用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物分析 （MAPP）

摘要

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种高通量技术，用于对生物样品中的聚糖进行成分分析。

摘要

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种可靠且可重复的方法，用于系统地确定各种生物样品（包括植物和藻类组织、食品材料以及人类、动物和微生物样品）中聚糖和糖缀合物的组成和相对丰度。微阵列技术通过提供小型化、高通量筛选平台来支持该方法的功效，允许仅使用少量分析物即可同时表征聚糖和高度特异性聚糖定向分子探针之间的数千种相互作用。组成聚糖经过化学和酶促分馏，然后依次从样品中提取并直接固定在硝酸纤维素膜上。聚糖组成是通过将特定的聚糖识别分子探针附着在勒索和打印的分子上来确定的。MAPP是对传统聚糖分析技术的补充，如单糖和连锁分析以及质谱分析。然而，聚糖识别分子探针提供了对聚糖结构构型的见解，这有助于阐明生物相互作用和功能作用。

引言

聚糖在生命的各个领域无处不在，与其他大分子相比，聚糖在结构和功能上表现出无与伦比的^{多样性1。}然而，由于它们的复杂性、生物合成和糖苷键的可变性，以及缺乏解剖聚糖结构的适当方法，我们对这种结构和功能多样性的理解相对有限².

许多聚糖分析技术具有破坏性，需要将聚糖分解成其组成单糖，这可能会掩盖相关的三维和生物学背景³.相反，单克隆抗体 （mAb）、碳水化合物结合模块 （CBM）、凝集素、病毒凝集素和微生物粘附素（统称为聚糖识别分子探针 （GRMP）⁴）可识别并结合特定表位，可用作检测和区分复杂多聚糖基质中聚糖的工具 ^5,6。

在这里，我们介绍了微阵列聚合物分析（MAPP），这是一种快速、通用且无损的聚糖分析方法，适用于广泛的生物样品。该方法旨在提供一种稳健的高通量技术，用于分析来自不同生物和工业/商业系统的聚糖。MAPP 将聚糖定向分子探针的识别特异性与可重复的高性能微阵列筛选技术相结合，允许并行分析数千种分子相互作用。这种方法的结果是对目标样品或组织中聚糖的组成和相对丰度进行诊断。

MAPP 可以作为独立的独立方法使用，也可以与其他生化技术结合使用，例如免疫荧光显微镜 ^7,8,9 和单糖或连锁分析^10,11。该技术还可用于绘制新型GRMP的表位特异性图谱，使用印有纯净且结构明确的寡糖标准品^的阵列12。与其他方法（如酶联免疫吸附测定 （ELISA））相比，MAPP 的一个主要优势是它与小体积样品的兼容性^13,14。此外，MAPP 可显著提高通量分析¹⁵ 并提供有效的样品保存形式，因为打印样品在固定在硝酸纤维素上时干燥且稳定¹⁶。

GRMP的结合通常取决于许多连续糖残基的存在，这些残基共同形成一个结合位点（表位），该位点是特定多糖类（木聚糖、甘露聚糖、木葡聚糖等）所特有的。¹⁷. 相比之下，使用大多数生化技术（例如单糖组成或甲基化分析）量化的单个糖残留物（木糖、甘露糖、葡萄糖）可能是多个多糖类别的成分，因此难以分配¹⁸.

MAPP的开发是为了应对技术差距，即能够使用少量材料快速分析来自各种来源的多种聚糖。MAPP利用了过去三十年中开发和表征的GRMP的广泛库目：12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.MAPP的发展是一个迭代的过程，技术也在不断完善和优化。现在有大量文献描述了MAPP在各种自然和工业系统中的应用，其中聚糖起着^核心作用5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39。在这里，我们描述了MAPP的当前技术水平。

研究方案

图1总结了MAPP方法的主要实验阶段。

1. 样品的制备

注意：在这里，该方法应用于植物组织以用于说明目的。选择的植物是 阿拉比卡咖啡、 Allium sativum var. ophioscorodon和 几个泰国芒果品种（Aokrong、Kam、Rad、Chokanan、Mamkamdang、Talabnak、Mahachanok 和 Nga）。选择这些植物是因为它们具有商业重要性。它们供人类消费的加工会产生目前未充分利用的农工废物，这些废物可能提供增值产品的来源，包括纯聚糖。因此，MAPP被用于表征废弃植物生物质的聚糖组成，用于生物勘探目的。

