Identifizierung von Peptiden kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen aus dem Knochenmark

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Makrophagen durch differentielle Ultrazentrifugation und Extraktion des Peptidoms zur Identifizierung mittels Massenspektrometrie.

Zusammenfassung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) werden typischerweise durch die Exozytose von multivesikulären Körpern (MVBs) sezerniert. Diese Nanovesikel mit einem Durchmesser von <200 nm sind in verschiedenen Körperflüssigkeiten vorhanden. Diese sEVs regulieren verschiedene biologische Prozesse wie Gentranskription und -translation, Zellproliferation und -überleben, Immunität und Entzündung durch ihre Ladungen wie Proteine, DNA, RNA und Metaboliten. Derzeit wurden verschiedene Techniken zur Isolierung von Elektrofahrzeugen entwickelt. Unter ihnen gilt die auf Ultrazentrifugation basierende Methode als Goldstandard und wird häufig für die Isolierung von Elektrofahrzeugen eingesetzt. Bei den Peptiden handelt es sich um natürliche Biomakromoleküle mit einer Länge von weniger als 50 Aminosäuren. Diese Peptide sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse mit biologischer Aktivität beteiligt, wie z. B. Hormone, Neurotransmitter und Zellwachstumsfaktoren. Das Peptidom soll körpereigene Peptide in spezifischen biologischen Proben mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) systematisch analysieren. Hier haben wir ein Protokoll zur Isolierung von sEVs durch differentielle Ultrazentrifugation und extrahiertes Peptidom zur Identifizierung mittels LC-MS/MS eingeführt. Diese Methode identifizierte Hunderte von sEVs-abgeleiteten Peptiden aus aus dem Knochenmark stammenden Makrophagen.

Einleitung

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) mit einem Durchmesser von weniger als 200 nm sind in fast allen Arten von Körperflüssigkeiten vorhanden und werden von allen Arten von Zellen sezerniert, einschließlich Urin, Schweiß, Tränen, Liquor cerebrospinalis und Fruchtwasser¹. Ursprünglich wurden sEVs als Behälter für die Entsorgung von zellulärem Abfall in Betracht gezogen, was im folgenden Jahrzehnt zu minimaler Forschung führte². In jüngster Zeit gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass sEVs spezifische Proteine, Lipide, Nukleinsäuren und andere Metaboliten enthalten. Diese Moleküle werden zu den Zielzellen^....

Protokoll

1. Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel

HINWEIS: Alle Zentrifugationen in den Schritten 1.1-1.11 bei 4 °C durchführen.

1. Herstellung von sEVs-freiem fetalem Kälberserum (FBS): FBS über Nacht bei 110.000 × g bei 4 °C durch eine Ultrazentrifuge zentrifugieren (siehe Materialtabelle), um endogene sEVs zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand, filtern Sie ihn mit einer 0,2 μm Ultrafiltrationsmembran und lagern Sie ihn bei -20 °C.
2. Etwa 3 x 10⁷ immortalisierte Makrophagen aus dem Knochenmark (iBMDMs) auf eine 150-mm-Kulturschale geben und 20 ml DMEM-Nährmedium hinzufügen....

Diskussion

Bei der Untersuchung der Funktion von sEVs ist es unerlässlich, hochreine sEVs aus komplexen biologischen Proben zu gewinnen, um mögliche Kontaminationen zu vermeiden. Es wurde eine Vielzahl von Methoden zur Isolierung von sEVs entwickelt¹³, und unter diesen Methoden haben auf differentieller Ultrazentrifugation basierende Methoden eine relativ hohe Reinheit von sEVs gezeigt. In dieser Studie wurden 200 ml Zellüberstand für 6 h gesammelt und etwa 200-300 μg sEVs wurden durch differentielle Ul.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BCA Protein Assay Kit	Beyotime Technology	P0012
CD9	Beyotime Technology	AF1192
Centrifugal filter tube	Millipore	UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene	Beckman Coulter	357003	High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate	Thermo Fisher Scientific	34580
Dithiothreitol	Solarbio	D8220	100 g
DMEM culture medium	Cell World	N?A
GRP94	Cell Signaling Technology	20292
High-speed centrifuge	Beckman Coulter	Avanti JXN-26	Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)	National Institute of Biological Sciences, China		Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide	Sigma	l1149	5 g
Microfuge tube polypropylene	Beckman Coulter	357448	1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge
nano-high-performance LC system	Thermo Fisher Scientific	EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis	Malvern Panalytical	NanoSight LM10	NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Phosphate-buffered saline	Solarbio	P1020
Polyallomer centrifuge tubes	Beckman Coulter	326823	Ultracentrifuge
Protease inhibitor	Bimake	B14002
SpeedVac vacuum concentrator	Eppendorf	Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima MAX-XP	Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650B
TSG101	Sigma	AF8258
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XPN-100	Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor	Scientz	SCIENTZ-IID
Western Blot imager	Bio-Rad	ChemiDocXRs	Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin	Sigma	A3853