纳米级红外光谱探索多相聚合物体系的进展

摘要

该协议描述了原子力显微镜和纳米级红外光谱的应用，以评估光热纳米级红外光谱在三维多聚物样品表征中的性能。

摘要

多相聚合物系统包含局部域，其尺寸可以从几十纳米到几微米不等。它们的成分通常使用红外光谱法进行评估，红外光谱法提供了探测体积中所含各种材料的平均指纹。但是，这种方法没有提供有关材料中相位安排的任何细节。两种聚合物相之间的界面区域（通常在纳米级范围内）也难以进入。光热纳米级红外光谱通过原子力显微镜（AFM）的灵敏探针监测红外光激发的材料的局部响应。虽然该技术适用于研究小特征，例如原始金表面上的单个蛋白质，但三维多组分材料的表征更加难以捉摸。这是由于与AFM尖端探测的纳米级区域相比，发生光热膨胀的材料相对较大，由激光聚焦到样品上和聚合物成分的热特性定义。使用聚苯乙烯 （PS） 珠和聚乙烯醇 （PVA） 薄膜，我们评估了用于表面分析的光热纳米级红外光谱的空间足迹，作为 PS 在 PVA 薄膜中位置的函数。研究了特征位置对纳米级红外图像的影响，并获得了光谱。考虑到具有嵌入聚合物结构的复杂系统的表征，对光热纳米级红外光谱领域的未来进展提出了一些看法。

引言

原子力显微镜 （AFM） 对于以纳米级分辨率^1、2、3 对各种样品的形态进行成像和表征至关重要。通过测量针尖与样品表面相互作用导致的悬臂挠度，已经开发了用于局部刚度测量和针尖-样品粘附的纳米级功能成像协议^4,5。对于软凝聚态物质和聚合物分析，探索局部域的纳米力学和纳米化学性质的AFM测量备受追捧^6,7,8。在纳米级红外 （nanoIR） 光谱出现之前，对针尖进行了化学修饰，以评估 AFM 力曲线中不同域的存在，并推断针尖-样品相互作用的性质。例如，该方法用于揭示环己烷处理的聚苯乙烯嵌段聚（丙烯酸叔丁酯）嵌段共聚物薄膜表面聚（丙烯酸叔丁酯）嵌段共聚物薄膜表面的微结构域的转变，该薄膜在50nm以下的水平⁹。

红外 （IR） 光与 AFM 的结合对高分子科学领域产生了重大影响⁶.传统的红外光谱是研究聚合物材料化学结构的广泛使用的技术^10,11，但它无法提供有关单个相和相间行为的信息，因为与用于探测样品的红外光束的大小相比，这些区域太小。这个问题适用于红外显微光谱，因为它受到光学衍射极限⁶的限制。这种测量平均了红外光激发的整个区域的贡献;探测区域内存在纳米级相所产生的信号要么表现出复杂的指纹，在后处理过程中应进行去卷积处理，要么由于信号电平低于可检测电平而丢失。因此，开发具有纳米级空间分辨率和高红外灵敏度的工具来探索复杂介质中的纳米级化学特征至关重要。

已经开发了实现纳米红外光谱的方案，首先使用金属原子力显微镜尖端作为纳米天线^12,13，最近利用悬臂悬臂监测样品12,14,15红外照明期间发生的光热膨胀变化的能力。后者使用脉冲、可调谐的红外光源，该光源调谐到探测材料的吸收带，使样品吸收辐射并发生光热膨胀。这种方法非常适合有机和聚合物材料。脉冲激发使原子力显微镜悬臂以振荡的形式与样品表面接触时可以检测到这种效应。然后，在频谱中观察到的系统接触共振之一的振幅作为照明波长的函数进行监测，该波长构成了AFM尖端¹⁵下方材料的nanoIR吸收光谱。纳米红外成像和光谱学的空间分辨率受到材料光热膨胀的各种影响的限制。已经评估了使用接触模式AFM的光热纳米IR光谱可以获得具有亚50nm尺度空间分辨率的材料的振动吸收光谱特性¹⁴，最近的工作证明了α-突触核蛋白^16,17的单体和二聚体的检测。然而，对以各种构型组装的非均相聚合物材料进行纳米红外测量性能的定量研究仍然有限，例如嵌入各种聚合物薄膜体积中的有限尺寸的吸收器的情况。