1. 将植物材料分离成不同的组织（例如，根、茎和叶）。
2. 将植物组织在40°C的热风烘箱中干燥12-24小时（根据样品减少/增加时间）。或者，将样品在液氮中快速冷冻，然后冻干~4天。
3. 使用杵和研钵或机械组织裂解器（见 材料表）将样品均质成细粉，每个管中都有一个滚珠轴承。
   注意：对于新鲜植物组织，建议在均质化前干燥或冻干。通常，对于大多数干燥样品，用研杵和研钵均质就足够了。对于特别有弹性的样品，如谷物、豆类和加工食品（如意大利面），液氮快速冷冻可以提高样品均质化的速度和效率。我们发现，机械均质化几乎与所有样品类型兼容，速度更快，劳动强度更低，并且有效地将重复使用相同设备（即研杵和研钵）导致样品交叉污染的风险降至最低。

2.醇不溶性残留物（AIR）的制备

1. 将 1.5 mL 70% （v/v） 乙醇加入 50-100 mg 风干均质样品材料中。
2. 彻底涡旋混合，然后在室温下以10,000× g 离心10分钟。使用移液管弃去所得上清液并保留沉淀。
3. 向剩余的沉淀中加入 1.5 mL 甲醇和氯仿 （1：1 [v/v]）。涡旋，离心，并按照步骤2.2弃去上清液。
4. 向剩余的沉淀中加入 1.5 mL 100% 丙酮。涡旋，离心，并按照步骤2.2弃去上清液。
5. 将所得颗粒在通风橱中过夜，使残留的丙酮蒸发，或在真空离心机中直至干燥。
   注意： AIR 材料可以在环境温度下储存，直到需要为止。

3. 聚糖提取

注意：如果可能，在组织裂解器中执行所有提取步骤，每个管中都有一个滚珠轴承，以帮助重悬。如果没有组织裂解器，可以通过连续搅拌或摇晃来进行提取。如果无法延长提取时间，则可能需要延长提取时间。

1. 向 10 mg AIR 材料中加入 30 μL/mg 50 mM 环己二胺四乙酸（CDTA;见 材料表），pH 7.5。
2. 以 27 Hz 摇动 2 分钟，然后以 10 Hz 摇动 2 小时。
3. 在4°C下以10,000× g 离心10分钟。 保留所得上清液，将其加入无菌微量离心管中，并将其储存在4°C的旋转振荡器上。
4. 向残留沉淀中加入 30 μL/mg 4 M NaOH + 0.1 % （w/v） NaBH₄。
   注意：NaBH₄ 如果吞咽是有毒的。使用个人防护装备 （PPE）。在通风橱下处理。避免灰尘形成。避免吸入灰尘。请勿让产品与水接触。
5. 重复步骤 3.2 到 3.3。用 dH₂O 洗涤残留的沉淀两到三次以除去残留的 NaOH。
6. 向沉淀中加入30μL / mg纤维素酶（最好是GH5内切-1,4-β-葡聚糖酶，在适当的酶缓冲液中 - 按照制造商的建议;参见 材料表），并在酶最佳温度下孵育16小时。
7. 将样品在4°C下以10,000× g 离心10分钟。保留上清液，转移到干净的微量离心管中，并在4°C下储存在旋转振荡器上。提取后，必须尽快打印样品。
8. 在4°C下再次以10,000× g 离心所有储存的提取物10分钟。
   注意： 样品必须没有颗粒和碎屑。如有必要，在微阵列打印之前通过0.2μm自旋过滤器。特别是粘性样品与微阵列分析不兼容，因为微阵列仪毛细管和打印头很容易堵塞。作为一般规则，用户应该能够使用标准小容量移液器移液所有用于打印的样品。

4. 标准的制定

1. 在无菌dH₂O中制备1mg / mL定义聚糖标准品（表1）的溶液。如果使用pachyman作为标准品，则溶解在4M NaOH中，并在溶解后用冰醋酸中和。
2. 将制备的标准品在4°C下在旋转振荡器上储存过夜，以使其完全溶解。
3. 将所有标准品在4°C下以10,000× g 离心10分钟，以沉淀任何碎片。所得上清液用于后续打印。

