从骨髓来源的巨噬细胞中鉴定小细胞外囊泡的肽

摘要

该协议描述了通过差异超速离心从巨噬细胞中分离小细胞外囊泡并提取肽圆顶以进行质谱鉴定的程序。

摘要

小细胞外囊泡 （sEV） 通常由多泡体 （MVB） 的胞吐作用分泌。这些直径为<200nm的纳米囊泡存在于各种体液中。这些 sEV 通过其货物（如蛋白质、DNA、RNA 和代谢物）调节各种生物过程，例如基因转录和翻译、细胞增殖和存活、免疫和炎症。目前，已经开发了各种用于sEV分离的技术。其中，基于超速离心的方法被认为是金标准，广泛用于sEV分离。肽是天然生物大分子，长度少于50个氨基酸。这些肽参与具有生物活性的各种生物过程，如激素、神经递质和细胞生长因子。肽球用于通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统分析特定生物样品中的内源性肽。在这里，我们介绍了一种通过差示超速离心分离sEV的方案，并提取了肽球用于LC-MS / MS鉴定。该方法从骨髓来源的巨噬细胞中鉴定了数百种sEVs衍生的肽。

引言

直径小于 200 nm 的小细胞外囊泡 （sEV） 存在于几乎所有类型的体液中，并由各种细胞分泌，包括尿液、汗液、泪液、脑脊液和羊水¹.最初，sEV被认为是处理细胞废物的容器，这导致^{随后十年的研究}很少2。最近，越来越多的证据表明，sEV含有特定的蛋白质、脂质、核酸和其他代谢物。这些分子被转运到靶细胞³，有助于细胞间通讯，通过这些细胞参与各种生物过程，如组织修复、血管生成、免疫⁴和炎症^5,6、肿瘤发育和转移7,8,9等。

为了促进sEV的研究，必须从复杂样品中分离sEV。根据sEV的物理和化学性质，如密度、粒径和表面标记蛋白，已经开发了不同的sEV分离方法。这些技术包括基于超速离心的方法、基于粒径的方法、基于免疫亲和捕获的方法、基于sEVs沉淀的方法和基于微流体的方法^{10,11,12<....}

研究方案

1. 小细胞外囊泡的分离

注意：在4°C下执行步骤1.1-1.11中的所有离心。

1. 制备不含sEVs的胎牛血清（FBS）：通过超速离心机（见材料表）在4°C下以110,000 ×g离心FBS过夜以除去内源性sEV。收集上清液，用0.2μm超滤膜过滤灭菌，并在-20°C下储存。
2. 在150mm培养皿上平板约3 x 10⁷ 永生化骨髓来源巨噬细胞（iBMDM），并加入20 mL DMEM培养基（见 材料表）。
3. 在收集 sEV 之前，请丢弃培养基。用PBS（磷酸盐缓冲盐水; 目录）并用含有10%不含sEVs的FBS的培养基代替。
4. 根据实验需要，收集细胞上清液并将其转移到50 mL离心管中。
5. 将细胞上清液以300× g 离心10分钟以除去细胞，弃去沉淀，并将上清液转移到新的50mL离心管中。
6. 将上清液以2000 ×g 离心10分钟以除去死细胞，弃去沉淀，并将上清液转移到新的高速离心管中（见 材料表）。
7. 通过高速离心机将上清液以10,000× g 离心30分钟以除去细胞碎片和微泡，弃去沉淀，并....

讨论

在研究sEV的功能时，必须从复杂的生物样品中获得高纯度的sEV，以避免任何潜在的污染。已经开发了多种sEV分离方法¹³，在这些方法中，基于差示超速离心的方法显示出相对较高的sEV纯度。本研究收集200 mL细胞上清液6 h，差示超速离心获得约200-300 μgsEV。但是，应该注意的是，在超速离心过程中，sEVs沉淀可能不可见（步骤1.8）。因此，建议尽可能多地移液管底部。这一步至关重?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Centrifugal filter tube	Millipore	UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene	Beckman Coulter	357003	High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM culture medium	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide	Sigma	l1149	5 g
Microfuge tube polypropylene	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge
nano-high-performance LC system	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Phosphate-buffered saline	Solarbio	P1020
Polyallomer centrifuge tubes	Beckman Coulter	326823	Ultracentrifuge
Protease inhibitor	Bimake	B14002
SpeedVac vacuum concentrator	Eppendorf	Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853