Generación de ratones knockout específicos de grasa marrón utilizando un sistema combinado de ARN de guía única Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado

Resumen

En este protocolo, describimos los procedimientos técnicos para generar ratones knockout específicos para tejido adiposo marrón (BAT) aprovechando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociado (AAV). Los pasos descritos incluyen el diseño de los sgRNAs, la preparación de las partículas AAV-sgRNA y la microinyección de AAV en los lóbulos BAT.

Resumen

El tejido adiposo marrón (BAT) es un depósito adiposo especializado en la disipación de energía que también puede servir como órgano endocrino a través de la secreción de moléculas bioactivas. La creación de ratones knockout específicos de BAT es uno de los enfoques más populares para comprender la contribución de un gen de interés a la regulación de energía mediada por BAT. La estrategia convencional de orientación génica que utiliza el sistema Cre-LoxP ha sido el enfoque principal para generar ratones knockout específicos de tejido. Sin embargo, este enfoque requiere mucho tiempo y es tedioso. Aquí, describimos un protocolo para la eliminación rápida y eficiente de un gen de interés en BAT utilizando un sistema combinado de ARN de guía única (sgRNA) de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y virus adenoasociados (AAV). El BAT interescapular se encuentra en la capa profunda entre los músculos. Por lo tanto, las MTD deben exponerse para inyectar el VAA de forma precisa y directa en las MTD dentro del campo visual. El manejo quirúrgico adecuado es crucial para prevenir el daño a los nervios y vasos simpáticos, como la vena de Sultzer que se conecta al BAT. Para minimizar el daño tisular, existe una necesidad crítica de comprender la ubicación anatómica tridimensional de las MTD y las habilidades quirúrgicas requeridas en los pasos técnicos. Este protocolo destaca los procedimientos técnicos clave, incluido el diseño de sgRNAs dirigidos al gen de interés, la preparación de partículas AAV-sgRNA y la cirugía para la microinyección directa de AAV en ambos lóbulos BAT para generar ratones knockout específicos de BAT, que se pueden aplicar ampliamente para estudiar las funciones biológicas de los genes en BAT.

Introducción

La obesidad está aumentando a un ritmo significativo en todo el mundo, lo que lleva a un amplio espectro de enfermedades metabólicas ^1,2,3. El tejido adiposo es clave para estas patologías. Los dos tipos funcionalmente distintos de tejido adiposo que existen son el tejido adiposo blanco (WAT), que almacena el exceso de calorías, y el tejido adiposo marrón (BAT) y su grasa beige / brite relacionada, que disipa la energía para la termogénesis. Si bien el BAT ha sido reconocido por su función de disipación de energía, también tiene funciones endocrinas a través de la producción de moléculas bioactivas que regulan el metabolismo en los órganos distales ^4,5. Numerosos estudios en roedores han demostrado que aumentar la cantidad o actividad de la grasa marrón o beige conduce a un mayor gasto de energía y una mejor sensibilidad a la insulina. En humanos, las personas con MTD detectable tienen una prevalencia significativamente menor de enfermedades cardiometabólicas⁶. Por lo tanto, las MTD tienen un excelente potencial terapéutico para las secuelas metabólicas relacionadas con la obesidad ^7,8,9.

Para investigar la fisiología y fisiopatología del desarrollo y la función de las MTD y dilucidar los mecanismos moleculares implicados en estos procesos, el modelo de ratón transgénico específico para MTD es un método de elección¹⁰. El sistema de recombinación Cre-LoxP es el medio más utilizado para producir ratones knockout condicionales mediante la edición del genoma del ratón. Este sistema ha permitido la modificación (sobreexpresión o knockout) de genes de interés de manera específica de tejido/célula¹¹. También se puede utilizar para etiquetar un tipo de célula específico mediante la expresión de un gen reportero fluorescente selectivo.

Recientemente, el enfoque del sistema Cre-LoxP se ha desarrollado aún más mediante la combinación de la tecnología CRISPR-Cas9 y el sistema de ARN de guía única (sgRNA) del virus adenoasociado (AAV)¹². El sistema CRISPR-Cas9 es una herramienta de edición de genes específica y eficiente para modificar, regular o apuntar a regiones precisas del genoma¹³. La edición del genoma basada en CRISPR-Cas9 permite una rápida manipulación genética de los loci genómicos porque no requiere una recombinación homóloga con un vector dirigido a genes. Las técnicas combinadas de Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y AAV-sgRNA permiten a los investigadores comprender las funciones de los genes con mayor precisión al permitir la investigación del papel de los genes de interés en los momentos deseados en los tejidos / células. Además, estas técnicas combinadas reducen el tiempo y el esfuerzo requeridos para generar ratones transgénicos y permiten el control temporal de la actividad de CRISPR-Cas9 para la edición inducible del genoma en ratones si se utiliza una línea Cre inducible¹⁴.

