Geração de camundongos knockout específicos para gordura marrom usando um sistema combinado de RNA guia único Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado

Resumo

Neste protocolo, descrevemos os procedimentos técnicos para gerar camundongos knockout específicos para tecido adiposo marrom (BAT) utilizando um sistema combinado de RNA guia único (sgRNA) Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e vírus adenoassociado (AAV). As etapas descritas incluem o planejamento dos sgRNAs, a preparação das partículas de AAV-sgRNA e a microinjeção de AAV nos lóbulos BAT.

Resumo

O tecido adiposo marrom (BAT) é um depósito adiposo especializado em dissipação de energia que também pode servir como órgão endócrino através da secreção de moléculas bioativas. A criação de camundongos knockout específicos para MTD é uma das abordagens mais populares para entender a contribuição de um gene de interesse para a regulação de energia mediada por BAT. A estratégia convencional de direcionamento gênico utilizando o sistema Cre-LoxP tem sido a principal abordagem para gerar camundongos knockout tecido-específicos. No entanto, essa abordagem é demorada e tediosa. Aqui, descrevemos um protocolo para o knockout rápido e eficiente de um gene de interesse em MTD usando um sistema combinado de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e RNA guia único (sgRNA) de vírus adenoassociado (AAV). A MTD interescapular está localizada na camada profunda entre os músculos. Assim, as MTD devem ser expostas para injetar o VAT de forma precisa e direta nas MTD dentro do campo visual. O manuseio cirúrgico adequado é crucial para evitar danos aos nervos e vasos simpáticos, como a veia de Sultzer que se conecta à BAT. Para minimizar o dano tecidual, há uma necessidade crítica de entender a localização anatômica tridimensional da MTD e as habilidades cirúrgicas necessárias nas etapas técnicas. Este protocolo destaca os principais procedimentos técnicos, incluindo o projeto de sgRNAs visando o gene de interesse, a preparação de partículas de AAV-sgRNA e a cirurgia para a microinjeção direta de AAV em ambos os lobos BAT para gerar camundongos knockout específicos para BAT, que podem ser amplamente aplicados para estudar as funções biológicas de genes em BAT.

Introdução

A obesidade está aumentando a uma taxa significativa em todo o mundo, levando a um amplo espectro de doenças metabólicas ^1,2,3. O tecido adiposo é fundamental para essas patologias. Os dois tipos funcionalmente distintos de tecido adiposo que existem são o tecido adiposo branco (TAB), que armazena calorias em excesso, e o tecido adiposo marrom (BAT) e sua gordura bege/brite relacionada, que dissipam energia para a termogênese. Embora a MTD tenha sido reconhecida por sua função dissipadora de energia, ela também tem funções endócrinas por meio da produção de moléculas bioativas que regulam o metabolismo em órgãos^distais4,5. Numerosos estudos em roedores têm demonstrado que o aumento da quantidade ou atividade da gordura marrom ou bege leva ao aumento do gasto energético e melhora da sensibilidade à insulina. Em humanos, pessoas com MTD detectável apresentam prevalência significativamente menor de doenças cardiometabólicas⁶. Assim, as MTD apresentam excelente potencial terapêutico para sequelas metabólicas relacionadas à obesidade ^7,8,9.

Para investigar a fisiologia e fisiopatologia do desenvolvimento e função da MTD e elucidar os mecanismos moleculares envolvidos nesses processos, o modelo de camundongos transgênicos específicos para MTD é um método de^escolha10. O sistema de recombinação Cre-LoxP é o meio mais comumente usado para produzir camundongos knockout condicionais editando o genoma de camundongos. Esse sistema tem possibilitado a modificação (superexpressão ou knockout) de genes de interesse de forma tecido/célula-específica¹¹. Ele também pode ser utilizado para marcar um tipo específico de célula, expressando um gene repórter fluorescente seletivo.