5. 微阵列打印

1. 在甘油系统缓冲液（GSB;混合47%甘油，52.9%dH₂O，0.06%Triton X-100和0.04%杀菌剂[0.15%-0.17%硝酸铜和1.4%-2.0%硝酸镁水溶液]中制备1：20（v / v）稀释的黑色印度墨水/绘图墨水，并过滤灭菌）（参见 材料表）并在15,000× g （室温）下离心10分钟。
   注意：需要墨水溶液在打印样品周围创建顶部和底部边框，以便可以在膜上目视检测到打印的微阵列。但是，墨水溶液可能含有沉淀物。所有溶液必须不含颗粒才能打印，因此移液时应避免干扰沉淀物。当不再可能时，请丢弃并重新准备。该溶液不容易过滤以去除颗粒。
2. 向第一个 384 孔板的第一部分加入 40 μL 墨水溶液和 GSB（图 2）。
3. 向所有稀释 1 （D1） 孔中加入 25 μL GSB。向所有稀释的 2、3 和 4 （D2-D4） 孔中加入 40 μL GSB。
4. 通过按顺序向 D1 孔中加入 25 μL 提取的聚糖样品，用 GSB 稀释提取的聚糖样品和确定的聚糖底物 1：1 （v/v）。
5. 从 D1 孔中取出 10 μL 样品并加入 D2 孔中，连续稀释每个样品四次。用移液管轻轻吸出以混合。
6. 重复该过程，从 D2 孔中取出 10 μL 样品并将其添加到 D3 孔中。
7. 对 D4 重复上述步骤。混合后，从 D4 孔中取出 10 μL，使每个孔的最终体积为 40 μL。
8. 将 40 μL 墨水溶液和 GSB 加入最终板的最终块中。
9. 用粘性板盖盖住板，并在3,000× g （室温）下离心10分钟。确保离心后没有气泡残留，必要时重复。
10. 使用非接触式压电微阵列打印机器人，按照以下步骤将样品打印到硝酸纤维素膜上（参见 材料表）。
    注意：以下是为获得最佳打印质量而建议的措施;然而，所需的具体参数最终将取决于所使用的仪器。我们建议用户联系仪器制造商，讨论其设备所需的适当自定义和打印设置。
    1. 打印前，清空废液缓冲液储液槽，并根据需要用干净的 GSB 填充干净的缓冲液储液槽。打开仪器并使其稳定 >10 分钟（如果它具有集成的湿度和温度控制系统）。打开微阵列器并初始化系统。
       注意： 建议运行测试以确定仪器的内部压力。如果压力太低，则可能需要进行高压吹扫。再次，与仪器制造商联系，讨论特定仪器的具体操作。
    2. 用 GSB 吹扫打印头和毛细管数次，以去除碎屑和潜在污染物。通过单独加载 GSB 板或将仪器设置为直接从干净的缓冲液储液槽中打印来执行测试打印运行，绕过从加载的板中抽取样品。
       注意：没有必要使用硝酸纤维素膜进行测试打印;干净的显微镜载玻片就足够了，其优点是在样品打印之前可以目视评估光斑大小、形状和质量。
    3. 打印提取的聚糖样品时，对系统进行编程，使其在每个样品之间用干净的GSB冲洗。
       注：通常，每个打印斑点的样品体积为 100 pL 至 10 nL，斑点尺寸范围为 20 μm 至 100 μm，具体取决于所选的样品体积。从一个来源 384 孔板打印 100 个微阵列芯片大约需要 40 分钟，包括系统冲洗。所得微阵列的大小约为 1 cm² 。额外的板将使阵列的长度增加约1厘米。印刷微阵列芯片设计示意图如 图3所示。一旦打印出来，微阵列就可以立即使用，并且可以储存数年。如果由于印刷过程中样品的潜在蒸发而需要重复打印作业，建议装入新的样品板并丢弃原始板。
    4. 每周一次，彻底清洁打印头和毛细管。为此，在GSB中加载含有1：20稀释度的浓缩NaOH的384孔，并在显微镜载玻片上进行40分钟至1小时的打印运行。在继续操作之前，用户应确保此清洁溶液与他们的仪器兼容。
11. 保存为打印微阵列芯片生成的唯一网格文件（.gal 文件），以备下游分析。