Los vectores AAV son sistemas de administración de genes in vivo seguros y efectivos. Sin embargo, los AAV dirigidos al tejido adiposo se han quedado atrás de las aplicaciones en otros tejidos, como el cerebro, el corazón, el hígado y el músculo¹⁵. Debido a la eficiencia de transducción relativamente baja y al tropismo con vectores serotipos naturales, la entrega de genes guiados por AAV al tejido adiposo sigue siendo un desafío¹⁵. En los últimos 5 años, nosotros y otros hemos establecido con éxito formas efectivas y mínimamente invasivas de administrar genes guiados por AAV en el tejido adiposo y hemos creado modelos de ratón que nos permiten comprender los genes involucrados en la regulación de la función BAT^16,17,18,19. Por ejemplo, al usar AAV8 para administrar sgRNA dirigido a Alox12, que codifica 12-lipoxigenasa (12-LOX), en el BAT de los ratones Ucp1-Cre / Cas9, hemos descubierto que BAT activado produce metabolitos 12-LOX, a saber, ácido 12-hidroxi-eicosapentaenoico (12-HEPE) y ácido 13R, 14S-dihidroxi docosahexaenoico (maresina 2), para regular el metabolismo de la glucosa y resolver la inflamación asociada a la obesidad, respectivamente^{16, 17}. Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso sobre los procedimientos técnicos, particularmente la cirugía para la microinyección directa de AAV-sgRNA en los lóbulos BAT, para generar ratones knockout específicos de BAT utilizando el sistema combinado Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 y AAV-sgRNA.

Protocolo

Todos los experimentos con animales y procedimientos de cuidado fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro de Diabetes Joslin.

1. Cribado de sgRNAs eficaces en células cultivadas

NOTA: Para que el ensayo sea rentable, antes de empaquetar los sgRNAs en partículas AAV, recomendamos probar diferentes sgRNAs en células cultivadas a través de un sistema basado en lentivirus para la expresión de Cas9/sgRNA (Figura 1) y seleccionar los sgRNAs que dan la mayor eficiencia de knockdown para experimentos in vivo .

