagliata di preparazione del lentivirus nel protocollo di Addgene intitolato pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
4. Infezione dei preadipociti bruni e determinazione del knockdown mediato da sgRNA
   1. Piastra 1 x 10 6 preadipociti marroni immortalizzati di topo in 1 mL di terreno fresco contenente 8 μg/mL di polibrene per pozzetto in una piastra a⁶ pozzetti.
      NOTA: In questo studio, i preadipociti marroni immortalizzati sono stati generati utilizzando l'antigene SV40 T²⁵. I preadipociti bruni sono coltivati in DMEM ad alto contenuto di glucosio con il 10% di FBS.
   2. Aggiungere 1 mL di soluzione di particelle lentivirali dal punto 1.3 per infettare le cellule. Mantenere un pozzetto non infetto di cellule in parallelo per fungere da controllo di selezione antibiotica.
   3. Passare al mezzo fresco 24 ore dopo l'infezione. Aggiungere gli antibiotici corrispondenti (ad esempio, puromicina con una concentrazione finale di 1 μg / ml) al mezzo per uccidere le cellule non infette e selezionare quelle infette. Passare al terreno fresco contenente l'antibiotico selezionato a giorni alterni fino a quando tutte le cellule di controllo non infette sono morte.
   4. Raccogliere proteine dalle cellule infettate dal virus e determinare l'efficienza di knockdown degli sgRNA mediante analisi western blot. Seguire la dettagliata procedura di western blotting in Eslami e Lujan²⁶. A causa del diverso tasso di turnover tra le proteine, testare più punti temporali (ad esempio, dal giorno 6 al giorno 12 dopo l'infezione da virus) per osservare la perdita di segnale proteico.
      NOTA: Se non è disponibile un anticorpo che riconosca la proteina codificata dal gene di interesse, il sequenziamento con metodo Sanger può essere utilizzato in alternativa per determinare l'efficienza di editing del genoma di ciascun sgRNA. In breve, amplificare il DNA genomico utilizzando primer che fiancheggiano la regione mirata all'sgRNA per generare ampliconi PCR di ~ 700 bp di lunghezza. Il sito di interruzione proiettato dovrebbe preferibilmente essere ~ 200 bp a valle del sito di inizio del sequenziamento. Quindi, sottoporre il prodotto PCR al sequenziamento Sanger. Analizzare i risultati del sequenziamento utilizzando gli strumenti online, come Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), per determinare la frequenza di piccoli indels generati da ciascun sgRNA in un pool di cellule²⁷.

2. Costruzione del plasmide AAV-sgRNA

NOTA: In questa fase, gli sgRNA effettivi identificati dalla schermata precedente vengono clonati nel vettore pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP²⁸ (Figura 2). Nel frattempo, uno sgRNA non bersaglio (ad esempio, TCTGATAGCGTAGGAGTGAT²⁹) che non riconosce alcuna sequenza nel genoma del topo viene anche clonato nello stesso vettore per fungere da controllo non modificato.

1. Linearizzare la dorsale pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP usando BbsI, che genera sporgenze identiche con oligo sgRNA sintetizzati.
2. Ligate le coppie di oligo ricotti con il vettore pAAV linearizzato e confermate le inserzioni di sgRNA come descritto al punto 1.2.
   NOTA: La procedura di clonazione per lentiCRISPRv2-sgRNA viene applicata anche per la costruzione del plasmide AAV-sgRNA.

3. Imballaggio AAV

1. Impacchettare i vettori AAV generati nella sezione 2 nel sierotipo AAV 8. Preparare AAV ad alto titolo secondo un precedente protocollo³⁰ o richiedere un servizio di confezionamento AAV da nuclei virali o servizi commerciali. Diluire il titolo del virus a 1 x 10¹³ copie del genoma/ml.
   NOTA: Il genoma modificato di AAV2 che esprime uno sgRNA è confezionato nel sierotipo AAV 8. Questo sierotipo è stato scelto per la sua elevata efficienza per il tessuto adiposo^18,31. Per prevenire la risposta immunitaria indotta da contaminanti, come detriti cellulari e piccole quantità di componenti medi, è necessario un AAV ultra-purificato per l'iniezione in vivo. L'ultra-purificazione può essere ottenuta mediante gradienti di iodixanolo e ultracentrifugazione³⁰.