本文旨在创建一个具有已知尺寸嵌入特征的聚合物组件，以评估表面分析过程中 nanoIR 的光热膨胀灵敏度和空间分辨率。该协议涵盖了在硅衬底上制备聚乙烯醇（PVA）聚合物薄膜以及将三维聚苯乙烯（PS）珠放置在PVA薄膜上或嵌入PVA薄膜中，这构成了模型系统的形成。NanoIR 成像和光谱测量是在评估位于 PVA 薄膜上或下方的相同 PS 微珠产生的信号的背景下描述的。评估磁珠位置对nanoIR信号的影响。讨论了评估纳米红外图中磁珠空间足迹的方法，并考虑了几个参数的影响。

研究方案

1. 制作聚乙烯醇（PVA）溶液

1. 测量水和 PVA 聚合物颗粒（参见 材料表），以 20% PVA 与水的重量比制备 10 mL 溶液。
2. 在设置为100°C的热板上加热玻璃器皿中的水。
3. 将PVA聚合物颗粒放入热水中。插入磁力搅拌棒。
4. 将热量降低至80°C，搅拌至PVA完全溶解。
5. 盖住玻璃器皿的顶部以防止污染。
6. 完全溶解后，将 20% PVA 溶液放入适当的储存容器中，在室温下储存。

2. 制备PVA涂层硅（Si）晶圆

1. 将硅 （Si） 晶圆（见 材料表）切成 ~10 x 10 mm² 正方形。
2. 使用异丙醇清洁硅基板并使其干燥。
3. 将干净的硅晶圆放在旋涂机的卡盘上（参见 材料表）。
   1. 将大约 10 μL PVA 溶液滴注到 Si 衬底的中心。尽量避免气泡形成。
   2. 以每分钟 1,500 转 （rpm） 的速度旋转涂覆 30 秒，用均匀的 PVA 薄膜涂覆 Si 基板。
      注意:指定的液体体积和旋涂参数在基材表面形成一层均匀的 PVA，其厚度足以防止旋涂和下一步将 PS 珠子放置到 PVA 表面之间快速干燥。
4. 在转移PS微珠之前，从旋涂机中取出样品并将其放入干净的样品容器中，以防止污染。

3. 将 PS 珠子放在 PVA 涂层表面上

1. 使用异丙醇清洁硅基板并使其干燥。
2. 使用移液管，将悬浮在水中的 1 μL PS 珠放在基材的中心。
3. 将样品放入装有膨润土粘土干燥剂的储藏室中，让水蒸发。
   注意:此步骤通过减少暴露于潮湿环境中来保存样品。
4. 将PVA涂层的基材（步骤2.4）和带有干燥的PS珠的基材（步骤3.3）置于光学显微镜下。根据它们的大小，使用简单的双筒望远镜可以看到单个珠子，或者需要更高的光学放大倍率。
5. 使用超细镊子轻轻松开珠子（参见 材料表）。用细毛画笔收集一些松散的珠子，然后轻轻敲击新涂有 PVA 涂层的晶圆上的画笔毛发。多次扫描应使珠子积聚在刷子的毛发中。轻敲画笔毛发的顶部以扰乱 PS 珠粉，将珠子释放到粘性 PVA 表面上。
   注意: 重要的是画笔是高质量和干净的，以避免将纤维和污染物释放到 PVA 薄膜的表面。在此步骤中快速移动是必不可少的，这样 PVA 就不会完全干燥。
6. 重复此步骤，直到通过光学显微镜检查确认单个 PS 珠粘附在 PVA 表面上。
7. 将样品储存在干净的容器中。让样品完全干燥。
   注意:在进行进一步的分析尝试之前，应让样品完全冷却和干燥。AFM高度测量或表面轮廓仪测量可以评估连续PVA薄膜的厚度。