1. Diseño de sgRNA CRISPR-Cas9
   1. Diseñe sgRNAs utilizando herramientas en línea, como la herramienta de diseño Broad sgRNA (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)^20,21, la herramienta en línea CRISPOR (http://crispor.tefor.net/⁾²² y otras herramientas disponibles.
   2. Introduzca los nombres de los genes o las secuencias diana de ADN en el cuadro de nombre del gen y seleccione NGG como motivo adyacente al protoespaciador (PAM) para que SpCas9 genere posibles secuencias de sgRNA.
   3. Seleccione los sgRNAs con alta eficiencia prevista en el objetivo y baja actividad fuera del objetivo. Por ejemplo, se recomienda el uso de sgRNAs con una puntuación de especificidad de al menos 50 en la salida de CRISPOR. Entre los sgRNAs específicos que pasan el filtro, elija los que tienen puntajes de alta eficiencia²³.
      NOTA: En general, se seleccionan tres o cuatro sgRNAs para asegurar la identificación de sgRNAs efectivos.
2. Construcción del plásmido sgRNA CRISPR-Cas9
   1. Sintetizar pares de oligo sgRNA que codifican secuencias dirigidas a 20 nucleótidos (nt) con voladizos (tanto 5' como 3') desde el sitio de restricción BsmBI (Tabla 1) a través de una plataforma de síntesis de ADN.
   2. Ligate de pares de oligo recocidos con vector lentiCRISPR v2 linealizado de BsmBI.
   3. Transformar el producto de ligadura en la cepa Stbl3 E. coli y confirmar las inserciones de sgRNA mediante secuenciación de ADN de Sanger utilizando el cebador hacia adelante U6.
      NOTA: Consulte el procedimiento detallado de clonación en el protocolo de Addgene titulado LentiCRISPRv2 y lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR / Cas9 y ARN guía único²⁴.
3. Producción de partículas lentivirales
   1. Aproximadamente 24 h antes de la transfección, placa 7 x 10⁵ células HEK-293 en 4 mL de medio de crecimiento completo en una placa de cultivo tisular de 6 cm.
   2. Añadir 15 μL de reactivo de transfección LT1 a 250 μL de medio libre de suero e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   3. Preparar un cóctel de transfección para cada sgRNA según la Tabla 2 en 250 μL de medio libre de suero. Mezclar el reactivo de transfección preparado en el paso 1.3.2 con el cóctel plásmido e incubar durante 20-30 min a temperatura ambiente.
   4. Reemplace el medio de crecimiento completo con 3.5 ml de medio de crecimiento fresco para las células HEK-293, y luego agregue la mezcla de reactivos de transfección de ADN gota a paso a las células HEK-293 cultivadas en los 3.5 ml de medio de crecimiento fresco.
   5. Después de 12-15 h de transfección, cambie el medio para eliminar el reactivo de transfección y reemplácelo con 4 ml de medio de crecimiento fresco.
   6. Después de 24 h de incubación, recolectar el medio de cultivo celular que contiene partículas lentivirales y filtrar el medio a través de un filtro de 0,45 μm para eliminar cualquier célula HEK-293. Los virus pueden almacenarse a 4 °C durante unos días. Para el almacenamiento a largo plazo, los virus deben congelarse a -80 °C.
      NOTA: Siga las pautas de bioseguridad al preparar partículas lentivirales y trabaje en un ambiente (por ejemplo, BL2+) adecuado para manejar lentivirus. Consulte el procedimiento detallado de preparación de lentivirus en el protocolo de Addgene titulado pLKO.1 - TRC Cloning Vector (https://www.addgene.org/protocols/plko/#G).
4. Infección de preadipocitos marrones y determinación de knockdown mediado por sgRNA
   1. Placa 1 x 10 6 ratón inmortalizado preadipocitos marrones en 1 mL de medio fresco que contiene 8 μg/mL de polibeno por pocillo en una placa de⁶ pocillos.
      NOTA: En este estudio, los preadipocitos marrones inmortalizados se generaron utilizando el antígeno T SV40²⁵. Los preadipocitos marrones se cultivan en DMEM de glucosa alta con 10% de FBS.
   2. Agregue 1 ml de solución de partículas lentivirales del paso 1.3 para infectar las células. Mantener un pocillo de células no infectado en paralelo para que sirva como control de selección de antibióticos.
   3. Cambiar a medio fresco 24 h después de la infección. Agregue los antibióticos correspondientes (por ejemplo, puromicina con una concentración final de 1 μg / ml) al medio para matar las células no infectadas y seleccione las infectadas. Cambie a un medio fresco que contenga el antibiótico seleccionado cada dos días hasta que todas las células de control no infectadas estén muertas.
   4. Recolectar proteínas de las células infectadas por el virus y determinar la eficiencia de derribo de los sgRNAs mediante el análisis de Western blot. Siga el procedimiento detallado de Western Blotting en Eslami y Lujan²⁶. Debido a la tasa de renovación variable entre las proteínas, pruebe múltiples puntos de tiempo (por ejemplo, desde el día 6 hasta el día 12 después de la infección por el virus) para observar la pérdida de señal de proteína.
      NOTA: Si no se dispone de un anticuerpo que reconozca la proteína codificada por el gen de interés, la secuenciación de Sanger se puede utilizar alternativamente para determinar la eficiencia de edición del genoma de cada sgRNA. Brevemente, amplíe el ADN genómico usando cebadores que flanquean la región dirigida al sgRNA para generar amplicones de PCR de ~ 700 pb de longitud. El sitio de ruptura proyectado debe ser preferiblemente ~ 200 pb aguas abajo del sitio de inicio de la secuenciación. Luego, someta el producto de PCR a la secuenciación de Sanger. Analizar los resultados de la secuenciación utilizando las herramientas en línea, como Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE), para determinar la frecuencia de pequeños indeles generados por cada sgRNA en un pool de células²⁷.