Recentemente, a abordagem do sistema Cre-LoxP foi desenvolvida combinando a tecnologia CRISPR-Cas9 e o sistema de RNA guia único (sgRNA) do vírus adenoassociado (AAV)¹². O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta específica e eficiente de edição genética para modificar, regular ou atingir regiões precisas do genoma¹³. A edição do genoma baseada em CRISPR-Cas9 permite a manipulação genética rápida de loci genômicos porque não requer recombinação homóloga com um vetor de direcionamento genético. As técnicas combinadas de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA permitem que os pesquisadores entendam as funções gênicas com mais precisão, permitindo a investigação do papel de genes de interesse em momentos desejados em tecidos/células. Além disso, essas técnicas combinadas reduzem o tempo e o esforço necessários para gerar camundongos transgênicos e permitem o controle temporal da atividade de CRISPR-Cas9 para edição induzível do genoma em camundongos se uma linhagem Cre induzível for usada¹⁴.

Os vetores AAV são sistemas de liberação gênica in vivo seguros e eficazes. No entanto, os AAVs direcionados ao tecido adiposo têm ficado para trás em relação às aplicações em outros tecidos, como cérebro, coração, fígado e músculo¹⁵. Devido à eficiência relativamente baixa da transdução e ao tropismo com vetores sorotípicos de ocorrência natural, a entrega de genes guiados por AAV ao tecido adiposo ainda é um desafio¹⁵. Nos últimos 5 anos, nós e outros estabelecemos com sucesso maneiras eficazes e minimamente invasivas de entregar genes guiados por AAV no tecido adiposo e criamos modelos em camundongos que nos permitem obter uma compreensão dos genes envolvidos na regulação da função MTD^16,17,18,19. Por exemplo, usando AAV8 para entregar sgRNA visando Alox12, que codifica a 12-lipoxigenase (12-LOX), na MTD dos camundongos Ucp1-Cre/Cas9, descobrimos que a MTD ativada produz metabólitos de 12-LOX, a saber, o ácido 12-hidroxi-eicosapentaenóico (12-HEPE) e o ácido 13R, 14S-dihidroxi docosahexaenóico (maresina 2), para regular o metabolismo da glicose e resolver a inflamação associada à obesidade, respectivamente^{16, 17º}. Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo sobre os procedimentos técnicos, particularmente a cirurgia para a microinjeção direta de AAV-sgRNA nos lobos BAT, para gerar camundongos knockout específicos para MTD usando o sistema combinado Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 e AAV-sgRNA.

Protocolo

Todos os experimentos e cuidados com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Joslin Diabetes Center.

1. Triagem de sgRNAs efetivos em células cultivadas

NOTA: Para tornar o ensaio custo-efetivo, antes de empacotar os sgRNAs em partículas de AAV, recomendamos testar diferentes sgRNAs em células cultivadas por meio de um sistema baseado em lentivírus para expressão de Cas9/sgRNA (Figura 1) e selecionar os sgRNAs que fornecem a maior eficiência de knockdown para experimentos in vivo .