4. 加载样品进行AFM表征

注意:所描述的协议基于nanoIR2（参见 材料表）平台的标准操作程序，但应根据用于测量的AFM模型进行调整。

1. 使用金属 AFM 盘和粘性标签将 PVA 和 PS 微珠样品安装到 AFM 载物台上，以便样品牢固地固定在样品架上。
2. 将nanoIR探针（例如FORTGG）安装到AFM探针支架上。
   注:AFM 悬臂长 225 μm，宽 27 μm，厚 2.7 μm，尖端半径小于 10 nm。悬臂的两侧涂有 45 nm 厚的金膜，以限制其对样品顶部红外照明的响应（参见 材料表）。对于纳米红外光谱测量，最好使用在使用前已储存在无聚二甲基硅氧烷环境中的悬臂。
3. 通过转动激光对准旋钮（激光位置的 x 和 y 调整以及探测器位置的垂直调整），将读出的激光器对准悬臂光束的自由端。
   1. 最大化检测器的 SUM 信号。
   2. 通过转动偏转旋钮来调整检测器的位置，使激光与AFM读出系统的位置敏感检测器的中心对齐，对应于~0V的垂直偏转信号。
4. 单击AFM"探针"控制面板中的 "加载 "图标。
   1. 按照向导屏幕中的提示进行操作。使用 聚焦箭头 确定 nanoIR 悬臂的焦平面。使用 XY 位移控件将悬臂定位在屏幕中央（与白色十字对齐）。
   2. 接下来，单击 焦点箭 头以找到样品表面的焦平面。
   3. 使用系统的光学视图和 XY 位移控制将悬臂尖端定位在感兴趣的磁珠上方，然后单击 下一步。
   4. 在接合屏幕上，将"对峙"设置为 50 μm ，然后单击 Approach Only。
5. 启动 Engage 程序以接近尖端进行成像。

5. 创建多聚物样品的形貌和纳米红外图像

1. 在标准"接触模式"下采集形貌图像。设置悬臂相对于 PS 磁珠的位置后，通过单击 AFM"探头"控制面板中的 啮合 图标来启动进近。整个研究使用了 0.2 V 偏转差的啮合设定值，对应于 ~100 nN 的力。
   在AFM"扫描"控制面板中，将 扫描速率 设置为0.8 Hz， 扫描大小 （高度和宽度）以及用于成像 的每行点数和每张图像的行数 （此处使用512 x 512）。单击"扫描"以获取地形图像。
   注:悬臂¹⁸ 的校准是通过确定悬臂与蓝宝石衬底相互作用时获得的挠度-距离曲线斜率的偏转灵敏度（以nm/V为单位）来完成的（补充图1A）。悬臂刚度由热调谐¹⁹ 确定（补充图1B）。悬臂的共振是使用洛伦兹函数拟合的。悬臂刚度（单位:N/m）使用均分定理 确定，其中 K_B是玻尔兹曼常数，T是温度（T = 295K），P是悬臂热波动的功率谱面积，通过对热调谐数据²⁰的洛伦兹拟合进行积分确定。
2. 对于nanoIR测量，将AFM尖端放在从形貌图像中识别的感兴趣特征上。
   1. 选择nanoIR控制面板中的 音叉 图标，以确定悬臂的接触谐振频率。设置一个照明波数，以激发材料中的光热膨胀。设置要扫描的激光脉冲频率范围，并设置nanoIR激光器的占空比。在"激光脉冲调谐窗口"中选择 采集 。
   2. 通过将标记条（绿色垂直线）定位在第二个接触谐振的峰值处，选择尖端样品系统的第二个接触共振以进行 nanoIR 测量。
      注意: 接触共振模式的选择可能因悬臂和样品的类型而异。
   3. 单击" 优化 "（Optimize），将红外激光焦点区域的中心与悬臂尖端的位置对齐。对准是在选定的红外照明波数下完成的，对应于探测材料的吸收带。悬臂位于激光足迹的中心（补充图2）。
      注意: 根据激光型号的不同，不同波数的对准可能会有所不同。
   4. 获取红外激光照明的背景。这包括在所选脉冲频率下测量红外量子级联激光器（QCL）在发射波长范围内的输出（补充图3）。这对于nanoIR光谱的背景校正非常重要。
   5. 通过选择波数范围（此处， 开始 和 停止 分别设置为 1,530 ^cm-1 和 1,800 ^cm-1）、 步长 （2 ^cm-1） 和用于测量 的平均值数 来获取 nanoIR 光谱。通过将衰减背景测量的光热振幅除以显示的光谱进行背景校正，其中包括将步骤5.2.4中收集的背景乘以为测量选择的功率百分比。
3. 对于 nanoIR 成像，选择 感兴趣的成像区域 。
   1. 在"激光脉冲调谐窗口"（通过音叉图标访问）中启用锁相环 （PLL） 自动调谐。
   2. 调整最小和最大频率以在常规控制面板中以第二谐振模式为中心的扫描范围。
   3. 通过单击PLL控制面板中的 零 来将相位归零，然后单击"激光脉冲调谐窗口"中的 "确定 "。
   4. 通过在 nanoIR 控制面板的框中打勾来选择 IR Imaging Enabled 。
   5. 在"成像视图"控制面板中，选择 高度 （成像视图 1）、 振幅 2 （成像视图 2）和 相位 2 （成像视图 3）以获取样品的形貌和化学图像。将采集方向设置为 "跟踪 "（或 "跟踪"）。通常需要 线拟合 线来观察所采集样品的形貌图像。捕获拟合度应设置为 "无"。
      注意:可以根据需要调整扫描首选项，例如捕获的扫描方向或使用的调色板。
   6. 在AFM"扫描"控制面板中，选择 扫描 图标。
   7. 要保存图像，请在"捕获"控制面板中选择 "现在 "或 "帧结束 "图标。
4. 要导出数据，请右键单击数据列表中的图像或光谱文件名。选择 "导出" ，然后选择要导出的文件格式。将文件保存在所需的计算机文件夹位置。