2. Construcción del plásmido AAV-sgRNA

NOTA: En este paso, los sgRNAs efectivos identificados en la pantalla anterior se clonan en el vector pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP²⁸ (Figura 2). Mientras tanto, un sgRNA no dirigido (por ejemplo, TCTGATAGCGTAGGAGTGAT²⁹) que no reconoce ninguna secuencia en el genoma del ratón también se clona en el mismo vector para servir como un control no editado.

1. Linealizar la red troncal pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP utilizando BbsI, que genera voladizos idénticos con oligos sgRNA sintetizados.
2. Ligate los pares oligo recocidos con el vector pAAV linealizado y confirme las inserciones de sgRNA como se describe en el paso 1.2.
   NOTA: El procedimiento de clonación para lentiCRISPRv2-sgRNA también se aplica para la construcción del plásmido AAV-sgRNA.

3. Embalaje AAV

1. Empaquetar los vectores AAV generados en la sección 2 en el serotipo 8 AAV. Preparar AAV de alto título de acuerdo con un protocolo previo³⁰, o solicitar un servicio de envasado AAV de núcleos virales o servicios comerciales. Diluir el título del virus a 1 x 10¹³ copias del genoma/ml.
   NOTA: El genoma AAV2 modificado que expresa un sgRNA se empaqueta en el serotipo 8 de AAV. Este serotipo fue elegido debido a su alta eficiencia para el tejido adiposo^18,31. Para prevenir la respuesta inmune inducida por contaminantes, como restos celulares y pequeñas cantidades de componentes medianos, se requiere AAV ultrapurificado para la inyección in vivo. La ultrapurificación se puede lograr mediante gradientes de iodixanol y ultracentrifugación³⁰.

4. Preparación de ratones Ucp1 Cre/Cas9

1. Compre la cepa de ratón Ucp1-Cre (consulte la Tabla de materiales) que expresa Cre recombinasa bajo el control del promotor Ucp1. Compre ratones homocigotos Rosa26-floxed STOP-Cas9^{knock-in 32} (ver Tabla de materiales), en los que la expresión de Cas9 está regulada de una manera dependiente de la recombinasa Cre.
2. Cruza estas cepas para generar ratones Ucp1-Cre/Cas9, como se describió anteriormente^16,17. Mantenga a todos los ratones en una habitación con temperatura y humedad controladas (23 ° C, 30% de humedad) en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 6:30 am; luces apagadas a las 6:30 pm) con acceso gratuito a dieta de comida y agua.
3. Tratar los ratones Ucp1-Cre/Cas9 resultantes con AAV portadores de sgRNA de control o sgRNA dirigidos al gen de interés a través del método descrito a continuación. En este estudio, se utilizaron ratones machos Ucp1-Cre/Cas9 de 12-15 semanas de edad que pesaban aproximadamente 30 g.