1. CRISPR-Cas9 sgRNA design
   1. Projetar sgRNAs usando ferramentas on-line, como a Broad sgRNA design tool (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)^20,21, a ferramenta online CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)²² e outras ferramentas disponíveis.
   2. Insira nomes de genes ou sequências alvo de DNA na caixa de nome do gene e selecione NGG como o motivo adjacente do protoespaçador (PAM) para SpCas9 para gerar sequências potenciais de sgRNA.
   3. Selecione os sgRNAs com alta eficiência prevista no alvo e baixa atividade fora do alvo. Por exemplo, sgRNAs com um escore de especificidade de pelo menos 50 na saída CRISPOR são recomendados para uso. Dentre os sgRNAs específicos que passam no filtro, escolha aqueles com altos escores de eficiência²³.
      NOTA: Em geral, três ou quatro sgRNAs são escolhidos para garantir a identificação de sgRNAs eficazes.
2. Construção do plasmídeo sgRNA CRISPR-Cas9
   1. Sintetizar pares de sgRNA oligo codificando 20 sequências alvo de nucleotídeos (nt) com saliências (5' e 3') do sítio de restrição BsmBI (Tabela 1) através de uma plataforma de síntese de DNA.
   2. Ligate recozido oligo pares com BsmBI-linearizado lentiCRISPR v2 vetor.
   3. Transformar o produto da ligadura na cepa Stbl3 E. coli e confirmar as inserções de sgRNA por sequenciamento de DNA de Sanger usando primer U6 forward.
      NOTA: Veja o procedimento de clonagem detalhado no protocolo da Addgene intitulado LentiCRISPRv2 e lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 e RNA guia único²⁴.
3. Produção de partículas lentivirais
   1. Aproximadamente 24 h antes da transfecção, placa 7 x 10⁵ células HEK-293 em 4 mL de meio de cultura completo em placa de cultura de tecido de 6 cm.
   2. Adicionar 15 μL do reagente de transfecção LT1 a 250 μL de meio livre de soro e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
   3. Preparar um coquetel de transfecção para cada sgRNA conforme Tabela 2 em 250 μL de meio sem soro. Misturar o reagente de transfecção preparado na etapa 1.3.2 com o coquetel de plasmídeos e incubar por 20-30 min à temperatura ambiente.
   4. Substitua o meio de crescimento completo por 3,5 mL de meio de crescimento fresco para células HEK-293 e, em seguida, adicione a mistura de reagentes de transfecção de DNA gota a gota às células HEK-293 cultivadas nos 3,5 mL de meio de crescimento fresco.
   5. Após 12-15 h de transfecção, trocar o meio para remover o reagente de transfecção e substituí-lo por 4 mL de meio de crescimento fresco.
   6. Após 24 h de incubação, coletar o meio de cultura celular que contém partículas lentivirais e filtrar o meio através de um filtro de 0,45 μm para remover quaisquer células HEK-293. Os vírus podem ser armazenados a 4 °C por alguns dias. Para armazenamento a longo prazo, os vírus devem ser congelados a -80 °C.
      NOTA: Siga as diretrizes de biossegurança ao preparar partículas lentivirais e trabalhe em um ambiente (por exemplo, BL2+) adequado para o manuseio de lentivírus. Veja o procedimento detalhado de preparação de lentivírus no protocolo da Addgene intitulado pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
4. Infecção de pré-adipócitos marrons e determinação de knockdown mediado por sgRNA
   1. Placa 1 x 10 6 camundongos imortalizou pré-adipócitos marrons em 1 mL de meio fresco contendo 8 μg/mL de polibreno por poço em placa de⁶ poços.
      OBS: Neste estudo, os pré-adipócitos marrons imortalizados foram gerados utilizando o antígeno T^{SV40 25}. Pré-adipócitos marrons são cultivados em DMEM com glicose alta com SFB a 10%.
   2. Adicionar 1 ml de solução de partículas lentivirais do passo 1.3 para infectar as células. Manter um poço de células não infectadas em paralelo para servir como controle de seleção de antibióticos.
   3. Mude para meio fresco 24 h após a infecção. Adicione os antibióticos correspondentes (por exemplo, puromicina com uma concentração final de 1 μg/mL) ao meio para matar as células não infectadas e selecionar as infectadas. Mude para meio fresco contendo o antibiótico selecionado a cada dois dias até que todas as células de controle não infectadas estejam mortas.
   4. Coletar proteína das células infectadas pelo vírus e determinar a eficiência de knockdown dos sgRNAs por análise de western blot. Siga o procedimento detalhado de western blotting em Eslami e Lujan²⁶. Devido à taxa de turnover variável entre as proteínas, teste vários pontos de tempo (por exemplo, do dia 6 ao dia 12 após a infecção pelo vírus) para observar a perda do sinal proteico.
      NOTA: Se um anticorpo que reconhece a proteína codificada pelo gene de interesse não estiver disponível, o sequenciamento de Sanger pode ser utilizado alternativamente para determinar a eficiência de edição do genoma de cada sgRNA. Resumidamente, amplificar o DNA genômico usando primers flanqueando a região alvo do sgRNA para gerar amplicons de PCR de ~700 pb de comprimento. O local de interrupção projetado deve ser preferencialmente ~200 bp a jusante do local de início do sequenciamento. Em seguida, submeta o produto PCR ao sequenciamento de Sanger. Analise os resultados do sequenciamento utilizando as ferramentas on-line, como o Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), para determinar a frequência de pequenos indels gerados por cada sgRNA em um pool de células²⁷.

2. Construção do plasmídeo AAV-sgRNA

NOTA: Nesta etapa, os sgRNAs efetivos identificados a partir da tela acima são clonados no vetor pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP²⁸ (Figura 2). Enquanto isso, um sgRNA não direcionado (por exemplo, TCTGATAGCGTAGGAGTGAT²⁹) que não reconhece nenhuma sequência no genoma do camundongo também é clonado no mesmo vetor para servir como um controle não editado.