6. 微阵列探测

1. 从硝酸纤维素膜上切下单个相同的打印微阵列，并将它们放入适当大小的容器中进行探测（例如，12孔或24孔微量滴定板）（参见 材料表）。阵列应平放在容器的底部。每个探针需要一个微阵列芯片，代表一个技术重复。
2. 为了减少非特异性结合，在旋转/摇摆振荡器上，将微阵列在MP-TBST封闭缓冲液（1x Tris缓冲盐水，pH 7.5，+ 0.1%[v/v] TWEEN 20 [TBST]并补充有5%[w/v]脱脂奶粉;参见 材料表）中孵育1小时。确保卷足以淹没整个阵列。
3. 孵育后，取出 MP-TBST 并用新体积的 MP-TBST 替换它。
4. 将阵列与单克隆抗体（mAb）或His标记的CBM或其他GRMP（例如凝集素）一起在MP-TBST中孵育2小时，稀释1：10-1：1,000（由制造商指定;参见 材料表）。
5. 孵育后，取出分子探针溶液并用干净的TBST覆盖阵列，确保阵列完全浸没。要去除残留的探针溶液，请立即取出 TBST 并更换新的体积。将阵列放在旋转/摇摆振荡器上 5 分钟。5 分钟后，取出 TBST，更换新的体积，然后放在旋转/摇摆的摇床上 5 分钟。
   注意：此过程应重复三次，不包括最初添加和立即删除 TBST。
6. 将阵列与碱性磷酸酶偶联的二抗（抗小鼠，抗大鼠，抗兔，抗His，视情况而定;参见 材料表）在MP-TBST中1：1,000稀释2小时，在摇摆/旋转振荡器上孵育。
   注：辣根过氧化物酶偶联的二抗也适用，与四甲基联苯胺 （TMB）/过氧化氢底物联合使用以显色。
7. 孵育后，按照步骤6.5重复洗涤程序，以除去非特异性结合的二抗。
8. 在硝基蓝四唑（NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）显色溶液（参见 材料表）中覆盖阵列，用于抗体结合的显色检测。静置直至抗原结合位点出现紫色沉淀斑点（通常为5-30分钟，但应密切监测阵列以避免过饱和，因为反应可能迅速发生）。
   注意：BCIP与皮肤接触时是有害的，可能会引起呼吸道刺激。使用个人防护装备。避免灰尘形成。避免吸入灰尘。
9. 要终止反应，请将阵列浸入干净的自来水中并大量清洗。
10. 将吸墨纸之间的阵列在室温下放置过夜以干燥。
11. 丢弃有明显缺陷的阵列，并在这种情况下重复探测协议（图4）。

7. 分析和量化

1. 使用桌面扫描仪以 2,400 点/英寸 （dpi） 的分辨率扫描开发的阵列。将图像转换为 TIFF 文件，然后转换为底片。
2. 使用微阵列分析软件（参见 材料表），将唯一的 .gal 网格文件叠加到每个微阵列图像上，以计算每个抗原结合位点产生的斑点的颜色强度并减去局部背景。
3. 将格网数据导出为 .txt 文件。然后，可以手动将这些数据导入到 Excel 工作表中进行分析。
4. 首先在每个样品稀释度上平均斑点强度，然后在包含的任何生物重复中平均斑点强度，从而为每个样品生成平均斑点信号强度值。
5. 将值 100 分配给最高平均点信号强度，并相应地对其余数据进行归一化。
   注意：然后，可以使用 Excel³³ 中的条件格式函数或使用 R ggplot2 包^40,41 中的 geom_tile 函数将归一化的平均点信号强度表示为相对聚糖表位丰度的热图。

讨论

这里描述的MAPP技术现在是一种成熟的聚糖分析方法。基本原理于2007年¹¹月首次描述，但该技术经历了不断的发展，以利用微阵列技术、分子探针开发的最新创新以及我们对聚糖生物化学理解的进步。一般来说，聚糖，尤其是多糖，由于其结构复杂性和异质性⁴⁵，以及它们不容易测序或合成的事实，比蛋白质和核苷酸更具分析性¹。在许多情况下，没有一种技术可以最终破译聚糖复杂性;因此，MAPP通常与其他方法一起使用。这就是为什么通常选择AIR制备作为MAPP的起点的原因之一，因为AIR与大多数其他聚糖分析方法^兼容34，便于随后的数据集比较。

由于在空气处理之前对样品进行均质化，一些空间信息总是会丢失。然而，由于多糖依次从样品中释放，因此所获得的馏分中表位的存在提供了有关该样品的分子结构和组成的信息¹⁷。因此，选择合适的提取方案对于该方法的成功至关重要。多个参数决定了提取方法的适用性：细胞结构、时间、温度、pH值、压力、溶剂的离子强度和固体颗粒样品的细度⁴⁹。建议使用一系列更具腐蚀性的溶剂，以最大限度地提高成功提取组成聚糖和构建样品代表性成分图的可能性。对于大多数样品，CDTA、NaOH 和纤维素酶足以去除植物来源的储存和细胞壁多糖 33,50,51,52。对于某些组织样品，还包括 CaCl₂、HCl 和 Na₂CO₃ 的杂交提取方案已被证明是成功的⁵³，而海洋微藻样品可能需要添加乙二胺四乙酸 （EDTA）¹⁰。