5. Cirugía para la inyección de AAV en el BAT en ratones

1. Anestesiar a los ratones con inhalación continua de isoflurano al 2,5% para inducción y mantenimiento.
2. Lubrique ambos ojos para evitar que se sequen. Luego, administre analgésicos (banamina, 2.5 mg / kg de peso corporal [PC], inyección subcutánea, ver Tabla de materiales) a los ratones para minimizar y prevenir el dolor y la angustia postoperatoria.
3. Afeite el pelaje del ratón en el área interescapular con una afeitadora y esterilice el área quirúrgica con al menos tres rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina seguido de etanol al 70%. Luego, aplique cortinas quirúrgicas estériles alrededor del sitio de la incisión.
4. Incise la piel entre las escápulas con un bisturí (Figura 3A-B) y luego retire la piel afeitada para exponer los tejidos grasos del cuello con tijeras quirúrgicas (Figura 3C-D). El tamaño de la incisión depende del tamaño del cuerpo, pero en general, la incisión debe ser de aproximadamente 2 cm para exponer los tejidos grasos en la región interescapular.
5. Corte los tejidos grasos en el borde entre la región distal de los tejidos grasos y los músculos con una sola incisión (Figura 3E-F). El tamaño de la incisión debe ser de aproximadamente 1 cm para abrir la entrada para la inserción de las tijeras quirúrgicas para el peeling romo de los tejidos grasos.
6. Usando la mano dominante, despegue los tejidos grasos sin rodeos y verticalmente con tijeras quirúrgicas para exponer el BAT mientras pellizca los tejidos grasos, incluido el BAT, con la mano no dominante (Figura 3G). Utilice la vena de Sultzer como punto de referencia para indicar la ubicación precisa de las MTD.
   NOTA: El BAT en la Figura 3H fue completamente expuesto con el propósito de una demostración de imagen. La disección excesiva puede causar daño a los nervios del MTD circundante. La dirección incorrecta de las tijeras puede dañar los músculos circundantes y la vena de Sultzer que drena el BAT y podría provocar un sangrado excesivo.
7. Para cada ratón, inyecte 40 μL de AAV lentamente en ambos lóbulos BAT (20 μL por un lóbulo del BAT) utilizando una aguja afilada (32 G, ver Tabla de materiales) conectada a una jeringa de Hamilton (100 μL, ver Tabla de materiales; Figura 3I). Verifique si la inyección se ha realizado correctamente, como lo indica que no hay fugas en el sitio inyectado durante la administración de AAV.
   NOTA: El BAT en la Figura 3I fue completamente expuesto con el propósito de una demostración de imagen. El volumen de solución de AAV que debe administrarse en un lóbulo BAT está determinado por el tamaño del BAT del ratón receptor. Hemos determinado que 20 μL de solución AAV son apropiados para un lóbulo BAT que pesa aproximadamente 0,05 g en un ratón C57BL6/J normal que pesa 30 g. Si es necesario, es posible que sea necesario concentrar la solución viral para lograr el volumen deseado.
8. Confirme que no hay sangrado de la MTD inyectada o de los tejidos circundantes. Presione una gasa empapada con solución de peróxido de hidrógeno (consulte la Tabla de materiales) en un sitio de sangrado para la hemostasia.
9. Coloque los tejidos grasos expuestos de nuevo a su posición normal. Cose el borde de los tejidos grasos y el músculo con un hilo de monofilamento absorbible 5-0 (Figura 3J). Suturar la piel abierta con hilos trenzados sin teñir de vicryl recubiertos 5-0 (Figura 3K-L).
   NOTA: La Figura 4 describe los pasos para coser los tejidos grasos pelados y los músculos.
10. Mantenga a los animales en una almohadilla térmica después de la cirugía hasta la recuperación completa. Proporcione a los animales acceso a alimentos, agua y ropa de cama abundante para anidar. Controle regularmente para detectar cualquier signo de angustia o enfermedad durante 7 días de recuperación antes del comienzo del experimento.
11. Confirmar la eficiencia de la deleción génica dirigida por análisis western blot en el BAT disecado de ratones, como en Sugimoto et ^al.16.

Resultados

A lo largo de los procedimientos anteriores, la entrega precisa de AAV-sgRNA al BAT es crucial para el éxito del protocolo. Para maximizar el efecto de AAV-sgRNA y minimizar el daño tisular durante la cirugía, es esencial comprender la ubicación anatómica tridimensional (3D) del BAT. Como se muestra en la figura 3E, es difícil identificar la ubicación precisa de las MTD sin exponer el tejido. Sin embargo, la exposición excesiva a las MTD puede dañar el tejido (F...

Discusión

Los métodos publicados existentes para la administración de genes mediados por AAV a la MTD interescapular no contienen imágenes y videos detallados que describan las técnicas quirúrgicas y el enfoque para la inyección directa de AAV en el BAT. En la mayoría de los métodos publicados^33,34, el AAV se inyecta en los tejidos grasos que rodean el MTD interescapular en lugar del propio MTD. Por lo tanto, hay varios pasos clave en este protocolo que determinan ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins
OPTI-MEM serum-free medium	Invitrogen	31985
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Sigma	TR-1003-G
TransIT-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
Recombinant DNA
lentiCRISPR v2 vector	Addgene	52961
pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP	Addgene	89060
pMD2.G envelope plasmid	Addgene	12259
psPAX2 packaging plasmid	Addgene	12260
Experimental Models: Cell Lines
HEK-293 cells	ATCC	CRL-1573
WT-1 cells	Developed in Tseng lab	PMID: 14966273
Experimental Models: Organisms/Strains
Cas9 knockin mice	Jackson Laboratories	24857
Ucp1-CRE mice	Jackson Laboratories	24670
Others
Banamine	Patterson	07-859-1323
Hamilton syringe	Hamilton	Model 710 RN Syringe
Hydrogen peroxide solution	Fisher Scientific	H325-500
Needle	Hamilton	32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2
Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx	Henry Schein	1273504
Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx	Henry Schein	1294522