1. Linearize o backbone pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP usando BbsI, que gera saliências idênticas com oligos de sgRNA sintetizados.
2. Ligate os pares oligo recozidos com vetor pAAV linearizado e confirme as inserções de sgRNA conforme descrito na etapa 1.2.
   NOTA: O procedimento de clonagem para lentiCRISPRv2-sgRNA também é aplicado para a construção do plasmídeo AAV-sgRNA.

3. Embalagem AAV

1. Empacotar os vetores AAV gerados na seção 2 no sorotipo 8 do AAV. Prepare AAV de alto título de acordo com um protocolo anterior³⁰, ou solicite um serviço de embalagem de AAV de núcleos virais ou serviços comerciais. Diluir o título do vírus para 1 x 10¹³ cópias do genoma/mL.
   NOTA: O genoma AAV2 modificado que expressa um sgRNA é empacotado no sorotipo 8 do AAV. Esse sorotipo foi escolhido devido à sua alta eficiência para o tecido adiposo ^18,31. Para prevenir a resposta imune induzida por contaminantes, como restos celulares e pequenas quantidades de componentes médios, o AAV ultrapurificado é necessário para injeção in vivo. A ultrapurificação pode ser obtida por gradientes de iodixanol e ultracentrifugação³⁰.

4. Preparação de camundongos Ucp1 Cre/Cas9

1. Compre a cepa de camundongo Ucp1-Cre (consulte Tabela de Materiais) que expressa a recombinase Cre sob o controle do promotor Ucp1. Compre camundongos STOP-Cas9 homozigotos Rosa26-floxed STOP-In³² (ver Tabela de Materiais), nos quais a expressão de Cas9 é regulada de maneira dependente de Cre recombinase.
2. Cruzar essas linhagens para gerar camundongos Ucp1-Cre/Cas9, como descrito anteriormente^16,17. Mantenha todos os ratos em uma sala com temperatura e umidade controladas (23 °C, 30% de umidade) em um ciclo claro-escuro de 12 h (luzes acesas às 6h30; luzes apagadas às 18h30) com acesso gratuito à dieta de ração e água.
3. Trate os camundongos Ucp1-Cre/Cas9 resultantes com AAVs portadores de sgRNA ou sgRNA de controle visando o gene de interesse através do método descrito abaixo. Neste estudo, camundongos Ucp1-Cre/Cas9 machos com 12-15 semanas de idade, pesando aproximadamente 30 g, foram utilizados.

