Identification de peptides de petites vésicules extracellulaires à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Résumé

Ce protocole décrit une procédure permettant d’isoler de petites vésicules extracellulaires des macrophages par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par spectrométrie de masse.

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont généralement sécrétées par l’exocytose des corps multivésiculaires (MVB). Ces nanovésicules d’un diamètre de <200 nm sont présentes dans divers fluides corporels. Ces sEV régulent divers processus biologiques tels que la transcription et la traduction des gènes, la prolifération et la survie des cellules, l’immunité et l’inflammation par le biais de leurs cargaisons, telles que les protéines, l’ADN, l’ARN et les métabolites. À l’heure actuelle, diverses techniques ont été mises au point pour l’isolation des sEV. Parmi eux, la méthode basée sur l’ultracentrifugation est considérée comme l’étalon-or et est largement utilisée pour l’isolation des sEV. Les peptides sont naturellement des biomacromolécules de moins de 50 acides aminés de longueur. Ces peptides participent à une variété de processus biologiques ayant une activité biologique, tels que les hormones, les neurotransmetteurs et les facteurs de croissance cellulaire. Le peptidome est destiné à l’analyse systématique des peptides endogènes dans des échantillons biologiques spécifiques par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Ici, nous avons introduit un protocole permettant d’isoler les sEVs par ultracentrifugation différentielle et d’extraire le peptidome pour l’identification par LC-MS/MS. Cette méthode a permis d’identifier des centaines de peptides dérivés de sEVs à partir de macrophages dérivés de la moelle osseuse.

Introduction

De petites vésicules extracellulaires (sEV) d’un diamètre inférieur à 200 nm sont présentes dans presque tous les types de fluides corporels et sécrétées par toutes sortes de cellules, y compris l’urine, la sueur, les larmes, le liquide céphalo-rachidien et le liquide amniotique¹. Initialement, les sEV étaient considérés comme des réceptacles pour l’élimination des déchets cellulaires, ce qui a conduit à un minimum de recherches au cours de la décennie suivante². Récemment, de plus en plus de preuves indiquent que les sEV contiennent des protéines, des lipides, des acides nucléiques et d’autres métabolites spécifiques. C....

Protocole

1. Isolement de petites vésicules extracellulaires

REMARQUE : Effectuez toute la centrifugation aux étapes 1.1 à 1.11 à 4 °C.

1. Préparation du sérum de veau fœtal exempt de sEV : Centrifuger le FBS pendant la nuit à 110 000 × g à 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse (voir tableau des matériaux) pour éliminer les sEV endogènes. Recueillir le surnageant, le filtrer, le stériliser avec une membrane d’ultrafiltration de 0,2 μm et le stocker à -20 °C.
2. Plaquer environ 3 x 10⁷ macrophages immorcelés dérivés de la moelle osseuse (iBMDM) sur une boîte de culture de 150 mm et a....

Discussion

Lors de l’étude de la fonction des sEV, il est impératif d’obtenir des sEV de haute pureté à partir d’échantillons biologiques complexes afin d’éviter toute contamination potentielle. Diverses méthodes d’isolement des sEVs ont été mises au point¹³ et, parmi ces méthodes, les méthodes basées sur l’ultracentrifugation différentielle ont montré une pureté relativement élevée des sEV. Dans cette étude, 200 mL de surnageant cellulaire ont été prélevés pendant 6 h, et e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Centrifugal filter tube	Millipore	UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene	Beckman Coulter	357003	High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM culture medium	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide	Sigma	l1149	5 g
Microfuge tube polypropylene	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge
nano-high-performance LC system	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Phosphate-buffered saline	Solarbio	P1020
Polyallomer centrifuge tubes	Beckman Coulter	326823	Ultracentrifuge
Protease inhibitor	Bimake	B14002
SpeedVac vacuum concentrator	Eppendorf	Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853