4. Preparazione di topi Ucp1 Cre/Cas9

1. Acquistare il ceppo di topo Ucp1-Cre (vedi Tabella dei materiali) che esprime Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore Ucp1. Acquistare topi knock-in STOP-Cas9 omozigoti Rosa26-floxed³² (vedi Tabella dei materiali), in cui l'espressione di Cas9 è regolata in modo Cre ricombinasi-dipendente.
2. Incrociare questi ceppi per generare topi Ucp1-Cre/Cas9, come descritto in precedenza^16,17. Tenere tutti i topi in una stanza a temperatura e umidità controllate (23 °C, 30% di umidità) su un ciclo luce-buio di 12 ore (luci accese alle 6:30; luci spente alle 18:30) con libero accesso alla dieta e all'acqua.
3. Trattare i topi Ucp1-Cre/Cas9 risultanti con AAV portatori di sgRNA di controllo o sgRNA che prendono di mira il gene di interesse attraverso il metodo descritto di seguito. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi Ucp1-Cre/Cas9 di 12-15 settimane del peso di circa 30 g.

5. Chirurgia per iniezione di AAV nel BAT nei topi

1. Anestetizzare i topi con inalazione continua di isoflurano al 2,5% per induzione e mantenimento.
2. Lubrificare entrambi gli occhi per evitare l'asciugatura. Quindi, somministrare analgesici (banamina, 2,5 mg / kg di peso corporeo [BW], iniezione sottocutanea, vedere Tabella dei materiali) ai topi per ridurre al minimo e prevenire il dolore e l'angoscia postoperatori.
3. Rasare la pelliccia di topo sulla zona interscapolare usando un rasoio e sterilizzare l'area chirurgica con almeno tre cicli alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina seguito da etanolo al 70%. Quindi, applicare teli chirurgici sterili attorno al sito di incisione.
4. Incidere la pelle tra le scapole usando un bisturi (Figura 3A-B), quindi staccare la pelle rasata per esporre i tessuti adiposi sul collo usando le forbici chirurgiche (Figura 3C-D). La dimensione dell'incisione dipende dalle dimensioni del corpo, ma generalmente, l'incisione dovrebbe essere di circa 2 cm per esporre i tessuti grassi sulla regione interscapolare.
5. Tagliare i tessuti adiposi sul confine tra la regione distale dei tessuti grassi e dei muscoli usando una singola incisione (Figura 3E-F). La dimensione dell'incisione dovrebbe essere di circa 1 cm per aprire solo l'ingresso per l'inserimento delle forbici chirurgiche per il peeling smussato dei tessuti adiposi.
6. Usando la mano dominante, staccare i tessuti grassi senza mezzi termini e verticalmente con le forbici chirurgiche per esporre il BAT mentre pizzichi i tessuti adiposi, incluso il BAT, con la mano non dominante (Figura 3G). Usa la vena di Sultzer come punto di riferimento per indicare la posizione precisa del BAT.
   NOTA: il BAT nella Figura 3H è stato completamente esposto ai fini di una dimostrazione dell'immagine. Una dissezione eccessiva può causare danni ai nervi del BAT circostante. Una direzione errata delle forbici può danneggiare i muscoli circostanti e la vena di Sultzer che drena il BAT e potrebbe portare a sanguinamento eccessivo.
7. Per ciascun topo, iniettare lentamente 40 μL di AAV in entrambi i lobi BAT (20 μL per un lobo del BAT) utilizzando un ago affilato (32 G, vedere Tabella dei materiali) collegato a una siringa di Hamilton (100 μL, vedere Tabella dei materiali; Figura 3I). Verificare la riuscita dell'iniezione come indicato dall'assenza di perdite dal sito iniettato durante la somministrazione di AAV.
   NOTA: il BAT nella Figura 3I è stato completamente esposto ai fini di una dimostrazione dell'immagine. Il volume della soluzione AAV da somministrare in un lobo BAT è determinato dalla dimensione della BAT del mouse ricevente. Abbiamo determinato che 20 μL di soluzione AAV sono appropriati per un lobo BAT del peso di circa 0,05 g in un normale topo C57BL6/J del peso di 30 g. Se necessario, potrebbe essere necessario concentrare la soluzione virale per ottenere il volume desiderato.
8. Confermare l'assenza di sanguinamento dalla BAT iniettata o dai tessuti circostanti. Premere una garza imbevuta di soluzione di perossido di idrogeno (vedere Tabella dei materiali) su un sito di sanguinamento per l'emostasi.
9. Rimettere i tessuti adiposi esposti nella loro posizione normale. Ricucire il bordo dei tessuti adiposi e dei muscoli usando un filo monofilamento riassorbibile 5-0 (Figura 3J). Suturare la pelle aperta con 5-0 rivestiti di vicryl non tinti fili intrecciati (Figura 3K-L).
   NOTA: La Figura 4 descrive i passaggi per cucire i tessuti adiposi e i muscoli pelati.
10. Mantenere gli animali su una piastra elettrica dopo l'intervento chirurgico fino al completo recupero. Fornire agli animali l'accesso a cibo, acqua e ampie lettiere per la nidificazione. Monitorarli regolarmente per eventuali segni di angoscia o malattia per 7 giorni di recupero prima dell'inizio dell'esperimento.
11. Confermare l'efficienza della delezione genica mirata mediante analisi western blot nel BAT sezionato dai topi, come in Sugimoto et ^al.16.