5. Cirurgia para injeção de AAV nas MTD em camundongos

1. Anestesiar os camundongos com inalação contínua de isoflurano a 2,5% para indução e manutenção.
2. Lubrifique ambos os olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, dê analgésicos (banamina, 2,5 mg/kg de peso corporal [PC], injeção subcutânea, ver Tabela de Materiais) aos ratos para minimizar e prevenir a dor e o sofrimento pós-operatórios.
3. Raspar a pele do camundongo na área interescapular usando um barbeador e esterilizar a área cirúrgica com pelo menos três rodadas alternadas de uma esfoliação à base de iodo ou clorexidina, seguidas de etanol a 70%. Em seguida, aplique campos cirúrgicos estéreis ao redor do local da incisão.
4. Incisar a pele entre as escápulas com bisturi (Figura 3A-B) e, em seguida, descascar a pele raspada para expor os tecidos gordurosos do pescoço com tesoura cirúrgica (Figura 3C-D). O tamanho da incisão é dependente do tamanho corporal, mas, geralmente, a incisão deve ser de aproximadamente 2 cm para expor os tecidos adiposos na região interescapular.
5. Cortar os tecidos adiposos na borda entre a região distal dos tecidos adiposos e os músculos com uma única incisão (Figura 3E-F). O tamanho da incisão deve ser de aproximadamente 1 cm para apenas abrir a entrada para a inserção da tesoura cirúrgica para descamação romba dos tecidos adiposos.
6. Com a mão dominante, descasque os tecidos adiposos de forma brusca e vertical, com tesoura cirúrgica, expondo as MTD enquanto pinça os tecidos adiposos, incluindo a MTD, com a mão não dominante (Figura 3G). Use a veia de Sultzer como um ponto de referência para indicar a localização precisa do BAT.
   NOTA: A MTD na Figura 3H foi completamente exposta para fins de demonstração de imagem. O excesso de dissecção pode causar danos aos nervos da MTD circundante. A direção incorreta da tesoura pode machucar os músculos circundantes e a veia de Sultzer drenando a MTD e pode levar a sangramento excessivo.
7. Para cada rato, injecte lentamente 40 μL de AAV em ambos os lóbulos MTD (20 μL por um lóbulo da MTD) utilizando uma agulha afiada (32 G, ver Tabela de Materiais) ligada a uma seringa de Hamilton (100 μL, ver Tabela de Materiais; Figura 3I). Verifique se a injeção foi bem-sucedida, conforme indicado pela ausência de vazamentos do local injetado durante a administração de AAV.
   NOTA: A MTD na Figura 3I foi completamente exposta para fins de demonstração de imagem. O volume de solução de AAV a ser administrado num lobo MTD é determinado pelo tamanho das MTD do rato receptor. Determinamos que 20 μL de solução de AAV são apropriados para um lobo BAT pesando aproximadamente 0,05 g em um camundongo C57BL6/J regular pesando 30 g. Se necessário, a solução viral pode precisar ser concentrada para atingir o volume desejado.
8. Confirme se não houve hemorragia da MTD injetada ou dos tecidos circundantes. Pressione gaze embebida com solução de peróxido de hidrogênio (ver Tabela de Materiais) em um local de sangramento para hemostasia.
9. Coloque os tecidos adiposos expostos de volta à sua posição normal. Costurar a borda dos tecidos adiposos e do músculo com fio monofilamentar absorvível 5-0 (Figura 3J). Sutura da pele aberta com fios trançados vicryl não tingidos 5-0 (Figura 3K-L).
   NOTA: A Figura 4 descreve os passos para costurar os tecidos gordurosos descascados e os músculos.
10. Manter os animais em uma almofada de aquecimento após a cirurgia até a recuperação completa. Forneça aos animais acesso a comida, água e ampla cama para nidificação. Monitore-os regularmente para quaisquer sinais de sofrimento ou doença por 7 dias de recuperação antes do início do experimento.
11. Confirmar a eficiência da deleção do gene alvo pela análise de western blot nas MTD dissecadas de camundongos, como em Sugimoto et ^al.16.

Resultados

Ao longo dos procedimentos acima, a entrega precisa do AAV-sgRNA para o BAT é crucial para o sucesso do protocolo. Para maximizar o efeito do AAV-sgRNA e minimizar o dano tecidual durante a cirurgia, é essencial entender a localização anatômica tridimensional (3D) da BAT. Como mostrado na Figura 3E, é difícil identificar a localização precisa da MTD sem expor o tecido. No entanto, o excesso de exposição às MTD pode danificar o tecido (Figura 3

Discussão

Os métodos publicados existentes para a entrega de genes mediados por AAV para a MTD interescapular não contêm fotos e vídeos detalhados descrevendo as técnicas cirúrgicas e a abordagem para a injeção direta de AAV na BAT. Na maioria dos métodos publicados^33,34, o AAV é injetado nos tecidos adiposos ao redor da MTD interescapular em vez da MTD propriamente dita. Assim, existem várias etapas fundamentais nesse protocolo que determinam o sucesso do estud...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
OPTI-MEM serum-free medium	Invitrogen	31985
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma	TR-1003-G
TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
Recombinant DNA
lentiCRISPR v2 vector	Addgene	52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP	Addgene	89060
pMD2.G envelope plasmid	Addgene	12259
psPAX2 packaging plasmid	Addgene	12260
Experimental Models: Cell Lines
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
WT-1 cells	Developed in Tseng lab	PMID: 14966273
Experimental Models: Organisms/Strains
Cas9 knockin mice	Jackson Laboratories	24857
Ucp1-CRE mice	Jackson Laboratories	24670
Others
Banamine	Patterson	07-859-1323
Hamilton syringe	Hamilton	Model 710 RN Syringe
Hydrogen peroxide solution	Fisher Scientific	H325-500
Needle	Hamilton	32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx	Henry Schein	1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx	Henry Schein	1294522