微阵列应包括一系列纯净的、明确的聚糖标准品，以用作阳性对照⁵.包含的标准品应根据样品的性质进行修改。打印后，需要选择合适的GRMP。多糖结构的杂交瘤单克隆抗体的产生具有挑战性⁵⁴;聚糖结合抗体难以提高，亲和力低⁵⁵。幸运的是，可以相对容易地获得 CBM 的基因序列信息，用于重组表达⁴ 和工程化它们的结合特异性^56,57。虽然已经开发了一个令人印象深刻的GRMP目录，大多数现在都可以从商业来源获得，但相对于自然界中存在的聚糖结构的多样性，只有一小部分被生产并成功表征^了58。这可能会限制检测和区分某些结构的能力。建议使用一个或两个代表预期存在的每个主要聚糖结构的探针进行初始探测实验，其结合特异性得到了很好的表征。在随后的探测实验中，探针列表可以扩展到更广泛的聚糖，并深入研究精细结构。

虽然很平凡，但确保在每个孵育步骤后彻底清洗微阵列是探测程序成功的基础。无效去除非特异性结合的探针可能会在显色后引起高背景信号，从而掩盖结果。在这种情况下，有必要从新的微阵列开始重复探测过程。此外，应谨慎接触阵列，只能用镊子握住边缘;硝酸纤维素膜易碎，易损坏。显色解决方案会积聚裂缝和折痕，导致过度饱和，从而阻碍阵列分析。

MAPP 快速、适应性强且方便。该方法与来自任何生物或工业系统的动物、微生物或植物聚糖兼容，只要它们可以提取并固定在硝酸纤维素上，并且具有适当的分子探针。生成的数据提供了详细的、半定量的、成分的见解，这是 通过 其他聚糖分析方法无法轻易获得的。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss)	Megazyme	P-LICHN
1,4-β-D-Mannan	Megazyme	P-MANCB
384-well microtiter plate	Greiner Bio-One	M1686
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP)	Melford	B74100-1.0
Acetone	Sigma	270725
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	112-055-003
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag	Jackson ImmunoResearch	300-055-240
Arabinoxylan (wheat)	Megazyme	P-WAXYL
Array-Pro Analyzer Software	Media Cybernetics	Version 6.3
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A)	NZYTech	CZ0564
BAM antibodies	SeaProbes	Various
Black drawing ink (indian ink)	Winsor & Newton	GWD030
Carbohydrate binding modules	NZYTech	Various
CCRC antibodies	CarboSource	Various
CDTA	Sigma	319945
Chloroform	Sigma	PHR1552
Ethanol	Sigma	1.11727
Galactan (potato)	Megazyme	P-GALPOT
Galactomannan (carob)	Megazyme	P-GALML
Glycerol solution	Sigma	49781-5L
Gum tragacanth (legumes)	Sigma-Aldrich	G1128
INCh antibodies	INRA	Various
LM and JIM antibodies	PlantProbes	Various
Marathon Argus Microarray Printer	ArrayJet
Methanol	Sigma	34860
Monoclonal antibodies	Biosupplies Australia	Various
NaBH4	Sigma	452882
NaOH	Sigma	S5881
Nitro-blue tetrazolium (NBT)	Melford	N66000-1.0
Nitrocellulose membrane	Thermo Fisher Scientific	88018
Pectin (degree of methyl esterification 46%)	Danisco	NA
ProClin 200	Sigma	48171-U
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre)	Megazyme	P-RHAGN
Rotating mixer	Fisher Scientific	88-861-050
Rotating/rocking Shaker	Cole-Parmer
Skimmed milk powder	Marvel
Spin filter	Costar Spin-X	8160
Stainless steel beads	Qiagen	69989
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris	Sigma	93362
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML
Tween 20	Sigma	P9416-100ML
Xylan (beechwood)	Megazyme	P-XYLNBE
Xyloglucan (tamarind)	Megazyme	P-XYGLN
β-Glucan (oat)	Megazyme	P-BGOM