Risultati

Durante le procedure di cui sopra, la consegna precisa di AAV-sgRNA alla BAT è cruciale per il successo del protocollo. Per massimizzare l'effetto di AAV-sgRNA e minimizzare il danno tissutale durante l'intervento chirurgico, è essenziale comprendere la posizione anatomica tridimensionale (3D) del BAT. Come mostrato nella Figura 3E, è difficile identificare la posizione precisa della BAT senza esporre il tessuto. Tuttavia, l'esposizione eccessiva alle BAT può danneggiare il tessuto (

Discussione

I metodi pubblicati esistenti per la somministrazione genica mediata da AAV alla BAT interscapolare non contengono immagini e video dettagliati che descrivono le tecniche chirurgiche e l'approccio per l'iniezione diretta di AAV nel BAT. Nella maggior parte dei metodi pubblicati^33,34, l'AAV viene iniettato nei tessuti adiposi che circondano il BAT interscapolare anziché nel BAT stesso. Quindi, ci sono diversi passaggi chiave in questo protocollo che determinano i...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
OPTI-MEM serum-free medium	Invitrogen	31985
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma	TR-1003-G
TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
Recombinant DNA
lentiCRISPR v2 vector	Addgene	52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP	Addgene	89060
pMD2.G envelope plasmid	Addgene	12259
psPAX2 packaging plasmid	Addgene	12260
Experimental Models: Cell Lines
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
WT-1 cells	Developed in Tseng lab	PMID: 14966273
Experimental Models: Organisms/Strains
Cas9 knockin mice	Jackson Laboratories	24857
Ucp1-CRE mice	Jackson Laboratories	24670
Others
Banamine	Patterson	07-859-1323
Hamilton syringe	Hamilton	Model 710 RN Syringe
Hydrogen peroxide solution	Fisher Scientific	H325-500
Needle	Hamilton	32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx	Henry Schein	1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx	Henry Schein	1294522