结果

将PS（（C₈H₈）_n）珠子沉积在干净的Si衬底（图1A）和PVA（（CH₂CHOH）_n）（图1B，C）上。由于磁珠在硅上的附着力较差，因此无法对该样品进行接触模式下的纳米红外成像。取而代之的是，使用nanoIR上样品的光学视图，镀金的AFM探针以接触模式接合在PS微珠的顶部，估计力约为100 nN（图2...

讨论

AFM与nanoIR光谱相结合，可以使用接触模式的悬臂和脉冲可调谐红外光源提供纳米级化学信息。模型系统，例如在聚合物材料的体积中嵌入具有有限尺寸的吸收器，对于提高对图像形成机制的理解和确定工具的性能非常重要。在本文介绍的PS/PVA配置的情况下，进行了优化以获得位于PVA薄膜表面上方或下方的稳定PS珠。结果发现，从旋涂机上取下涂覆的Si基材后立即沉积PS微珠可产生更好的附着力。PVA?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10|0 2200 Golden Taklon Round	Zem
5357-8NM Tweezers	Pelco
Adhesive Tabs	Ted Pella	16079
AFM metal specimen disks	Ted Pella	16208
Binocular	AmScope
Cantilever for nanoIR measurements	AppNano		FORTGG
Cell culture dishes	Greiner bio-one GmbH
Desiccator
Floating optical table	Newport	RS 4000
Hotplate	VWR
Isopropanol
Kimwipes	KIMTECH
Magnetic stir bar
Microparticles based on polystyrene size: 5 µm	SIGMA-ALDRICH	79633
nanoIR2 microscope	Bruker		Contact mode NanoIR2
Nitrogen Tank	Airgas
Petri dishes	Greiner bio-one GmbH
Polyvinyl Alcohol	SIGMA-ALDRICH	363170	this polymer was only 87%-89% hydrolyzed, which explains the presence of residual C=O at 1730 cm-1
Quantum Cascade Laser	Daylight Solutions		1550-1800 cm-1 range
Silicon wafer	MEMC St. Peters	#901319343000
Spin coater	Oscilla