Generación de ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema combinado de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado

Resumen

En este protocolo, describimos los procedimientos técnicos para generar ratones knockout específicos para tejido adiposo marrón (BAT) aprovechando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado (AAV). Los pasos descritos incluyen el diseño de los sgRNAs, la preparación de las partículas AAV-sgRNA y la microinyección de AAV en los lóbulos BAT.

Resumen

El tejido adiposo marrón (BAT) es un depósito adiposo especializado en la disipación de energía que también puede servir como órgano endocrino a través de la secreción de moléculas bioactivas. La creación de ratones knockout específicos de BAT es uno de los enfoques más populares para comprender la contribución de un gen de interés a la regulación de energía mediada por BAT. La estrategia convencional de orientación génica que utiliza el sistema Cre-LoxP ha sido el enfoque principal para generar ratones knockout específicos de tejido. Sin embargo, este enfoque requiere mucho tiempo y es tedioso. Aquí, describimos un protocolo para la eliminación rápida y eficiente de un gen de interés en BAT utilizando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociados (AAV). El BAT interescapular se encuentra en la capa profunda entre los músculos. Por lo tanto, las MTD deben exponerse para inyectar el VAA de forma precisa y directa en las MTD dentro del campo visual. El manejo quirúrgico adecuado es crucial para prevenir el daño a los nervios y vasos simpáticos, como la vena de Sultzer que se conecta al BAT. Para minimizar el daño tisular, existe una necesidad crítica de comprender la ubicación anatómica tridimensional de las MTD y las habilidades quirúrgicas requeridas en los pasos técnicos. Este protocolo destaca los procedimientos técnicos clave, incluido el diseño de sgRNAs dirigidos al gen de interés, la preparación de partículas AAV-sgRNA y la cirugía para la microinyección directa de AAV en ambos lóbulos BAT para generar ratones knockout específicos de BAT, que se pueden aplicar ampliamente para estudiar las funciones biológicas de los genes en BAT.

Introducción

La obesidad está aumentando a un ritmo significativo en todo el mundo, lo que lleva a un amplio espectro de enfermedades metabólicas ^1,2,3. El tejido adiposo es clave para estas patologías. Los dos tipos funcionalmente distintos de tejido adiposo que existen son el tejido adiposo blanco (WAT), que almacena el exceso de calorías, y el tejido adiposo marrón (BAT) y su grasa beige / brite relacionada, que disipa la energía para la termogénesis. Si bien el BAT ha sido reconocido por su función de disipación de energía, también tiene funciones endocrinas a través de la pr....

Protocolo

Todos los experimentos con animales y procedimientos de cuidado fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Diabetes Joslin.

1. Cribado de sgRNAs eficaces en células cultivadas

NOTA: Para que el ensayo sea rentable, antes de empaquetar los sgRNAs en partículas AAV, recomendamos probar diferentes sgRNAs en células cultivadas a través de un sistema basado en lentivirus para la expresión de Cas9/sgRNA (Figura 1) y seleccionar los sgRNAs que dan la mayor eficiencia de knockdown para experimentos in vivo .

....

Resultados

A lo largo de los procedimientos anteriores, la entrega precisa de AAV-sgRNA al BAT es crucial para el éxito del protocolo. Para maximizar el efecto de AAV-sgRNA y minimizar el daño tisular durante la cirugía, es esencial comprender la ubicación anatómica tridimensional (3D) del BAT. Como se muestra en la figura 3E, es difícil identificar la ubicación precisa de las MTD sin exponer el tejido. Sin embargo, la exposición excesiva a las MTD puede dañar el tejido (F.......

Discusión

Los métodos publicados existentes para la administración de genes mediados por AAV a la MTD interescapular no contienen imágenes y videos detallados que describan las técnicas quirúrgicas y el enfoque para la inyección directa de AAV en el BAT. En la mayoría de los métodos publicados^33,34, el AAV se inyecta en los tejidos grasos que rodean el MTD interescapular en lugar del propio MTD. Por lo tanto, hay varios pasos clave en este protocolo que determinan .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
OPTI-MEM serum-free medium	Invitrogen	31985
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma	TR-1003-G
TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
Recombinant DNA
lentiCRISPR v2 vector	Addgene	52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP	Addgene	89060
pMD2.G envelope plasmid	Addgene	12259
psPAX2 packaging plasmid	Addgene	12260
Experimental Models: Cell Lines
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
WT-1 cells	Developed in Tseng lab	PMID: 14966273
Experimental Models: Organisms/Strains
Cas9 knockin mice	Jackson Laboratories	24857
Ucp1-CRE mice	Jackson Laboratories	24670
Others
Banamine	Patterson	07-859-1323
Hamilton syringe	Hamilton	Model 710 RN Syringe
Hydrogen peroxide solution	Fisher Scientific	H325-500
Needle	Hamilton	32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx	Henry Schein	1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx	Henry Schein	1294522